張志鵬，程慶華，謝靖康，萬宇鶴，童華榮，陳應(yīng)娟

小檗堿對不同茶樹炭疽菌的抑菌活性及作用機(jī)制

張志鵬，程慶華，謝靖康，萬宇鶴，童華榮，陳應(yīng)娟*

西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院茶學(xué)系/食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶 400715

為研究小檗堿在茶炭疽菌（）引起的茶樹葉部病害防治中的應(yīng)用前景，以松針炭疽菌（）、喀斯特炭疽菌（）、重慶炭疽菌（）、山茶炭疽菌（）和膠孢炭疽菌（）5種不同茶炭疽菌為研究對象，研究了小檗堿對不同炭疽菌的抑菌活性，并比較了其抑菌活性差異。研究結(jié)果表明，小檗堿對和的抑制效果最好，在質(zhì)量濃度為12?mg·mL-1時達(dá)到100%抑菌率，其次是、和，其抑菌中濃度（Concentration for 50% of maximal effect，EC50）分別為2.828、3.288、4.164、4.778、5.104?mg·mL-1。顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，小檗堿對5種炭疽菌的菌絲和分生孢子均存在明顯影響，隨小檗堿濃度的增加，部分菌絲出現(xiàn)不規(guī)則膨大現(xiàn)象，分生孢子形態(tài)也出現(xiàn)扭曲變形；生物活性檢測發(fā)現(xiàn)，小檗堿處理后，不同炭疽菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度損傷，細(xì)胞膜的通透性增大、細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。研究結(jié)果明確了小檗堿對茶樹炭疽菌的抑菌活性及應(yīng)用前景，為炭疽菌引起的茶樹病害的防治提供了新的途徑及理論依據(jù)。

小檗堿；茶炭疽菌；抑菌活性；作用機(jī)制

茶樹病害的防治一直是茶學(xué)研究的重要方向，是茶葉安全生產(chǎn)的重要內(nèi)容。由炭疽菌（）引起的茶云紋葉枯?。˙rown blight disease）是茶園中的常見病害，在世界各茶葉種植區(qū)均有不同程度的發(fā)生。炭疽菌主要為害茶樹葉部，一般從茶樹葉片背部的毛孔侵入，經(jīng)8～15?d潛伏期后開始形成病斑，在溫暖濕潤的條件下易造成該病大面積的暴發(fā)流行，導(dǎo)致茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-3]。目前，炭疽菌引起的茶樹病害防治仍以化學(xué)農(nóng)藥為主，農(nóng)藥的不當(dāng)或過量使用不僅會出現(xiàn)茶葉農(nóng)殘超標(biāo)等問題，還會加速茶園生態(tài)環(huán)境的惡化，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和資源浪費(fèi)。因此，篩選高效、低毒、低殘留的防治方法是茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。

小檗堿（Berberine）又名黃連素，屬異喹啉類生物堿，分子式為C20H18NO4，是植物黃連的根狀莖中提取的主要有效成分，也是黃連、黃柏、功勞木、三顆針等中藥材中的主要有效成分[4-5]。最新研究表明，小檗堿具有良好的抗細(xì)菌、抗真菌、抗炎和抗癌等功效，在農(nóng)業(yè)上兼具殺蟲、殺菌和除草等活性[6-10]。目前，小檗堿憑借其殺菌活性在植物上被廣泛應(yīng)用，但未見在茶樹上應(yīng)用的相關(guān)報道。本研究以5種不同茶樹炭疽菌種為研究對象，研究小檗堿對不同茶炭疽菌的抑菌活性，進(jìn)一步通過顯微鏡鏡檢分析、生物活性檢測等研究小檗堿對茶樹炭疽菌的作用機(jī)制，以明確小檗堿在炭疽菌引起的茶樹病害防治中的應(yīng)用前景，以期為茶樹炭疽菌的病害防治提供新的途徑，為茶園安全生產(chǎn)做貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基與小檗堿母液

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）配制：將馬鈴薯去皮洗凈后，取200?g切成小塊，加1?L水煮至馬鈴薯可以輕易被戳碎，用8層紗布過濾之后，將濾液倒回洗凈的鍋中小火加熱，加入20?g葡萄糖和20?g瓊脂，攪拌至溶解，將濾液定容至1?L，分裝，高壓滅菌后備用。

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（Potato dextrose broth，PDB）為不加瓊脂的PDA液體培養(yǎng)基。

小檗堿母液配制：精準(zhǔn)稱取小檗堿粉末10?g置于100?mL的燒杯中，加入適量的二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，再用ddH2O配制成質(zhì)量濃度為600.0?mg·mL-1的母液，轉(zhuǎn)移至50?mL容量瓶中，用ddH2O將燒杯洗滌2～3次后定容到刻度線處，過濾除菌后待用。

1.2 菌株

本研究所采用茶炭疽菌種是2016年至2019年在重慶市茶葉種植區(qū)采集的茶樹感病樣本，經(jīng)形態(tài)學(xué)和多基因遺傳進(jìn)化分析鑒定為松針炭疽菌（）、喀斯特炭疽菌（）、重慶炭疽菌（）、山茶炭疽菌（）和膠孢炭疽菌（）[1,11-12]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抑菌活性測定

取保存?zhèn)溆玫臏缇鶳DA，用微波爐加熱至PDA全部融化，待冷卻至50℃時，取一定量的小檗堿母液在超凈臺上加入到PDA中，分別配制成1.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0?mg·mL-1的濃度梯度，將培養(yǎng)5?d的菌種打取菌餅接種至不同濃度的含藥培養(yǎng)基中，(26±2)℃培養(yǎng)5～7?d，觀察菌落生長情況，在6?d時用相機(jī)拍攝菌落狀態(tài)，每次試驗(yàn)設(shè)置兩個平行，試驗(yàn)重復(fù)3次，通過SPSS 20.0計(jì)算抑菌中濃度（Concentration for 50% of maximal effect，EC50）和顯著性分析，Adobe Photoshop CS5處理菌絲圖片。

菌落生長抑制率計(jì)算公式：

式中，C為對照菌落直徑，T為處理菌落直徑。

1.3.2 菌絲和分生孢子的培養(yǎng)及形態(tài)觀察

取滅菌過的PDA，將PDA分別配制成含EC50和質(zhì)量濃度為10?mg·mL-1的小檗堿培養(yǎng)基，以空白PDA為陰性對照（CK），用打孔器（d=7?mm）取在PDA上培養(yǎng)5?d的炭疽菌餅分別接種于CK、含EC50和10?mg·mL-1濃度小檗堿的培養(yǎng)基上，(26±2)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～10?d，在顯微鏡下觀察菌絲和分生孢子生長形態(tài)特征。

1.3.3 相對電導(dǎo)率的測量

將PDA上培養(yǎng)5?d的炭疽菌菌落用打孔器（d=7?mm）各取兩塊菌塊，接入含不同濃度小檗堿的PDB中，在26℃，160?r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)72?h，用電導(dǎo)率儀測量培養(yǎng)液的相對電導(dǎo)率（Relative conductivity），然后將培養(yǎng)液加熱至沸騰，待冷卻后再測1次電導(dǎo)率。試驗(yàn)重復(fù)兩次，每次3個重復(fù)。

相對電導(dǎo)率計(jì)算公式：

1.3.4 丙二醛（MDA）含量的測定

將PDA上培養(yǎng)5?d的炭疽菌菌落打取菌餅接種于PDB培養(yǎng)液中，在26℃，160?r·min-1條件下培養(yǎng)48?h后，加入小檗堿使其終質(zhì)量濃度為12.0?mg·mL-1，以不加藥劑的PDB為對照。分別在藥劑加入后0、12、24?h從培養(yǎng)液中取待測液。

取0.5?mL待測液，加入0.5?mL硫代巴比妥酸（0.67%，/），混合加熱30?min，待其冷卻后，低速離心10?min后測定吸光度，測定前用5%三氯乙酸溶液調(diào)零，分別在450、532?nm和600?nm處測定吸光值并計(jì)算MDA含量，μmol·mL-1。

MDA含量=[6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450]×提取液

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2016進(jìn)行初步整理分析，通過SPSS 20.0軟件進(jìn)行抑菌率分析、單因素方差分析，并建立毒力回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)和EC50，利用Tukey進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小檗堿對5種炭疽菌的抑菌活性比較

如圖1所示，小檗堿對5種炭疽菌均具有較好的抑菌活性，但對不同炭疽菌種表現(xiàn)出明顯的差異性，抑菌效果由高到低依次為、、、和，其EC50分別為2.828、3.288、4.164、4.778、5.104?mg·mL-1（表1），表明和對小檗堿更為敏感。在小檗堿質(zhì)量濃度為12.0?mg·mL-1時，和的菌落生長完全被抑制，達(dá)到100%的抑菌效果，而對和的抑菌效果分別為85.51%、84.31%、89.58%；小檗堿質(zhì)量在15?mg·mL-1時對和的抑菌活性也達(dá)到100%。

2.2 小檗堿對炭疽菌菌落生長情況的影響

如圖2所示，在PDA上正常培養(yǎng)7?d時，菌落正面整體呈白色，反面顏色呈淺黃色；菌落表面菌絲呈灰白色，菌落中心呈現(xiàn)明顯的橙紅色；正面整體為白色，反面為淡黃白色，菌絲生長均勻；菌落表面菌絲呈灰白色，背面為淡橙紅色，尤其是在菌落中央顏色較深，菌絲整體生長均勻；菌落白色，菌絲生長茂密且均勻。不同質(zhì)量濃度的小檗堿（1～12?mg·mL-1）處理后，培養(yǎng)基由于藥劑的加入呈現(xiàn)由淺黃色到深黃色的顏色變化，5種炭疽菌的菌落生長均受到了明顯的抑制，但菌落形態(tài)變化不大。隨小檗堿質(zhì)量濃度增大，在12?mg·mL-1時，5種炭疽菌的菌絲呈現(xiàn)簇狀生長狀態(tài)，生長發(fā)育受到顯著抑制。

圖1 不同濃度小檗堿對5種炭疽菌的生長抑制率

表1 小檗堿對5種炭疽菌的毒力分析

圖2 5種炭疽菌在不同濃度小檗堿作用下的菌落生長情況

2.3 小檗堿對不同炭疽菌菌絲生長的影響

如圖3所示，正常生長情況下，5種炭疽菌的菌絲整體生長均勻，但隨小檗堿濃度的升高，不同炭疽菌種的菌絲數(shù)量急劇減少，生長形態(tài)也發(fā)生了明顯的變化。EC50濃度處理下，和的部分菌絲形態(tài)呈現(xiàn)不均勻增粗或局部不規(guī)則膨大現(xiàn)象，而其他3種炭疽菌的菌絲形態(tài)在低濃度小檗堿作用下變化不大。隨著小檗堿濃度的增大，和的菌絲生長不正常狀態(tài)加劇，呈現(xiàn)較多短小分枝生長明顯受到抑制，和其他2種炭疽菌的菌絲生長也受到不同程度的影響，但程度明顯低于和。

2.4 小檗堿對炭疽菌分生孢子的影響

如圖4所示，正常生長狀態(tài)下，和的分生孢子均呈圓柱狀，末端呈鈍形或微向底部狹窄，整體透明，內(nèi)部無隔膜，大?。ㄩL×寬）分別為(11.7～18.9)μm×(4.1～7.61)μm、(12.60～18.50)μm×(4.30～7.50)μm和(14.1～18.4)μm×(6.8～8.6)μm；的分生孢子呈紡錘形，透明，無隔膜，大小為(10.9～17.3)μm×(3.5～5.8)μm；分生孢子呈圓柱形，兩端鈍或向基部狹窄透明，無隔膜，大小為(11.1～15.3)μm×(5.1～7.4)μm[1,11-12]。在小檗堿EC50濃度處理下，5種炭疽菌的部分分生孢子生長受到一定程度的抑制，但表現(xiàn)不明顯，隨著小檗堿濃度的升高，分生孢子數(shù)量大幅度減少，在10?mg·mL-1時，未觀察到分生孢子的生長，而其他4種炭疽菌的部分分生孢子形態(tài)發(fā)生了顯著變化，主要表現(xiàn)為分生孢子兩端不對稱生長、整體伸長或縮短、局部不規(guī)則膨大等，表明高濃度小檗堿能明顯抑制分生孢子的生長。

圖3 小檗堿對茶炭疽菌菌絲生長的影響（標(biāo)尺=10?μm）

圖4 小檗堿對茶炭疽菌分生孢子生長的影響（標(biāo)尺=10?μm）

2.5 小檗堿對茶炭疽菌細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞相對電導(dǎo)率的大小可以作為衡量細(xì)胞膜透性的指標(biāo)之一[13]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常振蕩培養(yǎng)72?h后，5種炭疽菌的相對電導(dǎo)率較高，在88.94%～92.33%，這可能是菌落培養(yǎng)時間較短造成的差異，但不同菌種之間其相對電導(dǎo)率存在一定的差異。不同濃度的小檗堿處理后，5種炭疽菌的相對電導(dǎo)率整體呈增高趨勢，但在小檗堿濃度較低時，即1?mg·mL-1時，和的相對電導(dǎo)率與對照（處理0?h）相比有不同程度的降低，這可能是由于低濃度藥劑對炭疽菌的抑菌活性較小，對不同炭疽菌細(xì)胞膜通透性的作用表現(xiàn)出一定程度的不穩(wěn)定性和差異；之后隨小檗堿濃度的升高表現(xiàn)為增高趨勢，表明在小檗堿的作用下，5種炭疽菌的細(xì)胞膜均出現(xiàn)不同程度損傷，且隨小檗堿濃度的增大損傷程度加劇（圖5）。

2.6 小檗堿對茶炭疽菌細(xì)胞抗氧化能力的影響

MDA是細(xì)胞在逆境脅迫下脂質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，MDA的含量是衡量細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)之一[14]。如圖6所示，處理0?h時，5種炭疽菌的MDA含量無顯著變化；在小檗堿處理12?h時，5種炭疽菌的MDA含量均急劇升高，表明在小檗堿處理下，炭疽菌的細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)急劇加強(qiáng)，細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的程度加劇；在處理12～24?h內(nèi)，5種炭疽菌的MDA含量又呈急劇下降的趨勢，表明在處理12?h后，炭疽菌細(xì)胞開始出現(xiàn)大量死亡，氧化應(yīng)激反應(yīng)減弱，MDA含量下降。整體來說，5種炭疽菌的MDA含量存在相似的變化規(guī)律，但不同炭疽菌的變化幅度存在一定的差異性。

3 討論與結(jié)論

由炭疽菌引起的茶云紋葉枯病是茶樹的主要葉部病害之一[1-2]，目前，茶樹病蟲害防治還是以化學(xué)防治為主，但農(nóng)藥殘留和病原抗藥性等問題突出，而植物源藥劑開發(fā)是解決這個問題的綠色、安全、有效的途徑之一。小檗堿，是一種異喹啉類生物堿，以其顯著的廣譜抗菌性，被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的治療方面，據(jù)報道，小檗堿能有效抑制金黃色葡萄球菌、腸球菌和鏈球菌，包括多重耐藥性的結(jié)核桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[7-9]。目前，小檗堿作為植物殺菌劑，被證實(shí)對桃褐腐病菌、蘋果輪紋病菌和番茄早疫病菌具有顯著的抑菌效果[5,7,15]，可見，小檗堿具有開發(fā)成農(nóng)用化學(xué)抑菌劑的潛力，而小檗堿在茶樹病蟲害防治領(lǐng)域的研究卻未見有報道，防治效果尚不明確。本研究以5種不同茶樹炭疽菌為研究對象，證實(shí)了小檗堿對5種炭疽菌均具有較好的抑菌活性，但對不同炭疽菌種表現(xiàn)出明顯的差異性，明確了小檗堿在茶炭疽菌引起的茶樹病害防治中的應(yīng)用前景。

圖5 不同濃度小檗堿對茶炭疽菌相對電導(dǎo)率的影響

圖6 小檗堿處理后茶炭疽菌MDA含量的變化

研究證實(shí)，小檗堿會抑制麥角甾醇的合成，使細(xì)胞膜通透性增大，從而造成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)的泄露，小檗堿也會造成菌體細(xì)胞膜膜電位去極化和脂質(zhì)過氧化。小檗堿防治引起的番茄早疫病的顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，小檗堿處理后的菌絲形態(tài)發(fā)生了明顯變化，菌絲表面變得褶皺、凹陷，并且隨小檗堿濃度的增大，病原菌出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象[5,7]，因此，推測小檗堿通過抑制細(xì)胞膜來發(fā)揮抑菌功效。小檗堿處理后病原菌相對電導(dǎo)率明顯增加，說明小檗堿造成了菌體細(xì)胞的滲漏和胞內(nèi)物質(zhì)外流[5,7]。這些研究結(jié)果與本研究中小檗堿對茶樹炭疽菌的作用機(jī)制較為一致，小檗堿對5種不同炭疽菌的菌絲和分生孢子生長均存在一定程度的影響，隨小檗堿濃度的增大，炭疽菌菌絲出現(xiàn)不規(guī)則膨大現(xiàn)象，部分分生孢子形態(tài)也出現(xiàn)扭曲變形，菌體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度損傷，細(xì)胞膜的通透性增大，細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，這為小檗堿在炭疽菌引起的茶樹病害防治研究提供了理論依據(jù)。但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，長期單一化學(xué)藥劑的使用易使病原菌抗藥性增強(qiáng)，藥劑防治效果降低。藥物復(fù)配是兩種或者兩種以上不同作用機(jī)制的藥物按照一定的配比聯(lián)合使用，利用藥劑之間的協(xié)同增效作用，達(dá)到減少用量、節(jié)約成本、提高防效等效果[16-17]。兩種或多種殺真菌劑的混合使用策略已達(dá)數(shù)十年，己成功控制多種作物的真菌病害[18-19]，因此，后續(xù)開展小檗堿藥劑復(fù)配研究將對茶樹病害的長期、高效防治具有重要意義。

本研究以5種不同茶樹炭疽菌為研究對象，證實(shí)了小檗堿對不同炭疽菌的抑菌活性，并發(fā)現(xiàn)小檗堿對不同茶樹炭疽菌的抑菌效果存在明顯差異，抑菌效果由高到低依次為、、、、，其EC50分別為2.828、3.288、4.164、4.778、5.104?mg·mL-1，表明和對小檗堿更為敏感。研究結(jié)果明確了小檗堿對由炭疽菌引起的茶云紋葉枯病病害防治中的應(yīng)用前景。顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，在小檗堿處理下，炭疽菌的菌絲和分生孢子的生長均受到不同程度的影響，隨小檗堿濃度的增大，部分菌絲和分生孢子形態(tài)出現(xiàn)不同程度的變化，菌體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)不同程度損傷，細(xì)胞膜通透性增大，細(xì)胞脂質(zhì)過氧化加劇，從而抑制了病原菌的生長發(fā)育，初步明確了小檗堿對不同炭疽菌的抑菌機(jī)制，為小檗堿在茶樹病害防治中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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The Antifungal Effect and Mechanism of Berberine on DifferentSpecies Causing Tea Brown Blight Disease

ZHANG Zhipeng, CHENG Qinghua, XIE Jingkang, WAN Yuhe, TONG Huarong, CHEN Yingjuan*

National Demonstration Center for Experimental Food Science and Technology Education, Department of Tea Science, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

To explore the application prospects of berberine on the prevention and control of tea diseases, the antifungal activity of berberine against five differentspecies (,,,and) were studied and the differences in antifungal activities were compared. The results show that berberine has the best inhibitory effect on bothand, reaching 100% at the concentration of 12?mg·mL-1, followed by,and. The EC50(Concentration for 50% of maximal effect) of the fivespecies were 2.828, 3.288, 4.164, 4.778?mg·mL-1and 5.104?mg·mL-1, respectively. The conidial and hyphal morphology of fivespecies under the treatment of berberine were examined, showing that berberine had a significant impact on the mycelial and conidial growth of fivespecies. With the increase of berberine concentration, part of hyphae expanded irregularly and the conidia grew abnormally. Results of the biological activity ofspecies show that the cell structure was damaged, the permeability of cell membrane was increased and the cell oxidative stress response was enhanced. Results of this study firstly confirm the antifungal activity and application prospects of berberine againstspecies, which provided a new approach and theoretical basis for the prevention and control of tea disease caused by.

berberine,, antifungal activity, mechanism

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2022)03-367-09

2021-12-20

2022-03-16

重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2021jscx-tpyzxX0010）、大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（202110635062和S202110635293）、中央高校基本業(yè)務(wù)費(fèi)重點(diǎn)項(xiàng)目（XDJK2020B046）

張志鵬，男，本科在讀，主要從事茶樹栽培與病蟲防控相關(guān)研究，2072312650@qq.com。*通信作者：cyj8@swu.edu.cn

（責(zé)任編輯：黃晨）