王朝南 蘇忠良 董曉敏

骨質(zhì)疏松癥是由多種原因?qū)е鹿敲芏群凸琴|(zhì)量降低，微觀結(jié)構(gòu)破壞致使骨脆性增加、強(qiáng)度降低而容易發(fā)生骨折的一種全身性骨疾病[1]。中藥治療骨質(zhì)疏松癥具有毒副作用小等多方面優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到人們的青睞[2]。研究證實(shí)，杜仲具有抗骨質(zhì)疏松作用，能刺激成骨細(xì)胞增殖，增加骨密度，改善骨質(zhì)流失、骨小梁破壞等癥狀[3]。桃葉珊瑚苷作為中藥杜仲、車(chē)前草等有效成分之一，分布廣泛，屬環(huán)烯醚萜苷類(lèi)，具有多種生物學(xué)活性，包括抗炎、護(hù)肝解毒、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松等作用[4]。本研究旨在探討桃葉珊瑚苷防治骨質(zhì)疏松的作用及可能機(jī)制，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 選擇Wistar 大鼠48 只，雌性，2 個(gè)月齡，體質(zhì)量（225±25）g，SPF 級(jí)，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2005-0061。大鼠自由飲水進(jìn)食，室溫（24±2）℃，相對(duì)濕度50%～70%，12 h 晝夜循環(huán)燈光。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)理審核通過(guò)（wydw2019-0326）。

1.2 主要試劑與儀器 桃葉珊瑚苷（純度98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)B21238）；戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)20201011）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號(hào)H20013036）；堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（BGP）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)分別為ml003415、ml002883）；TRIzol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)15596018）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)K1621）；雙能X 線骨密度儀（美國(guó)Hologic 公司，型號(hào)：Discovery Wi）；實(shí)時(shí)定量PCR 儀（美國(guó)Roche 公司，型號(hào)：9600）；LEICA RM2235 切片機(jī)（德國(guó)LEICA 公司，型號(hào)：RM2235）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及造模 取48 只Wistar 大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為桃葉珊瑚苷高、低劑量組，模型組和假手術(shù)組，每組12 只。所有大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg 進(jìn)行麻醉，其中桃葉珊瑚苷高、低劑量組和模型組雌性大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型，另外12 只大鼠，切開(kāi)腹腔但不切除卵巢作為假手術(shù)組，所有大鼠術(shù)后連續(xù)3 d 肌注青霉素鈉，均給予普通飼料，自由飲食。術(shù)后第4 周開(kāi)始各組分別給藥，模型組和假手術(shù)組腹腔注射生理鹽水（20 mL/kg），桃葉珊瑚苷高劑量組（10 mg/kg）、低劑量組（5 mg/kg）腹腔等量給藥（20 mL/kg），1 次/d，共給藥8 周。

2.2 大鼠血清ALP 和BGP 水平測(cè)定 給藥8 周后，使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，切開(kāi)腹部，暴露腹主動(dòng)脈，使用采血管收集腹主動(dòng)脈血，分離血清，采用ELISA 法檢測(cè)血清中骨形成因子ALP 和BGP 的含量。

2.3 骨密度檢測(cè) 給藥8 周后，銳刀切取大鼠左側(cè)大腿，剔除軟組織，用雙能X 線骨密度儀測(cè)定四組大鼠左股骨骨密度，重置大鼠股骨并反復(fù)測(cè)量3 次，取平均值。

2.4 觀察HE 染色大鼠骨組織形態(tài)表現(xiàn) 將存放在多聚甲醛的大鼠脛骨取出，脫鈣7 d 后用石蠟包埋，切成5 μm 厚的切片。對(duì)切片進(jìn)行HE 染色。封閉好的切片在電子顯微鏡下觀察并收集照片。

2.5 骨組織骨保護(hù)素（OPG）、細(xì)胞核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）mRNA 表達(dá)測(cè)定 給藥8 周后，取大鼠右側(cè)股骨，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照，在實(shí)時(shí)定量PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃5 min；55 ℃30 s；72 ℃4 min，40 個(gè)循環(huán)。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司提供，各基因的引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR 目的基因引物的序列

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 桃葉珊瑚苷對(duì)大鼠血清骨形成因子水平的影響給藥8 周后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清ALP 與BGP 含量均升高（P 均＜0.01）；與模型組比較，桃葉珊瑚苷高劑量組血清ALP 與BGP 含量均降低（P 均＜0.01），但桃葉珊瑚苷低劑量組降低不明顯（P 均＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清ALP 與BGP 含量比較（）

表2 各組大鼠血清ALP 與BGP 含量比較（）

注：桃葉珊瑚苷高劑量組為卵巢切除+桃葉珊瑚苷10 mg/kg 腹腔注射；桃葉珊瑚苷低劑量組為卵巢切除+桃葉珊瑚苷5 mg/kg 腹腔注射；模型組為卵巢切除+生理鹽水腹腔注射；假手術(shù)組為卵巢不切除+生理鹽水腹腔注射；ALP 為堿性磷酸酶；BGP 為骨鈣素；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

3.2 桃葉珊瑚苷對(duì)大鼠骨密度的影響 給藥8 周后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨密度值顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明切除大鼠卵巢制作骨質(zhì)疏松模型成功。與模型組比較，桃葉珊瑚苷高、低劑量組大鼠骨密度值顯著升高（P＜0.01 或P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠股骨骨密度比較（mg/cm2，）

表3 各組大鼠股骨骨密度比較（mg/cm2，）

注：桃葉珊瑚苷高劑量組為卵巢切除+桃葉珊瑚苷10 mg/kg 腹腔注射；桃葉珊瑚苷低劑量組為卵巢切除+桃葉珊瑚苷5 mg/kg 腹腔注射；模型組為卵巢切除+生理鹽水腹腔注射；假手術(shù)組為卵巢不切除+生理鹽水腹腔注射；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3.3 桃葉珊瑚苷對(duì)大鼠骨組織形態(tài)的影響 給藥8周后，假手術(shù)組股骨骨小梁排列緊密，成骨結(jié)構(gòu)完好，模型組中骨小梁稀疏，少于假手術(shù)組，其結(jié)構(gòu)排列不規(guī)則，可見(jiàn)連接斷裂；桃葉珊瑚苷高劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)緊密，連續(xù)性較好，相對(duì)于高劑量組，低劑量組骨小梁骨偏少、偏稀，見(jiàn)圖1。

圖1 四組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)觀察（HE 染色，10×10）

3.4 桃葉珊瑚苷對(duì)大鼠骨組織OPG、RANKL mRNA表達(dá)的影響 給藥8 周后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨組織OPG mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01），而RANKL mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，桃葉珊瑚苷高、低劑量組大鼠OPG mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01 或P＜0.05），而RANKL mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠骨組織OPG、RANKL mRNA 表達(dá)水平比較（）

表4 各組大鼠骨組織OPG、RANKL mRNA 表達(dá)水平比較（）

注：桃葉珊瑚苷高劑量組為卵巢切除+桃葉珊瑚苷10 mg/kg 腹腔注射；桃葉珊瑚苷低劑量組為卵巢切除+桃葉珊瑚苷5 mg/kg 腹腔注射；模型組為卵巢切除+生理鹽水腹腔注射；假手術(shù)組為卵巢不切除+生理鹽水腹腔注射；OPG 為骨保護(hù)素；RANKL 為細(xì)胞核因子κB 受體活化因子配體；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

4 討論

目前我國(guó)逐漸步入老年化社會(huì)，骨質(zhì)疏松是老年患者致殘和致死的主要原因之一，對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生重大影響[5]。目前治療骨質(zhì)疏松的西藥很多，如雙磷酸鹽類(lèi)、降鈣素類(lèi)、甲狀旁腺激素、骨硬化素抗體等[6]。經(jīng)過(guò)治療后，骨質(zhì)疏松患者總體生存率有所提升，但不良反應(yīng)（如心腦血管疾病、非典型骨折和骨肉瘤等）的發(fā)生率也相應(yīng)升高[7-8]。近年來(lái)，中藥在治療骨質(zhì)疏松方面因具有“標(biāo)本兼顧”、毒副作用小、取材方便等優(yōu)勢(shì)，而逐漸得到臨床認(rèn)可[9]。桃葉珊瑚苷是多種中草藥的活性成分之一，具有護(hù)肝解毒、抗氧化、抗炎、抗骨質(zhì)疏松等藥理學(xué)作用，有較好的利用價(jià)值[10]。研究證實(shí)，桃葉珊瑚苷通過(guò)促進(jìn)成骨作用和抑止破骨細(xì)胞活性產(chǎn)生抗骨質(zhì)疏松的效應(yīng)[11]。

骨密度是衡量骨質(zhì)疏松程度及骨量變化的重要指標(biāo)[12]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥8 周后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨密度值顯著降低，顯示大鼠骨質(zhì)疏松建模成功。與模型組比較，桃葉珊瑚苷高、低劑量組骨密度值升高，證實(shí)了桃葉珊瑚苷能夠促進(jìn)骨形成。血清ALP 及BGP 主要由骨細(xì)胞分泌，在骨的礦化過(guò)程中起到關(guān)鍵性的作用，去勢(shì)大鼠由于雌激素的缺乏而代償性增加ALP 和BGP 的分泌[13-14]。模型組血清ALP 與BGP 含量明顯高于假手術(shù)組，與骨密度呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證明模型組骨質(zhì)疏松模型制作成功。給藥8 周后桃葉珊瑚苷高、低劑量組比模型組大鼠骨密度增加，而ALP 與BGP 降低，骨密度和ALP 及BGP 有負(fù)相關(guān)性，且病理結(jié)果顯示桃葉珊瑚苷高劑量組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)緊密，連續(xù)性較好，說(shuō)明桃葉珊瑚苷具有促進(jìn)骨形成、防止骨質(zhì)丟失作用。

OPG/RANKL/RANK 信號(hào)通路是介導(dǎo)骨吸收和骨形成平衡的重要信號(hào)通路[15]。為了探討桃葉珊瑚苷是否通過(guò)OPG/RANKL/RANK 通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化以影響骨代謝，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射桃葉珊瑚苷8 周后，桃葉珊瑚苷高劑量組上調(diào)OPG mRNA 表達(dá)，下調(diào)RANKL mRNA 表達(dá)，其通過(guò)調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK 信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的相互作用，可達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的。

綜上所述，桃葉珊瑚苷能夠促進(jìn)骨形成，減緩骨丟失，其機(jī)制可能通過(guò)OPG/RANKL/RANK 系統(tǒng)發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松作用，相關(guān)機(jī)制有待深入研究。