鮑慶晗++趙一欣++明玥彤++楊博文

摘要：以百合品種Pollyanna、Eleganza和Renoir為試材，研究了玻璃化試管苗發(fā)生特征、影響因素及預(yù)防措施。結(jié)果表明：芽增殖期與壯苗期為百合試管苗發(fā)生的主要時(shí)期；玻璃化苗干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和葉綠素的含量顯著低于正常試管苗；玻璃化苗ZR含量偏低，而ABA含量與乙烯釋放量顯著高于正常試管苗。在誘芽、壯苗和生根階段分別采用以下培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，MS+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，1/2MS+0.2 mg/L NAA，其中瓊脂與蔗糖添加量分別為8.0、50 g/L，百合玻璃化苗比例可控制在5%以下。本研究結(jié)果為百合試管苗的高效生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：百合；試管苗；玻璃化；激素；生理生化指標(biāo)；蔗糖

中圖分類號： S682.2+65.04+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0104-03

收稿日期：2015-10-15

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31370683）。

作者簡介：鮑慶晗（1982—），男，吉林四平人，碩士，助理研究員，主要從事植物學(xué)方面的研究。E-mail：315211139@qq.com。

百合（Lilium brownii）屬百合科百合屬多年生草本球根植物，具有較高的觀賞價(jià)值，同時(shí)兼有食用和藥用的功效，深受人們喜愛。傳統(tǒng)上，百合可通過珠芽、小子球和鱗片等進(jìn)行繁殖。由于組織培養(yǎng)技術(shù)具有節(jié)省時(shí)間、空間、無病蟲害、快速高效等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為了百合繁殖的主要手段之一[1]。試管苗玻璃化是組織培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的一種導(dǎo)致繁殖效率下降的現(xiàn)象，表現(xiàn)為組培苗的組織呈半透明狀，外觀異常，更重要的是玻璃化苗生理功能不健全，多難以移栽成活[2]。百合組織培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)試管苗玻璃化現(xiàn)象，導(dǎo)致試管苗生產(chǎn)效率明顯降低[3]。本研究通過確定百合試管苗發(fā)生的時(shí)期、正常苗與玻璃化苗激素含量差異，在此基礎(chǔ)上，研究了植物激素濃度與配比、瓊脂與糖含量對玻璃化苗產(chǎn)生的影響，以期為百合試管苗的高效生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

以3個(gè)百合品種Pollyanna、Eleganza和Renoir的球莖為組織培養(yǎng)的材料，以上材料均購自浙江虹越花卉股份有限公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基種類對初代培養(yǎng)分化及試管苗玻璃化的影響

將3個(gè)品種的球莖置4 ℃冰箱放置1個(gè)月左右以確保完成休眠。取其球莖，分離并挑選無損傷、無病蟲危害的中部鱗片，洗凈晾干。接種前，將鱗片置于70%乙醇中浸泡30 s、01%的HgCl2中浸泡10 min后，轉(zhuǎn)無菌水浸泡3次以去除殘余乙醇和HgCl2。無菌濾紙吸干材料表面水分，將材料切分為 1.0 cm×0.5 cm的小塊，表面用解剖刀刻傷，接種入初代培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待分化叢芽后，將生長正常的叢芽轉(zhuǎn)入芽增殖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選擇生長正常的叢芽依次轉(zhuǎn)入壯苗與生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。前3種培養(yǎng)的培養(yǎng)基均為MS，生根培養(yǎng)基為1/2 MS。其中，初代誘芽期培養(yǎng)基和芽增殖期的培養(yǎng)基的激素配比為0.75 mg/L 6-BA+0.75 mg/L NAA，壯苗培養(yǎng)基的激素配比為0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，生根期的培養(yǎng)基的激素配比為0.2 mg/L NAA，培養(yǎng)30 d左右統(tǒng)計(jì)試管苗玻璃化的比例。以上培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0，瓊脂 7.0 g/L，蔗糖20 g/L，組培瓶為240 mL透氣覆膜組培瓶，在1.2 kg/cm2 壓力下滅菌20 min。接種后置于25 ℃、光照度 1 500 lx、每天光照12 h的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2百合正常試管苗與玻璃化苗若干生理生化指標(biāo)的比較

比較了百合正常試管苗與玻璃化苗的含水量、干物質(zhì)含量、蛋白質(zhì)含量和葉綠素含量。把稱過鮮質(zhì)量的組培苗裝入紙袋中，放入烘箱內(nèi)，100～105 ℃殺青10 min，80 ℃左右烘至恒質(zhì)量，放入干燥器中冷卻至室溫，計(jì)算含水量與干物質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量的測定用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[4]，葉綠素含量采用分光光度法測定[5]。

1.2.3植物內(nèi)源激素含量測定

IAA、ZR和ABA的測定采用中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的植物酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測定[6]，具體操作見說明書，乙烯的測定采用氣相色譜法[7]。

1.2.4激素濃度配比對試管苗生長、增殖及玻璃化的影響

以百合品種Pollyanna為材料。6-BA設(shè)置0.2、0.5、0.7、1.0 mg/L 共計(jì)4個(gè)濃度梯度，NAA設(shè)置0.5、1.0、2.0 mg/L共3個(gè)梯度，合計(jì)12個(gè)處理，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，瓊脂、蔗糖、光照度、pH值、組培瓶等條件如前所述。培養(yǎng)約30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)試管苗高、單個(gè)外植體出芽數(shù)、玻璃化芽苗比例，有效增殖倍數(shù)采用以下公式進(jìn)行計(jì)算：有效增殖倍數(shù)=單個(gè)外植體出芽數(shù)×（1-玻璃化芽苗百分比）。

1.2.5蔗糖與瓊脂濃度對試管苗生長及玻璃化的影響

以百合品種Pollyanna為材料。瓊脂設(shè)置7.0、8.0、9.0 g/L 3個(gè)濃度梯度，蔗糖設(shè)置30、40、50 g/L 3個(gè)濃度梯度，共計(jì)9個(gè)處理。芽苗為百合品種Pollyanna，芽高大于2cm，培養(yǎng)基為 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，其他培養(yǎng)條件如前所述。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

以上試驗(yàn)重復(fù)3次。玻璃化試管苗統(tǒng)計(jì)及生長指標(biāo)調(diào)查研究中，每次重復(fù)5瓶以上，每瓶接種外植體5～8個(gè)，試驗(yàn)結(jié)果為5次重復(fù)的平均值。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS 8.2的GLM過程進(jìn)行數(shù)據(jù)的鄧肯氏新復(fù)極差顯著性分析，百分率數(shù)據(jù)經(jīng)過反正弦轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行運(yùn)算。

2結(jié)果與分析

2.1百合組培過程不同階段試管苗發(fā)生比例及其成活率

為確定百合試管苗玻璃化發(fā)生的時(shí)期，將百合的組織培養(yǎng)過程分為初代誘芽期、芽增殖期、壯苗期和生根期4個(gè)階段。結(jié)果表明，對于Pollyanna等3個(gè)百合品種而言，初代培養(yǎng)過程中，約30%左右的鱗片形成愈傷組織（圖1-A），約60%左右的外植體直接分化成芽（圖1-B）。與正常芽苗相比（圖1-C），玻璃化苗呈深綠色，葉片肥厚，含水量較高（圖1-D）。誘芽期與生根期玻璃化苗發(fā)生比例均較低，且無顯著差異（P>0.05），芽增殖期與壯苗期玻璃化苗發(fā)生比例顯著高于上述2個(gè)時(shí)期（P<0.05）。其中，芽增殖期玻璃化苗發(fā)生比例顯著高于壯苗期（P<0.05）（圖1-E，表1）。可見，芽增殖期與壯苗期是百合試管苗玻璃化發(fā)生的主要時(shí)期，其中，芽增殖期的試管苗玻璃化又遠(yuǎn)高于壯苗期。

2.2百合正常試管苗與玻璃化苗若干生理生化指標(biāo)的比較

比較了百合正常試管苗與玻璃化苗的含水量、干物質(zhì)含量、蛋白質(zhì)含量和葉綠素含量，結(jié)果如表2所示。3個(gè)百合品種的玻璃化苗含水量均高于正常試管苗，其中，百合品種 Pollyanna 的玻璃化苗含水量顯著高于正常試管苗（P<0.05），百合品種Eleganza和Renoir玻璃化苗與正常試管苗相比無顯著差異（P>0.05）。從干物質(zhì)含量、蛋白質(zhì)含量和葉綠素a+b含量來看，3個(gè)百合品種玻璃化苗的干物質(zhì)含量、蛋白質(zhì)含量和葉綠素a+b含量均顯著低于正常試管苗（P<0.05）。

2.3正常與玻璃化試管苗內(nèi)源激素含量的差異

比較了3個(gè)百合品種正常試管苗與玻璃化苗生長素（IAA）、玉米素核苷（ZR）、乙烯（ETH）和脫落酸（ABA）含量的差異，結(jié)果如表3所示。同一品種相比較，3個(gè)百合品種的玻璃化苗IAA含量與正常試管苗較為接近，差異均未達(dá)到顯著水平（P>0.05）。3個(gè)百合品種玻璃化苗ZR含量顯著高于正常試管苗（P<0.05），而乙烯釋放量（ETH）及ABA含量均顯著高于正常試管苗（P<0.05）。

2.4激素濃度配比對試管苗生長、增殖及玻璃化的影響

在芽增殖期，不同6-BA與NAA配比對試管苗生長、增殖及玻璃化均有不同程度的影響（表4）。相同6-BA濃度條件下，試管苗的高度隨著NAA濃度的升高有一定程度的上升。從單個(gè)外植出芽數(shù)來看，隨著6-BA濃度上升，單個(gè)外植體出芽數(shù)呈下降趨勢。玻璃化芽苗比例與6-BA濃度關(guān)系十分密切，在6-BA濃度高于0.5 mg/L的條件下，玻璃化芽苗比例在34.7%～82.4%間波動(dòng)。在6-BA濃度為 0.5、0.2 mg/L的條件下，玻璃化芽苗比例在7.9%～14.6% 間波動(dòng)?？梢?，高濃度的6-BA是導(dǎo)致百合試管苗玻璃化的重要原因之一。從有效增殖倍數(shù)來看，在6-BA濃度為 0.5 mg/L、NAA濃度為0.5～1.0 mg/L時(shí)，百合的有效增殖倍數(shù)較高，而且，試管苗高度也保持較高水平，因此，這一濃度組合對于百合的芽增殖較為有利。

2.5芽增殖期蔗糖與瓊脂濃度對試管苗生長及玻璃化的影響

在12個(gè)瓊脂與蔗糖濃度組合處理中，單個(gè)外植體出芽數(shù)相比多數(shù)沒有顯著差異（P<0.05）。試管苗平均高度受瓊脂與蔗糖濃度組合處理的影響，其中，7.0 g/L瓊脂與50 g/L蔗糖的組合試管苗平均高度為最高。在8.0 g/L瓊脂與50 g/L蔗糖的組合中，玻璃化苗比例最低，而有效增殖倍數(shù)最高。綜上，8.0 g/L瓊脂與50 g/L蔗糖的組合對于百合的有效增殖較為有利，其試管苗的高度也維持在較高水平。

2.6優(yōu)化條件下試管苗生長、玻璃化苗比例及移栽

在以上研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，對優(yōu)化的培養(yǎng)條件進(jìn)行了整合，以驗(yàn)證對百合玻璃化苗發(fā)生及試管苗生長的影響。在百合的誘芽階段采用MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，在壯苗階段采用MS+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，在生根階段采用1/2MS+0.2 mg/L NAA，以上培養(yǎng)基瓊脂與蔗糖分別為8.0、50 g/L。結(jié)果（表6）表明，試驗(yàn)的3個(gè)百合品種均可以以相同的配方進(jìn)行快繁，苗高、壯實(shí)，玻璃化苗比例均可控制在5%以下，移栽的成活率較高（圖1-F），均可達(dá)到94%以上。

3討論

試管苗玻璃化的發(fā)生與試管苗的生產(chǎn)效率密切相關(guān)。在本研究中，試管苗在不太適宜的培養(yǎng)基中玻璃化比例最高可達(dá)到82.4%，因此，研究百合試管苗玻璃化問題對于指導(dǎo)其組培生產(chǎn)有重要意義。已有的研究表明，與正常試管苗相比，玻璃化苗的形態(tài)解剖特點(diǎn)異常，蛋白質(zhì)合成和光合作用能力低下[8-9]。本研究的結(jié)果表明，玻璃化試管苗干物質(zhì)含量、蛋白質(zhì)含量及葉綠素含量明顯偏低，這與前人的報(bào)道相一致。在激素合成方面，有研究表明玻璃化苗內(nèi)源激素發(fā)生明顯變化[10-11]，酸櫻桃玻璃化試管苗葉片及莖尖中IAA、ABA和乙烯的含量極顯著上升，莖葉極度玻璃化時(shí)CTK含量顯著降低[10]。本研究結(jié)果表明，正常試管苗與玻璃化苗IAA合成能力差異似乎并不大，但玻璃化苗中的玉米素核苷ZR含量顯著低于正常試管苗。另外，與逆境脅迫相關(guān)的激素乙烯含量與ABA含量明顯上升。在組織培養(yǎng)過程中，6-BA可促進(jìn)酸櫻桃組培苗內(nèi)源IAA和ZR的生物合成，降低ABA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[12-13]，而培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素（如6-BA）容易導(dǎo)致玻璃化[14-16]。在本研究中，6-BA與NAA的適當(dāng)組合大幅降低玻璃化苗的比例，這可能與培養(yǎng)基中的6-BA促進(jìn)百合內(nèi)源ZR的合成、降低ABA含量相關(guān)。有研究表明，添加乙烯前體物質(zhì)或乙烯生物合成的抑制劑并不影響玻璃化的發(fā)生[17]，這可能意味著本研究中玻璃化試管苗產(chǎn)生的高濃度乙烯是環(huán)境脅迫的結(jié)果，而不是導(dǎo)致試管苗玻璃化的原因。植物培養(yǎng)基成分、碳源等因素也與試管苗的玻璃化相關(guān)[14，18]，糖與瓊脂濃度常與玻璃化苗呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。絲石竹在含糖20 g/L的培養(yǎng)基中，玻璃化苗比例高達(dá)100%，在含糖20 g/L的培養(yǎng)基中玻璃化苗比例降低至70%[18]，高濃度的蔗糖也有利于降低石竹玻璃化苗的比例[2]。在本研究中，玻璃化苗比例隨含糖量與瓊脂濃度的升高大致呈下降趨勢（表5），但高濃度的糖與瓊脂影響到了試管苗的長勢，試管苗高度降低，總體而言，有效增殖倍數(shù)有一定程度的增加。通過激素組合、瓊脂和蔗糖等條件的優(yōu)化，本研究中的3個(gè)百合品種都能獲得有效的增殖與生長，移栽成活率在94%以上，驗(yàn)證了百合試管苗玻璃化發(fā)生相關(guān)技術(shù)措施能有效改善其產(chǎn)量損失，這為其工廠化生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

[HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：[HT8.SS]

[1]張悅，張正海，李愛民，等. 優(yōu)質(zhì)觀賞百合品種“索邦”愈傷組織培養(yǎng)研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（8）：49-51.

[2]程云清，劉劍鋒，劉春明，等. 中國石竹離體快繁與試管苗玻璃化研究[J]. 廣西植物，2012，32（4）：531-535.

[3]周春華，尤超，陳凝華. 百合組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 北方園藝，2013，37（4）：193-195.

[4]李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2000：164-260.

[5]舒展，張曉素，陳娟，等. 葉綠素含量測定的簡化[J]. 植物生理學(xué)通訊，2010，46（4）：399-402.

[6][JP2]年悅，王楠，崔震海，等. 北方粳稻灌漿期水分脅迫條件下葉片內(nèi)源激素變化的研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（21）：33-37.

[7]程云清，趙桂蘭，劉劍鋒，等. 乙烯抑制劑AVG和促進(jìn)劑ACC對大豆幼苗葉片光合特征的影響[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2010，36（4）：419-426.

[8]蔡祖國，徐小彪，周會(huì)萍. 植物組織培養(yǎng)中的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防[J]. 生物技術(shù)通訊，2005，16（3）：353-355.

[9]呂敏，夏秀英，徐品三，等. 藍(lán)莓玻璃化試管苗的顯微結(jié)構(gòu)及生理生化特性變化[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2014，50（4）：453-460.

[10]常有宏，張玉嬌，李曉剛，等. ‘黃冠梨正常試管苗與玻璃化苗生理生化及超微結(jié)構(gòu)的比較研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2011，38（2）：225-232.

[11]牛自勉，王賢萍，戴桂林. 蘋果砧木玻璃化過程中內(nèi)源激素的含量變化[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1995，10（3）：15-19.

[12]高紅兵，唐曉杰，孟慶繁. 高濃度 6-BA誘導(dǎo)酸櫻桃苗的玻璃化苗內(nèi)源激素含量變化[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2006，19（4）：488-490.

[13]高紅兵，王朋飛，刁紹啟，等. 6-BA對酸櫻桃組培苗4種內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)動(dòng)態(tài)變化的影響[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35（7）：46-48.

[14]王愛芝，沈海龍，張鵬，等. 花楸組織培養(yǎng)中玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生與防治[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37（10）：18-22.

[15]牛自勉，王賢萍，許月明. 蘋果砧木莖尖培養(yǎng)玻璃化與內(nèi)源激素的關(guān)系[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1994，21（4）：396-399.

[16]李瑤，王利華，時(shí)鳴明，等. 影響香石竹試管苗玻璃化的因素[J]. 植物生理學(xué)通報(bào)，1997，33（4）：256-258.

[17]Kevers C，Gaspar T. Vitrification of carnation in vitro：changes in [JP3]ethylene production，ACC level and capacity to convert ACC to ethylene[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1985，4（3）：215-223.

[18]張燕玲，姚軍，王潤珍，等. 滿天星組織培養(yǎng)中克服玻璃化現(xiàn)象的初探[J]. 廣西植物研究，1997，17（3）：246-248.