辛肇晨，吳 茜，BANG SOYEON，王 紅，楊子昂，張宏偉

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普通外科，上海 200032

乳腺癌是全球發(fā)病率最高的腫瘤之一，占女性新發(fā)癌癥總數(shù)的24.5%［1］。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與激素、肥胖、遺傳等多種因素有關(guān)。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cAMP-response element binding protein 1, CREB1）是亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子CREB/ATF家族的一員，可被多種蛋白激酶磷酸化，進而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄過程［2-3］。CREB1與肺癌［4］、腎癌［5］和膠質(zhì)瘤［6］的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但CREB1對乳腺癌細胞生物學(xué)行為的影響鮮見報道。

本研究通過構(gòu)建CREB1表達沉默的乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231，采用Western印跡、CCK-8實驗、集落形成實驗、流式細胞術(shù)、細胞劃痕實驗、Transwell細胞遷移和侵襲實驗觀察CREB1對乳腺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，旨在為乳腺癌的診療提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑和儀器 人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231和人腎上皮細胞系HEK293T購于美國模式菌種收集中心（ATCC）。胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購 于 美 國Gibco公 司（16140063、11995065、15090046）；磷酸鹽緩沖液（PBS）購于美國Hyclone公司（SH30256.01B）。攜帶短發(fā)夾RNA（shRNA）序列的pLKO.1載體購自美國Sigma公司。Lipo3000試劑購于美國Invitrogen公司（L3000015）；NP-40裂解液、細胞周期與細胞凋亡流式檢測試劑盒購于海門碧云天生物技術(shù)研究 所（P0013F、C1052）；BCA蛋 白 定 量 試 劑盒 購 于 美 國Thermo公 司（23227）。CREB1、GAPDH、Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6一 抗，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購于 美 國CST公 司（9197、5174、55506、18048、12790、13331、7074）；CCK-8試劑盒、Caspase 3、 Bcl-2、Survivin、Bax一 抗 購 于 英 國Abcam公司（ab228554、ab32351、ab32124、ab76424、ab32503）。ECL Western印跡試劑盒購于南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司（E412-01）；Transwell小室和BD Matrigel基質(zhì)膠購自北京明陽科華生物科技有限公司（353097、354480）。酶標儀和流式細胞儀購自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 MCF-7和MDA-MB-231細胞系用含10%FBS和100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。將細胞分為shSCR組（空載質(zhì)粒）、shCREB1#1組和shCREB1#2組。

1.3 載體構(gòu)建及慢病毒轉(zhuǎn)染 用Lipo3000將shRNA-pLKO.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞，用慢病毒感染HEK293T細胞后，收集病毒液，轉(zhuǎn)染MCF-7和MDA-MB-231細胞。用嘌呤霉素篩選7 d后，獲得穩(wěn)定沉默CREB1的乳腺癌細胞系。shRNA的序列見表1。

表1 shRNA序列

1.4 Western印跡和RT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率 Western印跡：使用NP-40裂解液提取總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完成后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育，4℃搖床過夜；第2天回收，經(jīng)TBST洗膜后，于室溫下用二抗孵育 1 h，用ECL試劑盒檢測蛋白條帶。

RT-PCR：CREB1及GAPDH的PCR引 物 如表2所示。配置20 μL反應(yīng)體系，設(shè)定兩步法RTPCR程序，每個組設(shè)置3個副孔；讀取樣本光密度（D）值。

表2 RT-PCR引物序列

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液，以100 mL/孔接種于96孔板中，使每孔含細胞3000～5000。每個細胞系設(shè)置夠5 d測量的副孔，將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后棄去3個副孔中的培養(yǎng)基，加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育2 h后，測定450 nm處的D值。

1.6 集落形成實驗 取對數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液，用細胞板對細胞進行計數(shù)。將計數(shù)好的細胞以600個/孔接種于6孔板并使細胞分散均勻，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。待孔板中形成肉眼可見的克隆時，棄上清液，用PBS清洗，陰干，甲醇固定。加適量結(jié)晶紫染色20 min，統(tǒng)計細胞的克隆數(shù)。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 將細胞以2×105個/孔接種至6孔板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。取對數(shù)生長期的細胞，消化并收集，4℃下200×g離心5 min，收集細胞懸液。用70%冷乙醇固定細胞18 h，用PBS洗滌2次。每個試管加入500 μL PI/RNase染液，混勻，室溫下避光孵育20 min后置于冰上，并于1 h內(nèi)通過流式細胞儀檢測細胞周期。

1.8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 鋪板、制備單細胞懸液過程同上。用冰PBS洗滌細胞2次后，將細胞轉(zhuǎn)移到流式管中，離心，棄上清。加入300 μL的Annexin Ⅴ Binding Buffer懸浮細胞，然后加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混勻，避光，室溫孵育15 min。 上機前5 min加入5 μL的PI染色，并補加200 μL的Annexin Ⅴ Binding Buffer。根據(jù)Annexin Ⅴ和PI的染色情況篩選出凋亡細胞。

1.9 Western印跡檢測細胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白 采用Western印跡檢測CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1、Bcl-2、Survivin、Caspase 3、Bax蛋白的表達情況，以GAPDH為內(nèi)參。實驗步驟同上。

1.10 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 用馬克筆在六孔板背后劃線，每隔1 cm劃一道，每孔至少有5條線穿過。每孔鋪約5×105個細胞，每組設(shè)置3個副孔，培養(yǎng)過夜。用移液槍頭在六孔板內(nèi)按照馬克筆標記垂直劃線，用PBS洗滌細胞后，加入無血清培養(yǎng)基。將六孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于 8 h、24 h后拍照并計算劃痕閉合率。

1.11 Transwell細胞遷移和侵襲實驗 進行遷移實驗前，先用無血清培養(yǎng)基饑餓細胞12 h，制備單細胞懸液。在Transwell小室上層加入300 μL無血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育2 h。在上層小室中加入100 μL細胞懸液，在下層小室中加入600 μL 含10%FBS的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h后取出，用5%戊二醛固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察、拍照，并對細胞進行計數(shù)。侵襲實驗除須在接種細胞前將BD Matrigel基質(zhì)膠置于上層小室并培養(yǎng)24 h外，余步驟同遷移實驗。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用GraphPad Prism繪制統(tǒng)計圖。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

2 結(jié)果

2.1 CREB1表達沉默細胞株的鑒定 結(jié)果 （圖1）顯 示，shRNA干 擾 后，shCREB1#1組 和shCREB1#2組中MCF-7和MDA-MB-231細胞系CREB1的mRNA和蛋白水平均低于shSCR組（P＜ 0.001），提示CREB1沉默細胞株構(gòu)建成功。

圖1 RT-PCR和Western印跡檢測MCF-7和MDA-MB-231細胞系中CREB1的表達A、C：MCF-7細胞系；B、D：MDA-MB-231細胞系。n＝3, ±s；***P＜0.001。

2.2 沉默CREB1對乳腺癌細胞增殖的影響 CCK-8實驗結(jié)果（圖2A）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細胞的增殖能力均明顯減弱（P＜ 0.001）。集落形成實驗結(jié)果（圖2B、2C）顯示，沉 默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細 胞 的克隆數(shù)減少（P＜0.001）。

圖2 沉默CREB1對MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖和集落形成的影響A：CCK-8法檢測細胞增殖能力；B、C：集落形成實驗檢測細胞的克隆數(shù)。n＝3, ±s； ***P＜0.001。

2.3 沉默CREB1對乳腺癌細胞周期的影響 流式細胞分析結(jié)果（圖3A）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細胞的G1期細胞占比增多，而S期細胞占比減少（P＜0.05）。同時，Western印跡結(jié)果（圖3B）顯示，沉默CREB1后，MCF-7細胞中CDK2、CDK4和CDK6的表達量降低，MDA-MB-231細 胞 中CDK2、CDK4、CDK6和Cyclin D1的表達量降低。

圖3 沉默CREB1對MCF-7和MDA-MB-231細胞細胞周期的影響A：流式細胞術(shù)檢測各組細胞G1期、S期、G2期細胞占比；B：Western印跡檢測細胞周期相關(guān)蛋白的表達水平。n＝3, ±s; *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.4 沉默CREB1對乳腺癌細胞凋亡的影響 流式細胞分析結(jié)果（圖4A）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細胞的凋亡率升高（P＜ 0.05）。Western印跡結(jié)果（圖4B）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細 胞 的 促 凋 亡蛋白Caspase3、Bax的表達水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達水平降低（P＜0.05），其中以shCREB1#2組的凋亡相關(guān)蛋白表達變化更明顯。

圖4 沉默CREB1對MCF-7和MDA-MB-231細胞凋亡的影響A：流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率；B：Western印跡檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達水平。n＝3, ±s; *P＜0.05，**P＜0.01， ***P＜0.001。

2.5 CREB1沉默對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響

2.5.1 細胞劃痕實驗 結(jié)果（圖5）顯示，沉默CREB1后，MCF-7和MDA-MB-231細 胞 劃 痕8 h和24 h后的愈合率降低（P＜0.05）。

圖5 沉默CREB1對MCF-7和MDA-MB-231細胞遷移能力的影響n＝3, ±s; *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.5.2 Transwell細胞遷移和侵襲實驗 結(jié)果（圖6）顯 示，沉 默CREB1后，MCF-7和MDAMB-231細胞的遷移和侵襲數(shù)量均減少（P＜0.05）。

圖6 沉默CREB1對MCF-7和MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的影響A、B：Transwell遷移實驗；C、D：Transwell侵襲實驗。Original magnification:×200。n＝3, x± s; *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

3 討論

CREB1于1987年首先由Montrminy等從大鼠腦組織中分離純化出來［7-8］。近年來，CREB1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到關(guān)注。CREB1作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以與多種靶基因的啟動子結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達，包括CDK4、Cyclin D1和Cyclin A等細胞周期關(guān)鍵蛋白［9］。在膠質(zhì)瘤中，CREB1可通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路促進Cyclin D1、Bcl-2的表達，而促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖并抑制凋亡［10-11］。過表達CREB1可抵抗miR-133a-3p對視網(wǎng)膜母細胞瘤的促凋亡作用［12］。

本研究中，沉默CREB1可導(dǎo)致乳腺癌細胞的增殖能力減弱，G1/S期阻滯以及CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1表達水平下降，提示CREB1可能在乳腺癌細胞的增殖過程中起關(guān)鍵作用。而且，沉默CREB1還引起乳腺癌細胞的凋亡增加，凋亡蛋白Caspase 3、Bax的表達水平升高而促生存因子Bcl-2、Survivin的表達水平降低，表明CREB1可能參與乳腺癌細胞凋亡信號的調(diào)控。盡管本研究Western印跡結(jié)果中MCF-7細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的變化與MDA-MB-231細胞并不完全一致，但與沉默CREB1抑制乳腺癌細胞周期和促進其凋亡的結(jié)論一致。關(guān)于CREB1調(diào)控乳腺癌增殖和凋亡過程的分子機制尚待進一步研究。

腫瘤細胞遷移是一個復(fù)雜的、多因素調(diào)控的過程。該過程除受外部因素影響外，還與腫瘤細胞基因表達有關(guān)［13-15］。細胞遷移和侵襲的發(fā)生與細胞間黏附減少和細胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)。E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-CAD）在上皮細胞胞間連接中起重要作用，當E-CAD缺乏時，上皮細胞會具有間充質(zhì)細胞的特性，其流動性大幅增強［16］。 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族是與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以降解多種細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［17］。本研究細胞劃痕實驗和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，沉默CREB1可導(dǎo)致乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力減弱，表明CREB1與乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)。但本研究未進一步測定E-CAD和MMPs等蛋白的表達水平，后續(xù)可通過Western印跡、RT-PCR、ELISA等方法測定相關(guān)蛋白的表達水平，并對遷移和侵襲的相關(guān)信號通路進行探索。

目前有關(guān)CREB1與乳腺癌關(guān)系的研究多側(cè)重于CREB1作為中介因子對其他腫瘤相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用［18-19］，而CREB1調(diào)控的下游靶基因眾多，這些靶基因?qū)θ橄侔┥飳W(xué)行為的影響仍需進行研究。本研究通過沉默CREB1基因，抑制了CREB1調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的“總閘門”作用，證明CREB1表達的降低可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡，為乳腺癌的治療提供了新的靶點。未來可補充體內(nèi)實驗，在動物模型中對細胞實驗結(jié)果進行進一步驗證。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。