王夢圓, 張龍飛, 吳迪, 方長玲, 遲海, 顧潤潤, 王媛, 席寅峰,李思曼, 史永富,*

1. 上海海洋大學食品學院,上海 201306

2. 中國水產科學研究院東海水產研究所,水產品質量安全與加工研究室,上海 200090

羥基多氯聯苯(hydroxylated polychlorinated biphenyls, OH-PCBs)是典型環(huán)境持久性污染物多氯聯苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)在生物體內的主要代謝產物,屬于第二代環(huán)境持久性污染物[1]。 環(huán)境中廣泛存在的PCBs 在生物體內經P450 單加氧化酶系統(tǒng)氧化氧化芳烴等中間代謝產物介導而產生OH-PCBs[2-4]。 另有證據表明,具有半揮發(fā)性的PCBs 在遷移過程中能夠與大氣中的羥基自由基發(fā)生反應形成 OH-PCBs[5]。 環(huán)境中的 OH-PCBs 經過雨水沖刷、大氣沉降等作用,相當一部分進入到水環(huán)境中[6]。 各種水產品作為水環(huán)境中的主要棲息生物,已經成為OH-PCBs 等污染物在水環(huán)境中的蓄積庫之一。 目前,在多個國家和地區(qū)開展的調查中均發(fā)現存在水產品被OH-PCBs 污染的跡象[7-9]。

我國是水產品貿易大國,據統(tǒng)計,2019年全國水產品總產量達6 480.36 萬t,人均水產品攝入量也在逐年穩(wěn)步增加[10]。 水產品已經成為人體暴露OHPCBs 等二代持久性污染物的主要途徑之一[11]。 近幾十年來,很多學者針對水產品攝入量較高地區(qū)的人群做了一系列調查。 在北美洲的加拿大不同沿海城市、美國加利福尼亞州居民體內均檢測到OHPCBs 的存在[12-14];歐洲國家開展的一些調查發(fā)現,人體內OH-PCBs 的含量與魚類攝入量及年齡呈正相關[15-16];東亞地區(qū)的水產品攝入同樣導致OHPCBs 在當地居民體內蓄積,并發(fā)現血液中的OHPCBs 可能通過母乳傳遞對子代健康產生危害[11,17]。隨著相關調查研究的推進,研究人員發(fā)現以魚類等為主食的高等野生動物體也受到了不同程度的污染[18-20]。 研究表明,長期蓄積在生物體內的 OHPCBs 能夠引起一系列的毒性效應,包括(抗)雌激素效應[21-22]、甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)分泌紊亂[23-24]、神經發(fā)育障礙[25]以及基因毒性[26]等危害。因此,對通過水產品攝入途徑暴露于OH-PCBs 的風險進行評價尤為重要。 然而,截止到目前,以OHPCBs 等二代持久性污染物為暴露物質,探索其通過日常水產品攝食暴露后在生物體內的蓄積、分布及排泄等的研究鮮有報道。

PCB101 作為環(huán)境中常檢出的一種PCBs,是7種指示性PCBs 之一[27-28]。 本課題組在前期的研究中發(fā)現,PCB101 在生物體內可代謝生成3-OHPCB101、4-OH-PCB101,并在水環(huán)境中多種水生生物體內也發(fā)現了這2 種OH-PCB101 的存在[9,29]。 本實驗以小白鼠為研究對象,向鯽魚可食性組織中添加OH-PCB101 后制備成暴露實驗投喂飼料,模擬動物通過攝入水產品暴露于OH-PCBs 的過程。 本研究初步揭示環(huán)境中的OH-PCBs 通過食物鏈傳遞至哺乳動物體內后在各組織蓄積、分布及排泄規(guī)律,為OH-PCBs 代謝轉化、毒理效應的深入探索及水產品食用安全控制提供基礎數據支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實驗儀器

DOP-B 高通量組織研磨儀(上海萬柏生物科技公司,中國);B5510E-MT 超聲波清洗機(美國BRANSON 公司);Mili-Q 超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);日立Hitachi* RX 系列多用途冷凍離心機(日本Hitachi 公司);BUCHI R-100 旋轉蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI 公司);Talboys EOFO-945616 數顯型旋渦混合器(美國Talboys 公司);XYC-BDM-24 全自動氮空吹掃濃縮儀(上海析友分析技術有限公司,中國);SPE 硅膠柱(500 mg/6 mL,美國 Agela Technologies公司);Supelco 12 管固相萃取裝置(美國SUPELCO公司);QM-2SP100 行星式球磨機(南京萊步科技實業(yè)有限公司,中國);Labconco Freezone-Centrivap 冷凍干燥機(美國 Labconco 公司);JA12002 天平(上海精天電子儀器有限公司,中國);DB-17MS 柱(美國 Agilent 公司);Thermo TSQ Quantum GC 氣相色譜-串聯質譜儀(美國 Thermo Fisher Scientific 公司)。

1.1.2 實驗試劑

3-OH-2,2’,4’,5,5’-PCB101(100 μg·mL-1,純度100%)和 4-OH-2,2’,4’,5,5’-PCB101(100 μg·mL-1,純度99.6%)均購自美國 AccuStandard 公司;正己烷、二氯甲烷(色譜純,美國Tedia 公司);濃硫酸、濃鹽酸(優(yōu)級純,中國國藥集團)。

1.2 暴露實驗

1.2.1 實驗動物

本實驗所用模式生物為鼠齡8 周的ICR 系雄性小鼠20 只(上海實驗動物研究中心,體質量(30±3) g)。 新購進小鼠4 ~5 只分為一籠,在實驗室條件下(光照周期12 h,溫度(20±2) ℃,濕度(50±10)%)飼養(yǎng)一周后開始進行暴露實驗,同時設置空白對照組。每日清理飼養(yǎng)環(huán)境并更換鼠籠墊料,同時觀察記錄小鼠健康情況。

1.2.2 加標飼料的制備

從千島湖采集的鮮活鯽魚,去鱗去皮,取可食肉組織切碎后經真空冷凍干燥,置于球磨儀中研磨制成魚粉。 準確稱取后向每克魚粉中添加1 mL 濃度為 1 000 ng·mL-1的 3-OH-PCB101 和 4-OH-PCB101等量混合標準溶液,持續(xù)攪拌均勻,使得魚肉粉中2種 OH-PCB101 的含量為 1 000 ng·g-1。 以該加標魚粉為原料,制成顆粒狀加標飼料備用。 同時用未加標魚粉以相同的步驟制作飼料,投喂空白對照組小鼠。 暴露實驗前,對加標飼料和空白魚肉飼料進行定性、定量分析,以確保暴露濃度水平,扣除魚肉本底值干擾。

1.2.3 實驗方案

實驗設定平均每只小鼠每日進食5 g。 為了模擬哺乳動物通過攝入水產品暴露OH-PCBs 的真實情況,設定小鼠每天攝入的鯽魚肉加標飼料的量占攝食總量的約10%,即平均每只小鼠每天攝入0.5 g的加標飼料和4.5 g 普通飼料,使得小鼠每日通過正常攝食的暴露量為16.7 μg·kg-1(小鼠的平均體質量按30 g 計算)。 每天早上8:00 先投喂加標飼料,觀察鼠籠中的加標飼料被食盡后,再投喂普通飼料,普通飼料分早晚2 次進行投喂,向空白對照組投喂的魚肉飼料和普通飼料與暴露組同步進行。

1.2.4 樣品的采集與制備

投喂加標飼料后,分別在暴露實驗的第12、24、72 和168 小時(次日投喂加標飼料之前)進行取樣,以確定小鼠首次經攝食暴露后經過白天(實驗室條件)一天正常攝食和活動及一段時間后OH-PCBs 在其體內蓄積分布及排泄情況。 每次取3 只小鼠作為平行,取樣前2 h 將小鼠置于底部鏤空的鼠籠中以便收集小鼠糞便。 眼部取血,解剖后取腦、心、肺、肝、胃、脾、小腸、大腸、腎、睪丸和肌肉共11 種組織,取樣后分別將組織研磨勻漿,-40 ℃保存。 在暴露實驗開始前和結束后,取空白對照組樣品以排除背景干擾。

1.2.5 樣品前處理與分析

本實驗采用GC-MS/MS 對樣品進行定性和定量分析,前處理過程和分析的儀器條件及參數均參照之前建立的方法進行[29]。

2 結果(Results)

2.1 樣品中2 種OH-PCB101 的鑒定

本研究采用色譜保留時間結合二級質譜特征碎片離子的相對豐度對樣品中2 種OH-PCB101 進行鑒定。 根據本課題組前期的研究成果,OH-PCB101經硅烷化試劑衍生后[30],在SRM 模式下確定3-OHPCB101 的特征子離子為m/z399 和m/z364,4-OHPCB101 的特征子離子為m/z399 和m/z363[29]。 2種OH-PCB101 在100 ng·g-1的加標水平下的色譜圖及其特征子離子質譜圖如圖1 所示。

圖1 2 種OH-PCB101 在100 ng·g-1的加標水平下肝臟的色譜圖及其特征子離子質譜圖Fig.1 Chromatograms of two OH-PCB101 in liver with spiked levels at 100 ng·g-1 and their characteristic product ion mass spectra

以暴露24 h 的肝臟樣品為例,如圖2 所示,肝臟中檢測到的2 種物質的保留時間分別為6.56 min和6.78 min,與3-OH-PCB101、4-OH-PCB101 的標準物質的保留時間完全一致。 肝臟中檢出的物質1 對應的特征子離子m/z364、m/z399 的相對豐度分別為60%、100%,與3-OH-PCB101 標準物質相比(m/z364、m/z399 的相對豐度分別為 66%、100%),其相對豐度之差為6%(＜10%),根據歐盟EU: 2002/657/EC[31]和EU:SANCO/12571/2013[32]關于采用色譜和質譜數據對物質進行鑒定的規(guī)定,確定物質1 即為3-OH-PCB101。 而肝臟中檢出的物質2 對應的特征子離子m/z363、m/z399 的相對豐度分別為67%、100%,與 4-OH-PCB101 標準物質相比(m/z363、m/z399 的相對豐度分別為60%、100%),其相對豐度之差為 7%(＜10%),確定物質 2 為 4-OH-PCB101。 按照該方法依次對不同樣品中檢出的2 種OH-PCB101進行確認,在小鼠的血液、糞便以及所取的11 種組織中均發(fā)現有不同程度的OH-PCB101 的蓄積。 采用同樣的方法對未進行冷凍干燥的鯽魚肉及空白對照組小鼠進行了分析,2 種OH-PCB101 均未檢出。

圖2 暴露24 h 肝臟中檢測到的2 種物質的色譜圖及其特征子離子質譜圖Fig.2 Chromatograms of the two substances detected in the liver after 24 h of exposure and their characteristic product ion mass spectra

2.2 OH-PCB101 在不同組織、器官中的蓄積分布

分析12 h 所取的小鼠樣品發(fā)現,3-OH-PCB101和4-OH-PCB101 在糞便中的檢出濃度最高(分別為20.4 ng·g-1和 20.6 ng·g-1),其次依次為胃、大腸、脾、肝和小腸。 心臟中的4-OH-PCB101(4.34 ng·g-1)的濃度明顯高于3-OH-PCB101(0.70 ng·g-1),而2 種OH-PCB101 在腎、血液、肌肉和睪丸中的濃度依次降低。 在腦組織中只有4-OH-PCB101 被檢出,濃度為 1.11 ng·g-1。

在首次投喂24 h 后,相比于12 h 的樣品,2 種OH-PCB101 的蓄積濃度在胃中的濃度有所降低,小腸中的濃度變化不明顯,大腸中的濃度升高,糞便中的檢出濃度達到最高(分別為48.51 ng·g-1和45.78 ng·g-1),這可能說明OH-PCB101 進入小鼠體內后,一部分OH-PCB101 經消化道不斷向體外遷移,并通過糞便排出體外。 同時肝、肺中仍有明顯蓄積,腦、腎、睪丸、肌肉及其血液中的含量水平變化不明顯。 心、脾中分別只有4-OH-PCB101、3-OH-PCB101檢出。

實驗進行到72 h 時,2 種OH-PCB101 在糞便中的濃度仍是所檢樣品中的最高值(36.49 ng·g-1),并且主要在脾、心、胃和大腸中產生蓄積(4.39 ~8.08 ng·g-1)。 小腸和肝中 2 種 OH-PCB101 的蓄積濃度有所降低,腎、血液、肌肉和睪丸的含量變化(0.65 ~1.57 ng·g-1)不明顯。

在第168 小時采集的樣品中,OH-PCB101 在胃、小腸、大腸和糞便中的蓄積濃度(21.40 ~61.83 ng·g-1)均顯著高于其他組織(圖 3)。 肝、睪丸中的蓄積濃度升高,肺、腎、心和血液中的濃度持續(xù)下降。不同暴露時間下3-OH-PCB101 和4-OH-PCB101 在小鼠各組織中的蓄積濃度如圖4 所示。

圖4 不同暴露時間下3-OH-PCB101 和4-OH-PCB101 在各組織及糞便中的濃度注:1. 腦;2. 心;3. 肺;4. 肝;5. 胃;6. 脾;7. 小腸;8. 大腸;9. 腎;10. 性腺;11. 肌肉;12. 血液;13. 糞便。Fig.4 The concentration of 3-OH-PCB101 and 4-OH-PCB101 in various tissues and feces at different exposure timesNote:1. Brain;2. Heart;3. Lung;4. Liver;5. Stomach;6. Spleen;7. Small intestine;8. Large intestine;9. Kidney;10. Gonad;11. Muscle;12. Blood;13. Feces.

由圖3 可知,在前72 h,胃、小腸和大腸組織中的蓄積濃度變化較為穩(wěn)定,而在24 h 糞便樣品中檢測到2 種 OH-PCB101 的濃度顯著高于12 h 和72 h。 與72 h 的樣品相比,OH-PCB101 在腦和脾中的蓄積濃度隨著時間的延長而有所降低。 分析所有的樣品數據發(fā)現,OH-PCB101 在腦、血液和肌肉等樣品中的濃度相對較低。 以3-OH-PCB101 為例,對小鼠體內主要的消化吸收器官、代謝器官及糞便中的含量進行了對比(圖5),以初步展示OH-PCB101 經口進入小鼠體內后的歸趨。 從圖5 能夠清楚地看出3-OH-PCB101 主要蓄積在胃、腸等消化組織器官和糞便中,其他各組織中的蓄積濃度所占比率相對較小。 并且隨著暴露時間的增加,蓄積在肝臟中的OH-PCB101 的濃度雖未下降,但其在幾種組織中的相對比率在逐漸減小。

圖3 消化組織器官及糞便中3-OH-PCB101 和4-OH-PCB101 的濃度-時間曲線Fig.3 Concentration-time curves of 3-OH-PCB101 and 4-OH-PCB101 in digestive organs and feces

圖5 不同暴露時間3-OH-PCB101 在各個組織及糞便中的含量百分比Fig.5 The percentage of 3-OH-PCB101 in each tissue and feces at different exposure times

3 討論(Discussion)

暴露實驗期間,3-OH-PCB101 和4-OH-PCB101隨著加標飼料被攝入到小鼠體內,首先進入胃、腸等消化器官。 根據暴露前24 h 樣品的檢測結果,小鼠在首次攝食加標飼料后隨著時間的推移,OHPCB101 由消化道前段逐漸向后段遷移,隨著胃組織中的含量下降,OH-PCB101 在小腸和大腸中的蓄積水平不斷增大,通過糞便排出體外的量也在增加。與此同時,發(fā)現OH-PCB101 在胃、小腸和大腸中的蓄積濃度在不同時間的濃度變化規(guī)律基本一致,且3-OH-PCB101 和 4-OH-PCB101 的濃度無明顯差異。 然而,在24 h 的糞便樣品中的濃度顯著高于12 h 和72 h 的糞便樣品,這可能是由于初次暴露后,經過12 h 蓄積在小鼠消化道中的OH-PCB101 少量隨著糞便被排出;到了24 h,一方面消化道中未被吸收的OH-PCB101 繼續(xù)被排泄,與此同時,進入血液循環(huán)的部分OH-PCB101 可能隨著新陳代謝被重新排出體外。 在持續(xù)暴露3 d 后(72 h),蓄積在小鼠體內的OH-PCB101 與隨著糞便被排泄的量可能達到相對平衡狀態(tài)而有所下降。 在168 h 的消化吸收器官樣品中OH-PCB101 的蓄積量顯著增大,在對應時間收集的糞便中的檢出濃度同樣顯著增大。 相比于實驗前3 次采集的樣品,第168 小時的小鼠經過7 d的持續(xù)攝食暴露,可能是直接導致胃、腸及糞便中檢出濃度增大的重要原因。

OH-PCBs 分子中—OH 的存在使得分子呈弱酸性,在胃酸及膽酸溶液中能夠穩(wěn)定存在。 膽汁中的膽鹽分子可以把脂肪乳化成許多小的脂肪微粒,激活胰脂肪酶,促進脂肪的吸收與消化,并且能和脂肪酸結合成水溶性復合物,以促進這些親脂性的羥基代謝產物的吸收和蓄積。 肝臟中的OH-PCB101 可能隨著膽汁的分泌被儲存并穩(wěn)定存在于膽囊,再經膽汁被排入腸道中,一部分在腸道中被重新吸收,經門靜脈返回肝臟(肝腸循環(huán)),另一部分則通過腸道隨著糞便排出體外,導致腸道及糞便中的濃度增加。 以上現象說明,OH-PCB101 通過攝食暴露進入到生物體內,其中一部分會在短時間內隨著體循環(huán)被排出體外。 與該結論相似的是,Ohta 等[33]研究發(fā)現PCB187 在大鼠體內經代謝產生的主要代謝產物4’-OH-PCB178,大部分也能隨著糞便被排出體外。

分析所有樣品的數據發(fā)現,3-OH-PCB101 和4-OH-PCB101 在心、肺和脾等含血量較高的組織中有較多的蓄積。 同時發(fā)現,2 種OH-PCB101 在消化器官及排出的糞便中的濃度沒有明顯差異,但在血液及腦、心、肺、肝、脾、腎、睪丸及肌肉組織中,4-OHPCB101 的檢出濃度始終高于3-OH-PCB101,且在肝中差異尤為明顯。 OH-PCB101 經血液循環(huán)被運送至肝臟,一方面,4-OH-PCB101 具有與三碘甲狀腺原氨酸的相似結構(圖6),可能與血液中的TH 受體等蛋白結合持留在血液及各組織中[34-35],而3-OH-PCB101 由于結構的不同更易被排出體外;另一方面,肝臟作為代謝外源性物質的主要器官,由于2種 OH-PCB101 結構上存在差異, 推測 3-OHPCB101 可能在肝臟中被P450 酶催化的效率更高,發(fā)生了進一步的代謝轉化,致使3-OH-PCB101 在多個組織中的含量相對較低。 3-OH-PCB101 和4-OHPCB101 在生物體內是否會發(fā)生進一步的代謝轉化及其代謝機制及通路有待進一步研究。

圖6 甲狀腺素與三碘甲狀腺原氨酸的結構式及具有相似結構的OH-PCBs 的結構式對比圖Fig.6 Comparison of the structural formulas of thyroxine, triiodothyronine and OH-PCBs with similar structures

在本研究中,小鼠首次經攝食暴露12 h 后的腦組織中即發(fā)現有4-OH-PCB101 的存在。 有證據顯示,OH-PCB101 能通過與TH 轉運蛋白結合隨血液循環(huán)運送至大腦[23,36-37],與OH-PCBs 導致的TH 紊亂及神經行為異常有關[25,36]。 Miyazaki 等[38]發(fā)現OH-PCBs 能夠通過將TH 受體/視黃醇X 受體二聚體與TH 反應元件的部分分離而減弱TH 受體介導的轉錄,這說明大腦可能是OH-PCBs 的作用靶點。本實驗所采集的不同暴露時間的腦組織中,OHPCB101 的濃度水平相對穩(wěn)定,這可能與OH-PCBs結合的蛋白在血腦屏障兩側達到某種平衡狀態(tài)有關。 心臟和肺中的濃度與血液中的蓄積量呈正相關,隨著時間的延長均呈現下降趨勢。 暴露實驗前期,肝臟中的蓄積濃度較高,并隨時間呈現逐漸降低的趨勢,在168 h 的樣品中檢測到蓄積濃度增大,與消化器官中的濃度變化保持一致。 根據已有的研究,PCBs 等外源化合物在生物體內的代謝轉化主要發(fā)生在肝臟,隨著體內外源化合物濃度的增加,肝臟的負荷也在加重[2,39]。 在本研究中,小鼠通過攝食暴露于OH-PCB101,有可能在其體內發(fā)生了進一步的代謝轉化,這需要開展進一步的實驗加以證明。 腎臟中的濃度在隨著時間的變化始終保持下降趨勢,推測OH-PCB101 通過腎臟等循環(huán)系統(tǒng)存在不斷向體外排出的生理過程。 OH-PCBs 由于—OH 的存在增大了分子的極性,部分蓄積在腎臟中的 OHPCB101 隨著體液循環(huán)被逐漸排出體外[40]。 與腎臟中的蓄積濃度變化規(guī)律相反,暴露期間小鼠睪丸中的蓄積濃度始終保持著增長的狀態(tài),蓄積在睪丸組織中的OH-PCBs 可能與其導致的(抗)雌激素效應及生殖毒性有關。 睪丸組織中富含脂肪,相比于母體化合物,OH-PCBs 的親脂性在—OH 介入后雖有下降,但部分仍能長期滯留在生物體內[41]。

綜上所述,OH-PCB101 通過攝入水產品進入生物體后,一部分在胃、腸等消化器官中蓄積或隨糞便排出體外,另一部分隨營養(yǎng)元素進入血液循環(huán),少量分布在肌肉和睪丸組織中,其余部分可能更傾向于蓄積在心、肺和脾等血液含量較高的組織并可透過血腦屏障進入腦組織。 由此初步推斷ICR 雄性小鼠各組織對OH-PCB101 的蓄積能力大小依次為:大腸＞胃＞小腸＞脾≈肺＞心＞肝＞腎＞血液≈腦＞肌肉≈睪丸。 蓄積過程可能因OH-PCBs 的結構特異性導致與蛋白結合能力及極性強弱存在差異,從而對其在組織中的特異性分布產生影響。 另外,蓄積在生物體內的OH-PCBs 等二代持久性有機污染物,是否會被進一步代謝轉化、產生何種毒性效應以及是否會向子代傳遞并危害子代健康,都是需要研究的科學問題。