陶菊紅 侯彬彬 周偉 沈宗根 陸勤勤 朱建一 張濤

摘要：通過對光合色素及葉綠素?zé)晒鉁y定，研究了條斑紫菜“蘇通2號(hào)”自由絲狀體在不同光照度下光合生理特征。結(jié)果表明，隨著光照度的上升，樣品藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白含量均呈下降趨勢，且高光照度處理組要顯著低于低光照度處理組，葉綠素a的變化與藻膽蛋白相似。藻紅蛋白/葉綠素a（PE/Chl a）和藻藍(lán)蛋白/葉綠素a（PC/Chl a）比值隨處理光照度上升而下降，但別藻藍(lán)蛋白/葉綠素a（APC/Chla）未有明顯變化。高光照度處理組樣品最大量子效率（Fv/Fm）顯著低于低光照度處理組，且較低光照度處理組樣品實(shí)際量子效率（ΔF/Fm′）日變化高于高光照度處理組?？焖俟馇€參數(shù)中，初始斜率（α）、最大相對電子傳遞速率（rETRmax）均隨光照度上升而下降，而半飽和光照度（Ik）差異不明顯。光化學(xué)猝滅（qP）參數(shù)隨光照度上升而降低，而非光化學(xué)猝滅（NPQ）結(jié)果與之相反。本研究提示，條斑紫菜“蘇通2號(hào)”絲狀體在較低的光照度下表現(xiàn)出活躍的生理狀態(tài)，并能通過調(diào)節(jié)吸收光能分配以適應(yīng)較高的光照度，這為該品種自由絲狀體高效培養(yǎng)的環(huán)境設(shè)定提供基礎(chǔ)參考。

關(guān)鍵詞：條斑紫菜;自由絲狀體;光照度;光能利用

中圖分類號(hào)：S968.43+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）12-0145-05

收稿日期：2021-09-10

基金項(xiàng)目：江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（紫菜）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：JATS[2020]464）。

作者簡介：陶菊紅（1981—），女，江蘇蘇州人，博士，農(nóng)藝師，主要從事植物學(xué)研究。E-mail：taojuhong@126.com。

通信作者：張 濤，博士，副研究員，主要從事植物學(xué)研究。E-mail：zhangtofy@163.com。

紫菜（Pyropia）是一類原始大型紅藻，其經(jīng)濟(jì)種類條斑紫菜是我國長江以北黃海沿海區(qū)域的重要栽培海藻[1]。紫菜具有明顯的2個(gè)生長世代，葉狀體（配子體）為宏觀世代，絲狀體（孢子體）屬微觀世代，2個(gè)生活世代外觀形態(tài)完全不同[2-3]，而且生長環(huán)境也有明顯差別。葉狀體世代主要生長期是10月至次年4月，絲狀體世代主要生長期是4月至10月，生產(chǎn)上絲狀體世代的培養(yǎng)被認(rèn)為是種苗培育階段[4-5]。

條斑紫菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與其獨(dú)特的生物學(xué)特征密切相關(guān)，這表現(xiàn)在育種及種苗絲狀體培育等多個(gè)方面。條斑紫菜育種由早期通過產(chǎn)量、形態(tài)選育的傳統(tǒng)育種途徑逐步發(fā)展到多種育種技術(shù)組合應(yīng)用[6-7]，作為一種原始紅藻，其誘變后能夠獲得較適合的突變率，結(jié)合無性生殖和無配生殖等生物學(xué)特點(diǎn)，我國近年培育出適用于黃海海區(qū)的條斑紫菜新品種“蘇通”系列。在新品種的應(yīng)用方面，需要有配套的生產(chǎn)技術(shù)以充分發(fā)揮其優(yōu)良性狀，其中，種苗培育技術(shù)尤為關(guān)鍵。隨著全球氣候變化及生產(chǎn)需求，良種種苗由傳統(tǒng)的果孢子采苗轉(zhuǎn)變?yōu)楣咦咏Y(jié)合自由絲狀體組合方式，這一變化突出了自由絲狀體培養(yǎng)的重要性，因此，如何培養(yǎng)獲得足夠生物量的良種自由絲狀體成為種苗培育的關(guān)鍵。

絲狀體作為紫菜的微觀世代，其培養(yǎng)過程多是在室內(nèi)進(jìn)行，其中，光照度、溫度等是影響絲狀體生長的重要環(huán)境因子，以往的研究也表明，環(huán)境條件的改變能夠影響絲狀體的形態(tài)及生物量[8-11]。光合作用與紫菜生物活性有密切關(guān)系，光合生理能夠及時(shí)反映出紫菜生長狀態(tài)，在光合生理研究中，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)因快速、準(zhǔn)確、無損傷等特點(diǎn)，已成為環(huán)境因子對光合作用影響機(jī)制研究中的必備技術(shù)[12-13]。有研究表明，紫菜偏向較低光強(qiáng)的適應(yīng)性[14]，但針對不同生產(chǎn)種質(zhì)的光適應(yīng)能力研究尚有不足。本研究以條斑紫菜“蘇通2號(hào)”品種為材料，通過光合色素、葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定，分析光照度對其絲狀體光合生理的影響，旨在深入了解該品種的光適應(yīng)機(jī)制，并為開發(fā)出配套高效絲狀體培養(yǎng)技術(shù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及光照度處理

條斑紫菜“蘇通2號(hào)”為常熟理工學(xué)院和江蘇省海洋水產(chǎn)研究所共同育成的國家紫菜新品種，試驗(yàn)用自由絲狀體取自國家級(jí)紫菜種質(zhì)庫，光照試驗(yàn)于2021年4月在常熟理工學(xué)院蘇州應(yīng)用藻類學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

選擇生長狀態(tài)良好的自由絲狀體，使用破壁機(jī)進(jìn)行處理，將藻體打碎至約100 μm長度，過濾后加入新鮮高溫滅菌海水，放置在20 ℃、20 μmol/（m2·s）左右光照度下培養(yǎng)48 h后用于光照處理，期間更換1次滅菌海水。

1.2 試驗(yàn)條件

設(shè)定4個(gè)光照度，35、70、110、150 μmol/（m2·s），光—暗周期12 h—12 h，溫度20 ℃，每個(gè)光照度設(shè)3組平行試驗(yàn)，處理周期為7 d，在培養(yǎng)5 d時(shí)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定，7 d時(shí)進(jìn)行光合色素含量測定。

1.3 葉綠素?zé)晒鉁y定

1.3.1 最大量子效率（Fv/Fm）測定 光照處理 5 d，將樣品經(jīng)黑暗處理使得PSⅡ處于完全開放狀態(tài)，置于葉綠素?zé)晒鈨x（Water-PAM，德國）樣品槽中進(jìn)行測定。首先提供測量光[約 0.3μmol/（m2·s）]測定樣品最小熒光值（Fo），之后照射0.8 s約4 000 μmol/（m2·s）飽和脈沖光測定樣品最大熒光值（Fm），F(xiàn)v/Fm由公式計(jì)算：Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm。

1.3.2 實(shí)際量子效率（ΔF/Fm′）的測定 在光照處理5 d進(jìn)行ΔF/Fm′測定，自光照后0.5 h開始每隔 ?h 進(jìn)行1次測定，活化光設(shè)定為64 μmol/（m2·s），具體操作流程參考文獻(xiàn)[14]。

1.3.3 快速光曲線測定 樣品在光照處理6 h后，進(jìn)行快速光曲線的測定。由Water-PAM依次提供30、45、68、100、150、222、33、503 μmol/（m2·s）活化光，待所提供光強(qiáng)下熒光值（Ft）達(dá)穩(wěn)定后（約 15 s），提供0.8 s飽和脈沖光以測定該活化光下的最大熒光值（Fm′），相對電子傳遞速率（rETR）按照以下公式計(jì)算：

rETR=（Fm′-Ft）/Fm′×PAR×A×0.5;

其中：PAR表示光照度;A表示樣品的吸光系數(shù)，設(shè)定為0.85;0.5表示光能在2個(gè)光系統(tǒng)中平均分配。以光照度為x軸、rETR為y軸，可制作出快速光曲線。采用Eilers等的方法[15]對樣品快速光曲線進(jìn)行擬合并計(jì)算出快速光曲線的初始效率（α）、最大電子傳遞速率（ETRm）和半飽和光強(qiáng)（Ik）等參數(shù)。

1.3.4 誘導(dǎo)曲線測定

不同光照度處理5 d進(jìn)行誘導(dǎo)曲線的測定，樣品經(jīng)暗處理0.5 h以上以確保PSⅡ處于完全開放狀態(tài)，隨后由Water-PAM熒光儀提供測量光測得最小熒光值Fo，然后提供0.8 s的飽和脈沖光測定最大熒光值Fm，隨后關(guān)閉光源，40 s后打開64 μmol/（m2·s）活化光，每隔20 s提供飽和脈沖光直至該活化光下的最大熒光值Fm′達(dá)到穩(wěn)定，按照公示計(jì)算相關(guān)熒光參數(shù)：

qP=（Fm′-Ft）/（Fm′-Fo）;

NPQ=（Fm-Fm′）/Fm′。

1.4 光合色素含量的測定

光照處理5 d后，進(jìn)行藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白及葉綠素a含量的測定。將自由絲狀體過濾并吸干藻體表面水分，電子天平稱質(zhì)量后，加入pH值為6.8的磷酸緩沖液進(jìn)行研磨，充分研磨至糊狀后，轉(zhuǎn)移至離心管中，緩沖液潤洗研缽，匯入至離心管中，4 ℃，避光靜置30 min以充分提取藻膽蛋白，隨后4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，上清液為藻膽蛋白提取液，采用磷酸緩沖液定容后，參照Bennet等的方法[16]進(jìn)行藻膽蛋白含量的測定和計(jì)算。在上述離心后的沉淀中加入80%（體積分?jǐn)?shù)）丙酮，4 ℃黑暗條件下放置24 h以提取樣品中葉綠素a，4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，取上清液，定容后按照文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行葉綠素a含量的測定和計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用t-檢驗(yàn)分析，顯著水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照度對條斑紫菜自由絲狀體藻膽蛋白含量的影響

不同光照度處理會(huì)影響條斑紫菜“蘇通2號(hào)”藻膽蛋白含量。由圖1可知，隨著光照度上升，樣品中藻紅蛋白含量逐漸下降，35 μmol/（m2·s）光照度處理組顯著高于110 μmol/（m2·s）和 150 μmol/（m2·s） 光照度組（P<0.05），下降約40%;藻藍(lán)蛋白含量變化更為明顯，由35 μmol/（m2·s）光照度組的1.60顯著下降至150 μmol/（m2·s）光照度組的0.72（P<0.05），下降約55%;別藻藍(lán)蛋白含量也隨光照度上升而顯著下降，110 μmol/（m2·s）、150 μmol/（m2·s）光照度組均顯著低于 35 μmol/（m2·s） 光照度組（P<0.05）。

2.2 光照度對條斑紫菜自由絲狀體葉綠素a含量的影響

由圖2可知，隨著處理光照度上升，樣品葉綠素a含量逐步下降，其中，110 μmol/（m2·s） 和 150 μmol/（m2·s） 光照度組樣品較 35 μmol/（m2·s） 光照度組顯著下降約17%（P<0.05）。

2.3 光照度對條斑紫菜自由絲狀體光合色素比值的影響

由表1可知，光照度上升使樣品藻紅蛋白/葉綠素a（PE/Chl a）、藻藍(lán)蛋白/葉綠素a（PC/Chl a）下降，其中，PE/Chl a由35 μmol/（m2·s）光照度組的2.98顯著下降至 150 μmol/（m2·s） 光照度組的2.17（P<0.05）。35 μmol/（m2·s） 和70 μmol/（m2·s）光照度組樣品PC/Chl a差異不顯著（P>0.05），但二者均顯著高于 110 μmol/（m2·s） 和150 μmol/（m2·s）光照度組（P<0.05）;不同光照度下樣品別藻藍(lán)蛋白/葉綠素a（APC/Chl a）未表現(xiàn)出顯著差異（P>0.05）。

2.4 光照度對條斑紫菜自由絲狀體最大量子效率的影響

由圖3可知，隨著處理光照度上升，F(xiàn)v/Fm逐步下降，35 μmol/（m2·s）光照度組顯著高于其他光照度組（P<0.05），70 μmol/（m2·s）光照度組顯著高于150 μmol/（m2·s）光照度組（P<0.05），而 110 μmol/（m2·s） 和150 μmol/（m2·s）光照度組差異不顯著（P>0.05）。

2.5 光照度對條斑紫菜自由絲狀體實(shí)際量子效率日變化的影響

由圖4可知，35、70 μmol/（m2·s）光照度處理組樣品在照光后ΔF/Fm′變化不明顯，基本維持在0.43左右，而 150 μmol/（m2·s） 光照度處理組ΔF/Fm′在照光約 .5 h 表現(xiàn)出顯著下降，隨后維持在0.34左右;比較不同光照度處理組可知，35、70 μmol/（m2·s） 光照度組樣品在不同照光時(shí)間的ΔF/Fm′均顯著高于對應(yīng)的110、150 μmol/（m2·s）光照度組（P<0.05）。

2.6 光照度對條斑紫菜自由絲狀體快速光曲線的影響

由圖5可知，不同光照度處理組樣品相對電子傳遞速率（rETR）隨著活化光光照度的上升而快速上升，當(dāng)光照度達(dá)約400 μmol/（m2·s）時(shí)，rETR達(dá)最大值。不同光照度處理組在光曲線初始斜率、最大相對電子傳遞速率存在差異，35 μmol/（m2·s）光照度處理組初始斜率要高于其他光照度處理組，而且當(dāng)光照度超過100μmol/（m2·s）時(shí)，rETR值隨處理光照度上升而下降，如在503 μmol/（m2·s）活化光處，35 μmol/（m2·s）處理組rETR約34.54，而 150 μmol/（m2·s） 處理組rETR為26.17，降低幅度達(dá)24%。

對快速光曲線的擬合可得到快速光曲線初始斜率（α）、最大相對電子傳遞速率（rETRmax）和半飽和光照度（Ik）等參數(shù)，由表2可知，處理光照度的上升會(huì)引起α下降，35、70 μmol/（m2·s）光照度組要顯著高于110 、150 μmol/（m2·s）光照度組;rETRmax也隨處理光照度的上升而下降，其中，35 μmol/（m2·s）光照度組要顯著高于110、150 μmol/（m2·s）光照度組;不同光照度處理組樣品Ik值略有差異，但未達(dá)顯著性差異（P>0.05）。

2.7 光照度對條斑紫菜自由絲狀體光誘導(dǎo)曲線的影響

不同光照度下絲狀體樣品光誘導(dǎo)曲線參數(shù)的測定結(jié)果，由表3可知，110 μmol/（m2·s）光照度處理組光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）最低，而其他處理組間無顯著性差異（P>0.05）;非光化學(xué)猝滅系數(shù)（NPQ）的變化與qP不同，35 μmol/（m2·s）光照度組要顯著低于110、150 μmol/（m2·s）光照度組（P<0.05）。

3 討論

我國是經(jīng)濟(jì)海藻生產(chǎn)大國，其中，條斑紫菜經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展已形成育種、栽培、加工、銷售完整的產(chǎn)業(yè)鏈。紫菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展中，良種選育及配套的種苗培養(yǎng)技術(shù)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，我國近年育成“蘇通”系列新品種，在新品種的推廣過程中，種苗培育被認(rèn)為是重點(diǎn)。將絲狀體培養(yǎng)成懸浮在液體介質(zhì)中的自由生活狀態(tài)[18]，可保存和大量培育良種種質(zhì)，目前，自由絲狀體被認(rèn)為是紫菜生產(chǎn)的重要保障[19]，除可用來保存種質(zhì)資源外，已成為接種貝殼絲狀體的主要來源，因此自由絲狀體的人工培養(yǎng)得到越來越多的重視。自由絲狀體人工培養(yǎng)過程中，光照度是關(guān)鍵的環(huán)境因子，基于形態(tài)、生物量、生長速率等的研究表明，較低的光照度對絲狀體的生長是適宜的[8-9，11]，本研究結(jié)果顯示，條斑紫菜絲狀體在35、70 μmol/（m2·s）光照度下具有較高的光能利用效率，Zhang等的研究也表明紫菜絲狀體具有低光照度下進(jìn)行光合作用的能力[20]，此外低光照度下紫菜絲狀體光合色素含量也處于較高水平，隨著光照度上升，絲狀體對光能的利用效率降低，說明條斑紫菜“蘇通2號(hào)”品種符合該物種適應(yīng)于較低光照度的生物學(xué)特征。

條斑紫菜光合特性能夠反映出不同光照度等環(huán)境條件下的生理狀態(tài)，通過光合生理的測定表明，高溫高光照度的逆境條件下，條斑紫菜營養(yǎng)藻絲光合作用被嚴(yán)重抑制[21]，即使在合適溫度下，過高的光照度也會(huì)引起紫菜對光能利用效率降低[22]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)中，F(xiàn)v/Fm對外界脅迫敏感，當(dāng)該值發(fā)生明顯下降時(shí)表明PSⅡ反應(yīng)中心受到不同程度的功能損傷，本研究中不同光照度處理一定時(shí)間后，強(qiáng)光組紫菜絲狀體Fv/Fm下降顯著，說明此時(shí)樣品PSⅡ已受到明顯功能損傷，實(shí)際量子效率、快速光曲線α值也表明樣品對光能的利用效率降低，rETRmax參數(shù)的降低表明樣品PSⅡ電子傳遞能力因光照度過高而降低，qP值變化不明顯可能與測定活化光照度度較低有關(guān)，但NPQ在高光照度環(huán)境下升高說明存在光保護(hù)機(jī)制，Ik值的變化也支持了這一結(jié)果[23]，紫菜絲狀體通過將吸收過多光能以熱的形式耗散，降低對光能的利用效率，但保護(hù)PSⅡ免受不可逆?zhèn)?。高光照度引起紫菜絲狀體光能利用能力的降低與光合色素的變化也密切相關(guān)，作為捕光色素的藻膽蛋白，其含量隨光照度的上升而逐步下降，而且藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白對光照度更加敏感，而別藻藍(lán)蛋白、葉綠素a相對穩(wěn)定，因此認(rèn)為PE和PC含量顯著下降是紫菜絲狀體對光能的吸收利用效率降低的主要原因。

本研究通過光合色素、葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定，分析了不同光照度下條斑紫菜“蘇通2號(hào)”自由絲狀體對光能利用的特征，可為該品種高效的人工培養(yǎng)提供理論支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]Tseng C K，F(xiàn)ei X G. Macroalgal commercialization in the orient[J]. Hydrobiologia，1987，151/152（1）：167-172.

[2]Kurogi M. Study of the life history of Porphyra：Ⅰ. The germination and development of carpospores[J]. Bulletin of Tohoku Regional Fisheries Research Laboratory，1953，2：67-103.

[3]曾呈奎，張德瑞. 紫菜的研究：Ⅲ. 紫菜的有性生殖[J]. 中國植物學(xué)報(bào)（英文版），1955（2）：153-166.

[4]張學(xué)成，秦 松，馬家海，等. 海藻遺傳學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[5]許 璞，張學(xué)成，王素娟. 中國主要經(jīng)濟(jì)海藻的繁殖與發(fā)育[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[6]張 濤，沈宗根，李家富，等. 紫菜不同品系貝殼絲狀體葉綠素?zé)晒馓匦员容^[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：238-242.

[7]姚春燕，張 濤，姜紅霞，等. 條斑紫菜不同品系藻體光合色素及葉綠素?zé)晒鈪?shù)比較[J]. 南京師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，33（2）：81-86.

[8]湯曉榮，費(fèi)修綆. 光溫與壇紫菜自由絲狀體生長發(fā)育的關(guān)系[J]. 海洋與湖沼，1997，28（5）：475-482.

[9]駱其君，盧 冬，費(fèi)志清，等. 生態(tài)因子對條斑紫菜自由絲狀體生長的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，1999，18（4）：6-9.

[10]Avila M，Santelices B，McLachlan J.Photoperiod and temperature regulation of the life history of Porphyra columbina （Rhodophyta，Bangiales） from central Chile[J]. Canadian Journal of Botany，1986，64（9）：1867-1872.

[11]Waaland J R，Dickson L G，Carrier J E.Conchocelis growth and photoperiodic control of conchospore release in Porphyra torta （Rhodophyta）[J]. Journal of Phycology，1987，23（3）：399-406.

[12]Enríquez S，Borowitzka M A.The use of the fluorescence signal in studies of seagrasses and macroalgae[M]//Chlorophyll a fluorescence in aquatic sciences：methods and applications. Dordrecht：Springer Netherlands，2010：187-208.

[13]李家富，張 濤，陸勤勤，等. 不同溫度條件下條斑紫菜葉綠素的熒光特征[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：200-203.

[14]張 濤，沈宗根，姚春燕，等. 基于葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的紫菜光適應(yīng)特征研究[J]. 海洋學(xué)報(bào)（中文版），201 33（3）：140-147.

[15]Eilers P H C，Peeters J C H.A model for the relationship between light intensity and the rate of photosynthesis in phytoplankton[J]. Ecological Modelling，1988，42（3/4）：199-215.

[16]Bennett A，Bogorad L.Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga[J]. Journal of Cell Biology，1973，58（2）：419-435.

[17]Wellburn A R.The spectral determination of chlorophylls a and b，as well as total carotenoids，using various solvents with spectrophotometers of different resolution[J]. Journal of Plant Physiology，1994，144（3）：307-313.

[18]McHugh D.World seaweed resources.An authoritative reference system[J]. Botanica Marina，2006，49（5/6）：456-457.

[19]張美如，陸勤勤，朱建一. 條斑紫菜自由絲狀體擴(kuò)增的意義及影響因子[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，2009，36（2）：77-79

[20]Zhang X C，Brammer E，Pedersen M，et al. Effects of light photon flux density and spectral quality on photosynthesis and respiration in Porphyra yezoensis （Bangiales，Rhodophyta）[J]. Phycological Research，1997，45（1）：29-37.

[21]魏家慧，李國梁，汪文俊，等. 條斑紫菜絲狀體不同發(fā)育時(shí)期對光照和溫度的光合適應(yīng)能力[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2020，41（6）：115-124.

[22]Zhang T，Shen Z G，Xu P，et al. Analysis of photosynthetic pigments and chlorophyll fluorescence characteristics of different strains of Porphyra yezoensis[J]. Journal of Applied Phycology，2012，24（4）：881-886.

[23]White A J，Critchley C. Rapid light curves：a new fluorescence method to assess the state of the photosynthetic apparatus[J]. Photosynthesis Research，1999，59（1）：63-72.