陳蓓麗 王凱娟 丁方方 丁 丁 鄒慧娟 紀冬梅 章志國

理想的胚胎凍融技術(shù)是人類生育力保存以及提高體外受精-胚胎移植周期累積妊娠率的保障，簡潔、快速、高效玻璃化凍融技術(shù)目前已在全世界范圍內(nèi)廣泛開展。選擇最合適的玻璃化冷凍與解凍液是實現(xiàn)高效胚胎凍融、保障患者成功妊娠的重要前提條件。Vitrification Media解凍液是目前臨床最常用的胚胎玻璃化解凍液，其胚胎復(fù)蘇后存活率高，復(fù)蘇移植臨床妊娠率穩(wěn)定[1]。RapidWarm Blast解凍液是國外近年新研發(fā)的一種胚胎玻璃化解凍液，主要用于復(fù)蘇玻璃化冷凍的囊胚(體外培養(yǎng)發(fā)育至第5天或第6天的胚胎)，目前國內(nèi)中心應(yīng)用較少，且其復(fù)蘇效果相關(guān)研究報道少見。本文通過比較Vitrification Media與RapidWarm Blast玻璃化解凍液的囊胚復(fù)蘇效果及臨床妊娠結(jié)局，評估RapidWarm Blast玻璃化解凍液的臨床效果，為囊胚復(fù)蘇過程中解凍液的選擇和使用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年12月至2019年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心行首次囊胚解凍移植的655例患者臨床資料，根據(jù)使用囊胚解凍液的不同分為A組(357例)、B組(298例)，A組使用Vitrification Media解凍試劑盒(KITAZATO，Japan)進行囊胚復(fù)蘇，B組使用RapidWarm Blast解凍試劑盒(Vitrolife，Sweden)進行囊胚復(fù)蘇。納入標準：符合《不孕癥診斷指南》[2]：未采取避孕措施，有規(guī)律性生活至少12個月未能獲得臨床妊娠的患者夫婦；納入本研究的所有不孕癥患者皆在新鮮取卵周期通過全囊胚培養(yǎng)方式獲得囊胚，同時使用KITAZATO玻璃化冷凍液行全胚胎冷凍；納入本研究的周期均為首次囊胚解凍移植周期。排除標準：卵裂期胚胎(即體外培養(yǎng)發(fā)育至第3天的胚胎)解凍移植周期及再次胚胎解凍移植周期均不納入本研究范圍。兩組患者年齡、移植囊胚數(shù)、不孕類型、內(nèi)膜方案、移植胚胎數(shù)目等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 囊胚玻璃化冷凍 采用Vitrification Media冷凍試劑盒(KITAZATO，Japan)，冷凍前室溫下復(fù)溫1小時。取四孔皿，標記患者姓名，加入平衡液和冷凍液各400 μL。凍前將擴張囊胚行激光打孔預(yù)處理，待囊胚皺縮后盡快行玻璃化冷凍：將皺縮囊胚移入平衡液，室溫放置5 min；然后再將囊胚轉(zhuǎn)移至玻璃化冷凍液中來回吹吸，1 min內(nèi)裝管。裝載后的載桿迅速投入液氮，同時在液氮液面以下套上載桿外套管，置液氮罐長期保存。

1.2.2 囊胚復(fù)蘇 囊胚復(fù)蘇前準備:拉制適合囊胚大小口徑的巴斯德移液管,調(diào)整計時器,預(yù)先從液氮罐中找出需要解凍的胚胎，置于盛有液氮的小容器內(nèi)，靠近體式顯微鏡放置；根據(jù)不同解凍試劑盒要求，加液同時進行預(yù)熱：A組Vitrification Media解凍試劑盒包含TS、DS、WS1、WS2四種液，向Falcon 353037皿中加入TS液500 μL，37℃預(yù)熱，余下三種液依次添加至Thermo 14444四孔皿中，各500 μL，室溫使用；B組RapidWarm Blast解凍試劑盒包含Warm 1TMBlast、Warm 2TMBlast、Warm 3TMBlast三種液，向Falcon 353037皿中加入Warm 1TMBlast液500 μL，余下兩種液依次添加至Thermo 14444四孔皿中各500 μL，所有液均置于37℃預(yù)熱待用。

囊胚復(fù)蘇過程:A組，用鑷子將裝有囊胚的冷凍載桿在液氮下脫去套管，并立即從液氮中取出，將載桿前端全部浸入37℃預(yù)熱的TS液中。反復(fù)洗滌后，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)移至DS液中，讓其自液體表面自然下落，停留3 min，再依次轉(zhuǎn)入WS1、WS2液中，分別停留5 min，最后移入囊胚培養(yǎng)液中(COOK，Australia)。B組：復(fù)蘇后立即將囊胚轉(zhuǎn)移到Warm 1TMBlast液中，使囊胚從冷凍載體掉落并沉入到溶液底部，停留2 min；再依次轉(zhuǎn)入Warm 2TMBlast、Warm 3TMBlast液中，分別停留3、5 min，最后移入囊胚培養(yǎng)液中。在不同濃度的解凍液轉(zhuǎn)移過程中要注意盡量少的帶入上一步液，同時可用下一步液清洗巴斯德移液管2～3次，以減少上一步液的影響。復(fù)蘇囊胚行激光輔助孵化后，置于37℃ COOK桌面培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后進行移植。

1.2.3 妊娠結(jié)局判定 囊胚移植后第14天，檢測患者血或尿人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG)，當(dāng)血HCG>5 IU/L或尿HCG陽性判定為生化妊娠；陽性者移植后第30天行陰道超聲檢查，B超下見到孕囊及原始心管搏動為臨床妊娠。種植率為著床胚胎數(shù)占移植胚胎總數(shù)的百分比。

1.3 觀察指標 比較兩組囊胚復(fù)蘇后整體存活率、解凍2 h后重擴張率、孵化率、囊胚種植率及臨床妊娠率；同時比較兩種解凍液對囊胚不同發(fā)育階段(第5天、第6天)的重擴張率、孵化率及臨床妊娠率的影響。

2 結(jié)果

2.1 兩組囊胚復(fù)蘇后的重擴張率及孵化率比較 兩組囊胚復(fù)蘇后的存活率、2 h重擴張率、2 h孵化率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組囊胚復(fù)蘇后的重擴張率與孵化率比較[個(%)]

2.2 兩組發(fā)育第5天、第6天囊胚復(fù)蘇后的重擴張率與孵化率比較 B組第6天囊胚復(fù)蘇后的重擴張率與孵化率均高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組第5天囊胚復(fù)蘇情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組第5天囊胚擴張率及孵化率均高于第6天的囊胚，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組發(fā)育第5、6天囊胚復(fù)蘇后的重擴張率與孵化率比較[個(%)]

2.3 兩組患者臨床妊娠結(jié)局比較 B組解凍后的囊胚種植率高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組移植第5天復(fù)蘇囊胚的臨床妊娠率均高于第6天的復(fù)蘇囊胚，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B組移植第6天復(fù)蘇囊胚的臨床妊娠率高于A組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 兩組患者臨床妊娠結(jié)局比較(%)

3 討論

胚胎冷凍保存是輔助生殖技術(shù)治療不孕癥的重要手段之一。自1998年Mukaida等[3]首次采用玻璃化技術(shù)凍存人類胚胎并復(fù)蘇移植獲得成功后，目前已形成了商品化統(tǒng)一規(guī)格的玻璃化冷凍及解凍試劑盒，Vitrification Media玻璃化解凍液因其胚胎復(fù)蘇后存活率高，復(fù)蘇移植臨床妊娠率穩(wěn)定，而在臨床廣泛應(yīng)用[1]。RapidWarm Blast玻璃化解凍液是國外新近研發(fā)的一種囊胚解凍液，其中冷凍保護劑的配比及復(fù)蘇步驟與Vitrification Media有所不同，其對囊胚復(fù)蘇效果的評估鮮有報道。本文回顧性分析在本中心進行首次囊胚復(fù)蘇移植患者的臨床資料，以評估RapidWarm Blast玻璃化解凍液對囊胚的復(fù)蘇效果，為臨床上囊胚玻璃化解凍液的選擇和使用提供一定參考。

本研究結(jié)果顯示，兩組囊胚解凍后的存活率，復(fù)蘇2 h后的囊胚重擴張率及孵化率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明RapidWarm Blast解凍液對囊胚的復(fù)蘇效果與Vitrification Media解凍液相似。囊胚復(fù)蘇后1～2 h使用顯微鏡觀察囊胚形態(tài)，通過細胞的折光性、透明帶的完整性以判斷囊胚的存活狀況。囊胚擴張與孵出后才能更好的粘附侵入子宮內(nèi)膜，因此囊胚腔的擴張與孵化狀態(tài)是衡量囊胚活力，影響胚胎著床率及臨床妊娠率的重要因素[4-6]。本研究結(jié)果顯示兩種解凍液對囊胚復(fù)蘇效果相同，均能保證囊胚從低溫狀態(tài)中高效安全的復(fù)蘇并具備較好的后續(xù)發(fā)育潛能。

本研究還比較了兩種解凍液對不同發(fā)育階段囊胚的復(fù)蘇效果，發(fā)現(xiàn)兩組發(fā)育第5天囊胚的復(fù)蘇效果均明顯優(yōu)于發(fā)育第6天的囊胚(P<0.05)；兩種解凍液之間對發(fā)育第5天囊胚的復(fù)蘇效果差異不顯著，但RapidWarm Blast解凍液在復(fù)蘇發(fā)育第6天的囊胚時，較Vitrification Media解凍液表現(xiàn)出一定優(yōu)勢，B組囊胚擴張率及孵化率均高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩種解凍試劑盒的解凍原理是一致的，主要的區(qū)別在于冷凍保護劑的配制比例和復(fù)蘇時對操作溫度的要求不同。有研究[7]表明玻璃化后胚胎的存活能力嚴格取決于細胞脫水的程度和復(fù)蘇時升溫的速率，而并非取決于所用冷凍保護劑的類型和濃度。Jin等[7]研究顯示，僅使用非滲透性冷凍保護劑和相對較慢的冷卻速度，但在復(fù)蘇過程中使用超快速升溫獲得了小鼠卵母細胞和胚胎的高冷凍存活率。本研究中RapidWarm Blast解凍液復(fù)蘇囊胚的所有操作均在37℃熱臺完成，而Vitrification Media解凍液組僅第一步平衡時置于37℃下操作，其余步驟均于室內(nèi)常溫下完成。維持較快而穩(wěn)定的升溫速度可以幫助胚胎很快通過-120℃到-35℃的危險階段，從而避免重結(jié)晶對囊胚的損傷而影響后續(xù)的發(fā)育能力[8-9]，這可能是RapidWarm Blast解凍液在復(fù)蘇第6天囊胚表現(xiàn)出優(yōu)勢的本質(zhì)原因。

本研究還顯示，移植發(fā)育第5天復(fù)蘇囊胚較第6天囊胚臨床妊娠率高，這個結(jié)論與大部分研究[10-12]結(jié)果一致。對臨床資料的系統(tǒng)評價和薈萃分析[11]顯示，在新鮮和冷凍復(fù)蘇移植周期中，發(fā)育第5天囊胚移植的臨床妊娠率和活產(chǎn)率值均高于第6天囊胚。何麗娟等[13]發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育天數(shù)影響凍融胚胎移植成功率，胚胎發(fā)育至第5天囊胚更有利于胚胎著床，提高臨床妊娠率，降低流產(chǎn)以及異位妊娠發(fā)生率。第6天囊胚發(fā)育慢于第5天囊胚，其在體外培養(yǎng)時間長，發(fā)育過程中DNA等遺傳物質(zhì)損失多，冷凍過程中抗凍能力差，復(fù)蘇后囊胚質(zhì)量及發(fā)育潛能容易受到損傷，因此導(dǎo)致移植第6天復(fù)蘇囊胚臨床妊娠率低于第5天囊胚[11]。本研究對復(fù)蘇后的囊胚未進行具體分級，因此無法排除囊胚本身質(zhì)量的影響，需要進行大樣本的隨機對照研究進一步驗證本結(jié)果。

綜上所述，新型RapidWarm Blast玻璃化解凍液用于囊胚復(fù)蘇可獲得與傳統(tǒng)的Vitrification Media相似的胚胎發(fā)育與臨床妊娠結(jié)局，但RapidWarm Blast對發(fā)育第6天囊胚的復(fù)蘇效果更好，胚胎種植率更高，行發(fā)育第6天囊胚解凍移植時可考慮使用。