畢珺輝，楊悅，楊育同，陳宜瑤，舒曉葳，馮玉華*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030000)

腸易激綜合征(Diarrhea Irritable Bowel Syndrome，IBS-D)是一種功能性胃腸道疾病，其癥狀是反復(fù)腹痛并伴有大便性狀及排便頻率的改變，腸易激綜合征的病因尚未明確，但“腦-腸軸”功能紊亂會(huì)導(dǎo)致內(nèi)臟高敏反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，這可能是導(dǎo)致腸易激綜合征的原因之一[1]。腦腸肽是一種在腦和胃腸道中雙重分布的肽類，是連接中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的橋梁，也是“腦-腸軸”信號(hào)傳導(dǎo)功能實(shí)現(xiàn)的重要基礎(chǔ)。5-羥色胺是腦腸肽中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其含量變化與腸易激綜合征的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾失健運(yùn)，運(yùn)化失司，水液輸布不暢則易產(chǎn)生濕濁痰瘀；水谷精微運(yùn)化不及則有食積，氣機(jī)不暢，則會(huì)導(dǎo)致腸道功能紊亂。升陽(yáng)益胃湯來(lái)源于李杲之《內(nèi)外傷辨惑論》，乃補(bǔ)中益氣湯以白芍易當(dāng)歸、防風(fēng)易升麻，再加茯苓、半夏、羌活、獨(dú)活、澤瀉、黃連而成，較之補(bǔ)中益氣湯在補(bǔ)氣升陽(yáng)之中又增除濕清熱之效，故宜于脾胃虛弱，清陽(yáng)不升，濕郁生熱之證。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型，觀察各組大鼠結(jié)腸及下丘腦組織中5-HT的含量變化，探討升陽(yáng)益胃湯對(duì)IBS-D大鼠5-HT含量的影響，從而為升陽(yáng)益胃湯之藥物運(yùn)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 主要材料及儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黑)2018-003，給予充足飲食及飲水，在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑

升陽(yáng)益胃湯中藥飲片(黃芪、半夏、人參、甘草、獨(dú)活、防風(fēng)、白芍、羌活、橘皮、茯苓、柴胡、澤瀉、白術(shù)、黃連)及番瀉葉購(gòu)于北京同仁堂;匹維溴銨(批號(hào)：713056，規(guī)格50 mg/片，MYLAN LABORATORIES SAS)；RAT 5-HT ELISA KIT 96Tests酶聯(lián)免疫試劑盒(Biotopped Cat No.EL02905 Lot:2021/08);無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);HE染液套裝(Servicebio);中性樹(shù)膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 主要儀器

洗板機(jī)(芬蘭Thermo Labsystems，儀器型號(hào)：AC8);酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS，儀器型號(hào)：352型);離心機(jī)(微量高速離心機(jī)，儀器型號(hào)：TG16W);培養(yǎng)箱(隔水式恒溫培養(yǎng)箱，儀器型號(hào)：GNP-9080型);脫水機(jī)(DIAPATH);包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司);凍臺(tái)(武漢俊杰電子有限公司);組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);染色機(jī)(DIAPATH);烤箱(天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司);載玻片(Servicebio);正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)、成像系統(tǒng)(日本尼康)。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 升陽(yáng)益胃湯中藥飲片制備

升陽(yáng)益胃湯中藥飲片依照原方用法用量磨成粗粉，加8倍水，將藥物用紗布包裹煎煮30 min后過(guò)濾藥液，濃縮成1.35 g/kg、2.7 g/kg、5.4 g/kg的藥液，于4 ℃冰箱中存放備用[2]。

2.1.2 匹維溴銨陽(yáng)性對(duì)照藥制備

將匹維溴銨片碾碎，加蒸餾水配制成0.018 g/kg的藥液，放入4 ℃冰箱中備用。

2.1.3 番瀉葉的制備

番瀉葉粗粉中加入8倍100 ℃水浸泡30 min，濾出藥液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至0.45 g/mL[3-4]。

2.2 IBS-D動(dòng)物模型復(fù)制

每日9∶00 am，除空白組外，其余大鼠均用0.45 g/mL濃度的番瀉葉浸出液進(jìn)行灌胃給藥，灌胃量為10 mL/kg，灌胃1 h后，使用6.5 cm寬的醫(yī)用膠帶自大鼠前胸起纏繞一周以固定其前爪及項(xiàng)后背部，從而束縛大鼠，使大鼠前肢不能隨意活動(dòng)，抓撓面部，但不妨礙大鼠正常走動(dòng)，在大鼠束縛過(guò)程中，保證其始終處于束縛狀態(tài)，若掙脫束縛，則立即重新用醫(yī)用膠帶固定，束縛時(shí)間持續(xù)1 h，束縛的同時(shí)使用夾尾夾夾尾刺激，刺激持續(xù)15 min，刺激結(jié)束后，將各組大鼠分別放回鼠籠，保證飲水及食物充足，造模持續(xù)2周，造模過(guò)程中對(duì)大鼠一般情況進(jìn)行觀察[5-6]。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

造模成功后，將模型組大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法[7-8]分為模型組、升陽(yáng)益胃湯高劑量組、升陽(yáng)益胃湯中劑量組、升陽(yáng)益胃湯低劑量組、陽(yáng)性藥對(duì)照組，另設(shè)空白組，每組10只。造模結(jié)束后于每日固定時(shí)間進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)給藥2周，模型組及空白組給予等體積的生理鹽水。

2.4 樣本采集

樣本采集前禁食不禁水18 h，末次給藥后1 h用水合氯醛麻醉大鼠，選取大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸約2 cm，將其一分為二，一份置于液氮中保存，另一份于4%多聚甲醛中存儲(chǔ)。斷頭取腦，在冰盤(pán)上剝離出下丘腦，放入液氮中暫存。液氮中的組織隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。

2.5 大鼠一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后觀測(cè)大鼠精神狀態(tài)，皮毛顏色、進(jìn)食飲水、排便等一般情況，并于造模前、給藥前、給藥后測(cè)量大鼠體質(zhì)量。

2.6 腹壁撤退反射

參照AWR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，給藥結(jié)束后對(duì)大鼠進(jìn)行內(nèi)臟敏感性評(píng)價(jià)。測(cè)量腹壁撤退反射前18 h禁食不禁水，用大小合適的透明容器限制大鼠運(yùn)動(dòng)。

(1)準(zhǔn)備血壓計(jì)、5 mL注射器，將注射器與血壓計(jì)連接，用注射器向血壓計(jì)內(nèi)注氣，記下80 mmHg、60 mmHg、40 mmHg、20 mmHg不同壓力下注射器對(duì)應(yīng)刻度。

(2)將注射器與兒童用8F導(dǎo)尿管相連，導(dǎo)尿管中用注射器注氣，達(dá)到相應(yīng)刻度時(shí)，壓強(qiáng)為導(dǎo)尿管前端球囊內(nèi)的壓力。

(3)導(dǎo)尿管涂上石蠟油以保持潤(rùn)滑，從大鼠肛門插入約6 cm，在大鼠肛門外1 cm處，將導(dǎo)尿管與大鼠尾根部用醫(yī)用膠帶固定在一起。然后將大鼠放在透明容器中，待其保持平靜狀態(tài)一段時(shí)間后，用注射器向?qū)蚬軆?nèi)充氣，隨著壓力的不斷增強(qiáng)，觀察每只大鼠的腹壁對(duì)8F導(dǎo)尿管前端氣囊擴(kuò)張刺激的反應(yīng)程度。

每只大鼠測(cè)3次，每次間隔5 min[9]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為大鼠在不同壓力刺激下的反應(yīng)程度：0分，對(duì)刺激無(wú)明顯行為反應(yīng)；1分，身體保持不動(dòng)，但頭部出現(xiàn)短暫運(yùn)動(dòng)；2分，腹部肌肉未離底面，但呈收縮狀態(tài)；3分，腹部肌肉抬離底面，腹肌收縮；4分，身體呈弓形狀態(tài)，骨盆抬起[3]。

2.7 ELISA法測(cè)定大鼠結(jié)腸、下丘腦中5-HT含量

于-80 ℃冰箱中將組織取出，室溫下解凍，用PBS沖洗干凈后，用濾紙吸干多余液體，將組織剪碎，在冰浴條件下，用勻漿機(jī)將組織進(jìn)一步粉碎，勻漿液離心取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明測(cè)定大鼠結(jié)腸、下丘腦中5-HT的含量。

2.8 HE染色觀察大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)

結(jié)腸組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，固定狀態(tài)良好后，嚴(yán)格按照程序進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片、鏡檢。在顯微鏡下瀏覽切片，在不同倍數(shù)下詳細(xì)觀察組織切片情況，對(duì)切片中基本病理改變?nèi)绯溲?、瘀血、出血、水腫、變性、壞死、增生、纖維化、機(jī)化、肉芽組織、炎性變化等情況進(jìn)行觀察。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 升陽(yáng)益胃湯對(duì)IBS-D大鼠體質(zhì)量的影響

空白組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，精神狀態(tài)良好，皮毛光澤順滑，進(jìn)食飲水均保持正常水平。模型組大鼠在造模期間表現(xiàn)出攻擊性，反抗強(qiáng)烈，造模后精神狀況較差，對(duì)刺激敏感，經(jīng)常蜷縮抱團(tuán)，進(jìn)食、飲水與空白組相比有所減少。造模前，兩組大鼠體質(zhì)量相差不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，與空白組大鼠比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模前后各組大鼠體質(zhì)量變化見(jiàn)表1。

表1 造模前后各組大鼠體質(zhì)量變化

藥物干預(yù)前，各組大鼠體質(zhì)量與空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；藥物干預(yù)后，陽(yáng)性藥組及升陽(yáng)益胃湯各劑量組大鼠精神狀態(tài)轉(zhuǎn)好，進(jìn)食、飲水情況較藥物干預(yù)前有所好轉(zhuǎn)，模型組大鼠體質(zhì)量與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陽(yáng)性藥及升陽(yáng)益胃湯各劑量組與模型組比較體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 藥物干預(yù)前后各組大鼠體質(zhì)量變化

3.2 腹壁撤退反射情況

藥物干預(yù)結(jié)束后，與模型組相比，升陽(yáng)益胃湯高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥對(duì)照組在不同壓力下的腹壁撤退反射評(píng)分均有所下降。在20 mmHg壓力下，各給藥組腹壁撤退反射評(píng)分低于模型組，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.094>0.05)；球囊壓力在40 mmHg時(shí)，升陽(yáng)益胃湯低劑量組的腹壁撤退反射評(píng)分低于模型組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.053>0.05)。除此之外，在40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg壓力下，各給藥組的腹壁撤退反射評(píng)分均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示各給藥組能夠有效減輕IBS-D大鼠的內(nèi)臟高敏情況，見(jiàn)表3。

表3 藥物干預(yù)后各組大鼠AWR評(píng)分變化分)

3.3 升陽(yáng)益胃湯對(duì)IBS-D大鼠結(jié)腸及下丘腦5-HT的影響

模型組大鼠結(jié)腸及下丘腦組織中5-HT含量與空白組比較顯著升高(P<0.05)。各給藥組大鼠結(jié)腸及下丘腦組織中5-HT含量與模型組比較顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 升陽(yáng)益胃湯對(duì)IBS-D大鼠結(jié)腸及下丘腦5-HT含量的影響

3.4 升陽(yáng)益胃湯對(duì)IBS-D大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

空白組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，各層組織結(jié)構(gòu)分明，上皮細(xì)胞無(wú)明顯變化，無(wú)異常病理學(xué)改變；模型組固有層腺體數(shù)量豐富，排列緊密，間質(zhì)可見(jiàn)較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)其他病理學(xué)改變；陽(yáng)性對(duì)照組黏膜上皮完整，未見(jiàn)明顯的上皮細(xì)胞變性、壞死和脫落，間質(zhì)可見(jiàn)較多的淋巴細(xì)胞，部分淋巴管充滿淋巴細(xì)胞，黏膜下層和肌層未見(jiàn)明顯異常。升陽(yáng)益胃湯低劑量組未見(jiàn)明顯的上皮細(xì)胞變性、壞死和脫落，底部杯狀細(xì)胞含量豐富，間質(zhì)可見(jiàn)少量的淋巴細(xì)胞；升陽(yáng)益胃湯中劑量組固有層腺體數(shù)量豐富，排列緊密，間質(zhì)可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞，無(wú)其他病理學(xué)改變；升陽(yáng)益胃湯高劑量組無(wú)異常病理學(xué)改變；固有層腺體數(shù)量豐富，排列緊密，間質(zhì)可見(jiàn)少量的淋巴細(xì)胞；各組大鼠結(jié)腸黏膜下層和肌層均未見(jiàn)明顯異常，無(wú)病理學(xué)改變，符合腹瀉型腸易激綜合征病理特點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

注：A1、A2空白組；B1、B2模型組；C1、C2升陽(yáng)益胃湯低劑量組；D1、D2升陽(yáng)益胃湯中劑量組； E1、E2升陽(yáng)益胃湯高劑量組；F1、F2陽(yáng)性對(duì)照組。圖1 各組大鼠對(duì)腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)影響

4 討論

腸易激綜合征是一種慢性功能性胃腸道疾病，其特征是腹痛、排便習(xí)慣改變、腹瀉或便秘，但在顯微鏡觀察下無(wú)器質(zhì)性病變，雖然IBS為非致命性疾病，但由于其具有難治愈、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，IBS仍然給患者日常生活帶來(lái)巨大影響。有研究指出，患有腸易激綜合征的人群會(huì)嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，降低工作效率，更容易產(chǎn)生疲勞感[11-12]。IBS的病因還未明確，但腸-腦互動(dòng)異常、內(nèi)臟高敏感性、胃腸道動(dòng)力異常、腸道低度炎癥等是其可能的發(fā)病機(jī)制[10]。現(xiàn)代研究認(rèn)為[13]，“腦-腸軸”間的雙向信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)是致病機(jī)制之一?！澳X-腸軸”雙向信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)，由神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫因素介導(dǎo)，并由心理社會(huì)因素調(diào)節(jié)，共同成為了IBS發(fā)生發(fā)展的重要因素?！澳X-腸軸”的信號(hào)傳導(dǎo)離不開(kāi)腦腸肽，腦腸肽是一類小分子的肽類物質(zhì)，同時(shí)分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸神經(jīng)系統(tǒng)，由于腦腸肽雙重分布的特性，腦-腸之間實(shí)現(xiàn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸效應(yīng)細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)。5-HT廣泛分布于胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在外周神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮重要作用。5-HT系統(tǒng)功能障礙會(huì)導(dǎo)致胃腸動(dòng)力異常及內(nèi)臟敏感性增加，5-HT濃度升高時(shí)會(huì)增加腸道蠕動(dòng)頻率和內(nèi)臟敏感性[14-15]。

中醫(yī)認(rèn)為IBS的發(fā)病與情志失調(diào)、飲食不節(jié)、感受外邪密切相關(guān)，病位在腸，與肝、脾(胃)等臟腑相關(guān)。脾主運(yùn)化水濕，脾虛納運(yùn)乏力，水液輸布不暢則會(huì)產(chǎn)生濕濁痰瘀；水谷精微運(yùn)化不及，則飲食不化而形成食積；氣機(jī)不暢則致腸道功能紊亂；肝失疏泄，橫逆犯脾，脾氣不升則有泄瀉；腑氣通降不利則有腹痛、腹脹。

升陽(yáng)益胃湯來(lái)源于李杲之《內(nèi)外傷辨惑論》，乃補(bǔ)中益氣湯以白芍易當(dāng)歸、防風(fēng)易升麻，再加茯苓、半夏、羌活、獨(dú)活、澤瀉、黃連而成。加茯苓、澤瀉、半夏，以助除濕和胃之效；加羌活、獨(dú)活，可祛浸淫肌肉筋骨之濕；加黃連，能清中焦之濕熱；用白芍，以其既有當(dāng)歸養(yǎng)血之能，又因酸收而可防諸辛散藥耗氣之虞；用防風(fēng)，取其既有升麻升發(fā)脾氣之功，又兼祛風(fēng)勝濕之用，較之補(bǔ)中益氣湯在補(bǔ)氣升陽(yáng)之中又增除濕清熱之效，故宜于脾胃虛弱，清陽(yáng)不升，濕郁生熱之證。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明升陽(yáng)益胃湯各劑量組均可提高IBS-D大鼠體質(zhì)量，改善腹瀉癥狀，降低內(nèi)臟敏感性，保護(hù)IBS-D大鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)，降低IBS-D大鼠結(jié)腸及下丘腦組織中5-HT的含量，其作用呈劑量依賴性。其中，升陽(yáng)益胃湯高劑量組效果優(yōu)于各給藥組，其作用機(jī)制可能是通過(guò)降低結(jié)腸及下丘腦組織中5-HT的含量從而改善腦腸肽的異常分泌，使“腦-腸軸”信號(hào)傳導(dǎo)功能恢復(fù)正常、內(nèi)臟敏感性降低而實(shí)現(xiàn)的。但5-HT是獨(dú)自發(fā)揮作用還是與其他胺類介質(zhì)如腎上腺素、多巴胺發(fā)生拮抗或激動(dòng)作用仍需進(jìn)一步研究。