方帥帥 袁馬馳

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家中的發(fā)病率始終居高不下[1]。在我國(guó)，由于缺乏早期檢測(cè)，50%的CRC 患者確診時(shí)已是中晚期，導(dǎo)致部分患者錯(cuò)失了最佳的根治機(jī)會(huì)[2]。研究表明，CRC 中的關(guān)鍵基因可作為其診斷、預(yù)防和治療的分子標(biāo)志物，并且能夠揭示CRC 的發(fā)病機(jī)制[3]。脯氨酰4-羥化酶α-3（prolyl 4-hydroxylase alpha 3，P4HA3）基因在CRC中發(fā)揮重要作用，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法探究P4HA3 與CRC 的進(jìn)展及預(yù)后的相關(guān)性，并通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在探討P4HA3 基因在CRC 進(jìn)展及不良預(yù)后中的作用，為CRC 治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 P4HA3（批號(hào)PA5-52483）和山羊抗兔IgG（批號(hào)A16116）購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑（批號(hào)35000）購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；石蠟（批號(hào)YA0012）、PBS 緩沖液（批號(hào)P1022）、抗原修復(fù)液（批號(hào)C1035）、DAB 顯色（批號(hào)DA1010）和蘇木素（批號(hào)H8070）購(gòu)于北京Solarbio 公司。

1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源 從The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載CRC 的基因數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，含有647例CRC 患者腫瘤組織和51 例癌旁組織（距腫瘤組織5 cm 以上）。

1.3 P4HA3 基因表達(dá)數(shù)據(jù)的獲取 應(yīng)用R 軟件BiocManager 及l(fā)imma 提取P4HA3 表達(dá)數(shù)據(jù)，并提取P4HA3 在CRC 組織及其對(duì)應(yīng)正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)[4]。然后，利用R 軟件對(duì)P4HA3 表達(dá)數(shù)據(jù)及配對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析[5]。

1.4 P4HA3 基因與臨床病理特征預(yù)后分析 卡方檢驗(yàn)研究P4HA3 的表達(dá)與年齡、性別、Stage、T、N 和M 分期等CRC 臨床特征的關(guān)聯(lián)。

1.5 P4HA3 基因的生存分析 將P4HA3 基因表達(dá)及臨床病理數(shù)據(jù)與患者生存數(shù)據(jù)整合，利用R 軟件的survival 包進(jìn)行生存分析，獲得P4HA3 基因?qū)颊呱鏍顟B(tài)的影響并作生存曲線進(jìn)行可視化分析[6]。

1.6 P4HA3 基因表達(dá)與生存分析的驗(yàn)證 利用基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profile interaction，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）對(duì)P4HA3 基因進(jìn)行表達(dá)與生存分析。

1.7 P4HA3 基因的單基因富集分析 利用Perl 軟件整理所需的P4HA3 基因表達(dá)數(shù)據(jù)集及表型數(shù)據(jù)，并采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）軟件（http://software.broad-institute.org/gsea）對(duì)P4HA3 基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.8 免疫組化分析 收集2020 年6 月至2021 年6月杭州市第三人民醫(yī)院病理科30 例CRC 患者手術(shù)切除腫瘤和癌旁組織蠟塊樣本進(jìn)行回顧性分析，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)（倫理批號(hào)：2021KA040）。手工染色檢測(cè)CRC 和癌旁組織中P4HA3 蛋白表達(dá)。經(jīng)石蠟切片脫蠟水化、抗原修復(fù)、滴加阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、一抗P4HA3（1∶100）室溫反應(yīng)60 min、復(fù)溫和二抗山羊抗兔IgG 室溫反應(yīng)20 min，最后DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、脫水封片和顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 P4HA3 基因在CRC 中的表達(dá) 本文基于TCGA-CRC 數(shù)據(jù)對(duì)P4HA3 在CRC 中的表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與51 例癌旁組織相比，P4HA3 在647 例CRC 組織中高表達(dá)（P＜0.01，見(jiàn)圖1A）。其中，50 例的癌旁組織和腫瘤組織樣本為配對(duì)樣本。進(jìn)一步對(duì)P4HA3 基因在配對(duì)的CRC 腫瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，P4HA3 在CRC 組織高表達(dá)（P＜0.01，見(jiàn)圖1B）。

圖1 P4HA3 基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)

2.2 P4HA3 基因與臨床病理相關(guān)性分析 去除臨床數(shù)據(jù)不完整和生存時(shí)間小于30 d 的樣本數(shù)據(jù)，剩余538 個(gè)CRC 組織樣本，按P4HA3 在CRC 中表達(dá)中位數(shù)（0.47）分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。不同臨床特征與P4HA3 表達(dá)的關(guān)系見(jiàn)表1，結(jié)果顯示，P4HA3表達(dá)與CRC 患者Stage 分期（χ2=9.970，P＜0.05）、T 分期（χ2=10.040，P＜0.05）和N 分期（χ2=15.270，P＜0.05）具有相關(guān)性，但與CRC 患者年齡、性別和M 分期無(wú)關(guān)（P＞0.05）。

2.3 P4HA3 基因生存分析 對(duì)P4HA3 基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示與P4HA3 低表達(dá)的CRC 患者相比，P4HA3 高表達(dá)的患者生存時(shí)間明顯縮短（見(jiàn)圖2），P4HA3 高表達(dá)與CRC 患者的不良預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。

2.4 P4HA3 基因的GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證 利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)檢驗(yàn)P4HA3 基因在CRC 中的作用。與癌旁組織相比，P4HA3 基因在CRC 樣本中高表達(dá)（見(jiàn)圖3A）。P4HA3 基因與Stage 分期呈正相關(guān)（見(jiàn)圖3B），并且P4HA3 與CRC 患者不良預(yù)后相關(guān)（P＜0.05，見(jiàn)圖3C、D），與TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致。

2.5 P4HA3 基因的KEGG 通路富集分析 利用GSEA 對(duì)P4HA3 進(jìn)行KEGG 通路富集分析，結(jié)果見(jiàn)表2（FDR＜0.05），P4HA3 基因主要富集到MAPK 信號(hào)通路、TGF-β 信號(hào)通路、WNT 信號(hào)通路、TOLL 樣受體信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路和VEGF 信號(hào)通路等，且這些信號(hào)通路與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

表2 P4HA3 基因的KEGG 通路富集分析部分結(jié)果

2.6 P4HA3 基因的臨床驗(yàn)證 本研究通過(guò)免疫組化對(duì)P4HA3 基因在CRC 組織中的表達(dá)進(jìn)行臨床驗(yàn)證。免疫組化結(jié)果顯示，癌旁組織顏色較淡或幾乎無(wú)染色；而CRC 腫瘤組織均大量分布且呈現(xiàn)黃色或棕褐色染色顆粒。顏色越深，P4HA3 蛋白表達(dá)越高。免疫組化典型圖片見(jiàn)圖4A 和B（分別為癌旁組織和腫瘤組織）。

圖4 免疫組化檢測(cè)P4HA3 蛋白（200×）

3 討論

CRC 是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高[7]。CRC 患者的治療方式主要有手術(shù)、化療和放療等，但這些治療方式對(duì)晚期患者療效有限[8]。研究發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)志物在CRC 患者的預(yù)后評(píng)估中可發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]，有助于CRC 患者的診斷、預(yù)后和治療[10]。

P4H 是維持膠原穩(wěn)定性的必需酶，P4H 是一個(gè)α2β2 四聚體，其P4HA 是酶的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域[11]。P4HA 的異常調(diào)節(jié)與一系列的病理過(guò)程有關(guān)，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12]。P4HA 亞型包含P4HA1、P4HA2和P4HA3，而P4HA3 在正常組織中的表達(dá)非常低[13]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)P4HA3 作為多種腫瘤的致癌基因，與腫瘤生長(zhǎng)和生存期較差呈正相關(guān)[14]。然而，P4HA3 在CRC 中的作用尚未進(jìn)行研究。因此，探討P4HA3 基因在CRC 的進(jìn)展及預(yù)后中的作用具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，P4HA3 在CRC 腫瘤組織高表達(dá)，并且與CRC 患者的Stage、T 和N 分期顯著相關(guān)，表明P4HA3 參與CRC 的發(fā)生發(fā)展。本研究通過(guò)生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)P4HA3 的CRC 患者總生存時(shí)間明顯縮短，這表明P4HA3 與CRC 的不良預(yù)后密切相關(guān)。KEGG 通路富集分析結(jié)果表明，P4HA3 基因主要富集到MAPK 信號(hào)通路、TGF-β 信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路和JAK-STAT 信號(hào)通路等信號(hào)通路上。這些通路與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，且P4HA3 可能通過(guò)激活這些信號(hào)通路進(jìn)而參與調(diào)控CRC 進(jìn)展。同時(shí)，有研究顯示P4HA3 是一種膠原修飾酶基因，P4HA3 與乳腺癌預(yù)后及胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)[15-16]。P4HA3 在垂體腺瘤中表達(dá)上調(diào)，并且會(huì)促進(jìn)垂體腺瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[17]。這些報(bào)道與我們的研究結(jié)果P4HA3 基因在CRC 患者中發(fā)揮重要作用具有一致性。

此外，本研究還通過(guò)免疫組化分析對(duì)P4HA3 在CRC 腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)進(jìn)行回顧性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)P4HA3 在癌旁組織中低表達(dá)，而P4HA3 在CRC 組織中高表達(dá)。進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，揭示了P4HA3 基因在CRC 的進(jìn)展及預(yù)后中的重要作用。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)和免疫組化分析驗(yàn)證了P4HA3 基因與CRC 的進(jìn)展及不良預(yù)后顯著相關(guān)。深入分析表明P4HA3 基因可作為CRC預(yù)后的分子標(biāo)志物，有望成為CRC 患者新的治療靶點(diǎn)，P4HA3 基因在CRC 中的作用機(jī)制值得深入探究。