李羽白，王軍△，殷靜

支氣管肺發(fā)育不良（broncho-pulmonary dysplasia，BPD）是極早產(chǎn)兒常見的不良結(jié)局。隨著孕婦糖皮質(zhì)激素以及早產(chǎn)兒肺泡表面活性物質(zhì)替代療法的廣泛應(yīng)用，早產(chǎn)兒存活率顯著提高，但BPD發(fā)病率逐年上升［1］。已有研究表明Wnt信號通路在早期肺發(fā)育和肺部疾病中至關(guān)重要［2］，但Wnt 5a 作為Wnt 信號通路中的關(guān)鍵因子在BPD中的作用鮮有報(bào)道。本研究采用Western blot 和胸腺嘧啶脫氧核苷類似物（EdU）染色法檢測BPD細(xì)胞和動物模型中肺泡表面標(biāo)志物表面活性蛋白C（SPC）、水通道蛋白5（AQP5）、Wnt 5a 蛋白表達(dá)水平以及細(xì)胞增殖能力的變化，初步探討Wnt 5a在BPD發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞系購自美國ScienCell Research Laboratiories 公司；SD 孕鼠購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0001］；胎牛血清、F12培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素溶液（Gibco，美國）；蛋白裂解液RAPI、蛋白酶抑制劑Cocktail（Servicebio，中國）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒及BeyoClickTMEdU-488 細(xì)胞增殖檢測試劑盒（Beyotime，中國）；兔源一抗SPC 抗體（Affinity，美國）；兔源一抗AQP5 抗體（Bioworld，美國）；兔源一抗Wnt 5a 抗體及鼠源一抗GAPDH 抗體（Proteintech，美國）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（Servicebio，中國）；Wnt 5a抑制劑HY-123071（MCE，中國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549 細(xì)胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的F12培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2中進(jìn)行培養(yǎng)。在6 孔板中按照2×105個(gè)/孔種植細(xì)胞，24 h 細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分成2 部分。第一部分分2 組：對照組、BPD 組；第二部分分3 組：對照組、BPD 組、BPD+Wnt 5a 抑制劑組，Wnt 5a 抑制劑終濃度為5μmol/L。BPD 組和BPD+Wnt 5a 抑制劑組置于37 ℃、85%O2敷箱中培養(yǎng)48 h，對照組置于37 ℃、5%CO2的敷箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2 動物模型制備 將2 只SD 孕鼠所產(chǎn)的仔鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和BPD 組（各5 只）。BPD 組新生大鼠連同母鼠置于85%O2的密閉塑料箱中，溫度25～26 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)＜50%（堿石灰吸收CO2）、濕度50%～60%、每日開箱1 h添加水、飼料，更換墊料。對照組同母鼠置于同一室內(nèi)環(huán)境（25～26 ℃、21%O2）中，其余條件同高氧保持不變。

1.2.3 標(biāo)本的采集和處理 在BPD 組SD 大鼠高氧環(huán)境7 d后，2組大鼠行10%水合氯醛（0.05 mL/10 g）腹腔注射麻醉取肺。每只大鼠肺組織來源樣品分為2份：1份為200 mg，用于組織蛋白提??；剩余組織置于組織凍存管，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。對照組A549細(xì)胞在孵育72 h后，BPD組及BPD+Wnt 5a抑制劑組在高氧48 h后收取細(xì)胞，用蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑提取蛋白。

1.2.4 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)HE 染色、掃描后使用CaseViewer軟件觀察2組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 細(xì)胞和肺組織SPC、AQP5、Wnt 5a 蛋白表達(dá)檢測 將細(xì)胞及大鼠肺組織提取的蛋白測定蛋白濃度后，取30μg 變性蛋白進(jìn)行Western blot：使用濃度為12%的SDS-PAGE分離目標(biāo)蛋白質(zhì)，然后通過濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜中；用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，1×TBST洗滌5 min后將PVDF膜置于經(jīng)推薦稀釋濃度稀釋后的一抗中，4 ℃孵育過夜；1×TBST洗滌10 min×3次后將PVDF膜置于二抗中，室溫下孵育2 h；再次1×TBST洗滌10 min×3次后經(jīng)化學(xué)發(fā)光（ECL）采集圖像。

1.2.6 細(xì)胞增殖水平檢測 采用EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。經(jīng)EdU 與Hoechst 染色后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并采集照片，增殖細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。每組選取5 張照片，使用Image J 軟件對結(jié)果進(jìn)行量化（n=5）：陽性細(xì)胞率=EdU 熒光染色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，然后將其標(biāo)化統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prime 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示。2 組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組A549細(xì)胞SPC、AQP5蛋白表達(dá)量比較 A549細(xì)胞在高氧造模48 h 后SPC、AQP5 表達(dá)量降低，提示在BPD 組中肺泡Ⅰ型上皮和肺泡Ⅱ型上皮受損，見圖1。

Fig.1 Changes of SPC and AQP5 expression levels in BPD cell model圖1 BPD細(xì)胞模型SPC、AQP5表達(dá)量變化

2.2 2組A549細(xì)胞增殖能力比較 與對照組相比，BPD組陽性細(xì)胞率（標(biāo)化后）小于對照組陽性細(xì)胞率（0.42±0.08vs.0.83±0.10，t=7.214，P＜0.01，n=5），高氧造模顯著抑制了A549細(xì)胞的生長，見圖2。

2.3 2組A549細(xì)胞Wnt 5a蛋白表達(dá)量比較 Western blot 結(jié)果顯示，A549 細(xì)胞在高氧造模48 h 后Wnt 5a表達(dá)量升高，提示W(wǎng)nt 5a信號通路在BPD細(xì)胞模型中被激活，見圖3。

2.4 BPD動物模型中肺組織病理改變 結(jié)果顯示，BPD組較對照組肺泡面積增大、肺泡數(shù)量減少、肺泡間隔明顯增寬，BPD 高氧造模破壞了肺泡的形態(tài)功能，見圖4。

Fig.2 EdU changes in BPD cell model(×200)圖2 BPD細(xì)胞模型EdU變化（×200）

Fig.3 Changes of Wnt 5a expression levels in BPD cell model圖3 BPD細(xì)胞模型Wnt 5a表達(dá)量變化

Fig.4 Pathological sections of rat lung tissue in the control group and BPD group(HE,×200)圖4 對照組與BPD組大鼠肺組織病理切片（HE，×200）

2.5 2組大鼠肺組織SPC、AQP5、Wnt 5a蛋白表達(dá)水平比較 Western blot 結(jié)果顯示，BPD 組SPC、AQP5蛋白表達(dá)量均低于對照組，而Wnt 5a蛋白表達(dá)高于對照組，與在細(xì)胞水平觀察結(jié)果一致，見圖5。

Fig.5 Changes of expression levels of SPC,AQP5 and Wnt 5A in BPD animal model圖5 BPD動物模型中SPC、AQP5、Wnt 5a表達(dá)量變化

2.6 Wnt 5a 抑制劑對BPD 細(xì)胞模型Wnt 5a、SPC、AQP5 蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與BPD 組相比，BPD+Wnt 5a 抑制劑組A549 細(xì)胞Wnt 5a 蛋白表達(dá)量降低，SPC、AQP5 蛋白表達(dá)量增高，見圖6。

Fig.6 Expression changes of Wnt 5A,SPC and AQP5 in BPD cell model after treatment with Wnt 5a inhibitor圖6 應(yīng)用Wnt 5a抑制劑后BPD細(xì)胞模型Wnt 5a、SPC、AQP5表達(dá)量變化

2.7 應(yīng)用Wnt 5a抑制劑后各組A549細(xì)胞增殖能力比較 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)量化后對照組、BPD 組、BPD+Wnt 5a 抑制劑組陽性細(xì)胞率分別為0.81±0.12、0.36±0.09、0.52±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.270，P＜0.01）。對照組EdU熒光染色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)陽性細(xì)胞率大于BPD 組（P＜0.01）；BPD+Wnt 5a 抑制劑組較BPD 組升高（P＜0.05）?？梢娫诟哐踉炷l件下阻斷Wnt 5a 信號通路后肺泡上皮細(xì)胞損傷減小，細(xì)胞增殖能力恢復(fù)，見圖7。

3 討論

3.1 防治BPD 的重要性 有調(diào)查顯示2017 年江蘇省19 家醫(yī)院胎齡＜34 周早產(chǎn)兒BPD 的發(fā)病率為24.9%［3］，是國內(nèi)2006—2008 年10 家醫(yī)院回顧性調(diào)查的發(fā)病率（4.2%）的4.9倍［4］。因此，BPD仍然是嬰幼兒健康的一大威脅。感染、炎癥、胎兒生長受限、孕婦并發(fā)子癇前期、機(jī)械通氣和氧療、動脈導(dǎo)管未閉以及遺傳因素等被認(rèn)為是BPD 的高危影響因素，但具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚［1］。嚴(yán)重BPD患兒可因呼吸衰竭而死亡［5］。存活的BPD患兒在兒童期也更易發(fā)生感染和肺功能下降［6］。Wnt 5a在早期肺發(fā)育及肺部疾病中發(fā)揮重要作用，但Wnt 5a在BPD中的研究卻鮮有報(bào)道，探究Wnt 5a在BPD模型中的作用可能為防治BPD提供新思路。

Fig.7 EdU changes in BPD cell model after treatment with Wnt 5a inhibitor(×200)圖7 應(yīng)用Wnt 5a抑制劑后BPD細(xì)胞模型EdU變化（×200）

3.2 Wnt 5a 蛋白廣泛參與肺發(fā)育及肺部疾病的發(fā)生 Wnt 信號通路是早期肺發(fā)育、肺泡形成及損傷修復(fù)的重要調(diào)控途徑，依據(jù)是否激活β 連環(huán)素分為β 連環(huán)素依賴的Wnt 經(jīng)典信號通路和非β 連環(huán)素依賴的Wnt非經(jīng)典信號通路。Wnt 5a是非經(jīng)典Wnt信號通路的配體之一，廣泛參與肺形態(tài)的形成和肺部疾病的發(fā)生。在肺發(fā)育早期，Wnt 5a 缺失會導(dǎo)致遠(yuǎn)端氣道分支過多，而Wnt 5a過表達(dá)可干擾正常上皮間充質(zhì)相互作用，導(dǎo)致遠(yuǎn)端氣道分支和擴(kuò)張減少［7］。在小鼠膿毒癥致新生小鼠肺發(fā)育急性肺損傷中，血清Wnt 5a 水平隨肺損傷嚴(yán)重程度加深而升高［8］；在小鼠哮喘肺組織中Wnt 5a mRNA 和蛋白水平升高［9］；同時(shí)，慢性阻塞性肺疾病和肺纖維化時(shí)Wnt 5a表達(dá)亦升高［10-11］。

3.3 Wnt 5a 在BPD 造模過程中異常激活 Wnt 5a在肺發(fā)育早期和肺疾病中的作用提示其可能參與了BPD的發(fā)生發(fā)展。本研究通過高氧誘導(dǎo)的BPD細(xì)胞和動物模型來模擬疾病在人體中的表現(xiàn)，高氧對新生大鼠和A549 細(xì)胞的刺激常用于制作實(shí)驗(yàn)性動物模型和細(xì)胞模型。肺的發(fā)育分為胚胎期、假腺期、小管期、囊狀期和肺泡期5 個(gè)階段。新生大鼠肺發(fā)育相當(dāng)于極早產(chǎn)兒肺發(fā)育的囊狀期，將新生大鼠用于制作動物模型符合早產(chǎn)兒發(fā)生BPD 的病理?xiàng)l件［12］。通過Western blot 和EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在BPD細(xì)胞模型和動物模型中AQP5 和SPC 蛋白表達(dá)量降低，Wnt 5a 蛋白表達(dá)量升高，細(xì)胞增殖能力減弱。AQP5 和SPC 分別為肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞（AECⅠ）和AECⅡ表面標(biāo)志蛋白，其表達(dá)量變化反映AECⅠ和AECⅡ損傷修復(fù)的變化［13］。在應(yīng)用Wnt 5a抑制劑后AQP5、SPC 蛋白表達(dá)量有所升高，細(xì)胞增殖能力也有所恢復(fù)。上述結(jié)果提示在高氧造成的肺泡上皮細(xì)胞損傷過程中Wnt 5a 信號通路被激活，表明Wnt 5a異常激活參與了BPD 的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)也為防治BPD提供了新思路。在85%高氧造模的動物模型和對照組動物病理切片中，高氧動物模型肺組織肺泡面積增大，肺泡數(shù)量減少，肺泡間隔明顯增寬，同以往研究結(jié)論一致［14］，提示BPD 的動物造模成功。在既往研究中發(fā)現(xiàn)，AECⅡ可作為肺泡上皮細(xì)胞的祖細(xì)胞，在肺泡上皮細(xì)胞受到損傷后AECⅡ可向AECⅠ轉(zhuǎn)化，是BPD肺組織損傷修復(fù)的重要機(jī)制，即SPC表達(dá)降低、AQP5表達(dá)增加［15］。這與本研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)閾p傷中后期AECⅡ向AECⅠ轉(zhuǎn)化不足以代償AECⅠ的損傷，導(dǎo)致AECⅠ、AECⅡ在高氧后同時(shí)受損。

Wnt 5a可通過非經(jīng)典Wnt信號通路或者抑制經(jīng)典信號通路發(fā)揮作用，但本研究未能進(jìn)一步闡明Wnt 5a 在BPD 模型中如何發(fā)揮作用，這也將是后續(xù)研究中需要探究的問題。