章行遠(yuǎn)，吳奇飛，卯婷婷*，金義蘭，張昌容，班菲雪，劉少蘭，喬 飛

(1.貴州省植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.安順學(xué)院，貴州 安順 561000)

0 引言

【研究意義】辣椒自15世紀(jì)隨哥倫布環(huán)球航行被傳出美洲后[1]，中國(guó)在明朝時(shí)期引入并作為觀賞植物種植。目前中國(guó)辣椒種植面積居全球前列，產(chǎn)量位居全球第一[2]。但隨著種植面積擴(kuò)大，提升經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，辣椒病害的發(fā)生日益嚴(yán)重，枯萎病是辣椒常見(jiàn)病害之一，發(fā)病率一般為15%～30%[3]；長(zhǎng)期連作破壞了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定，導(dǎo)致該病發(fā)生率更高。目前對(duì)辣椒枯萎病的防控措施主要為化學(xué)防治，雖有高效、使用簡(jiǎn)便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但增加了農(nóng)藥殘留、降低土壤微生物多樣性，并導(dǎo)致土壤硬化、病原菌耐藥性增強(qiáng)等問(wèn)題。隨著消費(fèi)者對(duì)有機(jī)食品需求的日益提高，以及生物技術(shù)的發(fā)展，挖掘可利用的生防資源防治辣椒枯萎病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】辣椒枯萎病致病菌為尖孢鐮刀菌萎蔫專化型〔FusariumoxysporumSchl.f.sp.vasinfectum(Atk)Snyder & Hansen〕，17～37℃均可發(fā)生，最適生長(zhǎng)溫度為24～28℃，潮濕環(huán)境有利于病原菌傳播蔓延；病原菌菌絲體和繁殖體厚垣孢子隨病殘?bào)w在土壤的表土層越冬，且可存活6～8年；通過(guò)風(fēng)、水等流體傳播；病原菌從根部薄弱部位侵染辣椒，產(chǎn)生有毒物質(zhì)破壞代謝功能并堵塞導(dǎo)管，導(dǎo)致側(cè)根腐爛，降低植株支撐能力，并使葉片喪失生理功能直至植株死亡；植株染病后平均2周死亡[4-5]。許多生防菌對(duì)辣椒枯萎病病原菌有抑制作用，劉云龍等[6]研究發(fā)現(xiàn)，施用哈茨木霉菌和某些解磷菌可以抑制辣椒疫病和枯萎病的發(fā)生并促使作物提前8 d開(kāi)花，產(chǎn)量提高15%。THANGAVELU等[7-8]研究表明，枯草芽孢桿菌、木霉菌和熒光假單孢菌按照一定比例混配對(duì)辣椒枯萎病的病原菌有強(qiáng)抑制作用，并可提高植株體內(nèi)POX酶、幾丁質(zhì)酶活性和酚類物質(zhì)含量，在施用6 d后達(dá)最大值，從而提高植株抗病性。王文斌等[9]研究發(fā)現(xiàn)，萬(wàn)壽菊根部物質(zhì)對(duì)辣椒枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)有顯著抑制作用，抑菌效果隨提取物濃度降低而減弱，50 mg/mL無(wú)菌水提取物48 h內(nèi)抑菌率達(dá)100%；萬(wàn)壽菊根部提取物可顯著提高辣椒幼苗的CAT、SOD和POD活性，增強(qiáng)植株抗病性。張俊慶等[3,10]成功分離到對(duì)辣椒枯萎病病原菌有較強(qiáng)拮抗作用的枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌和哈茨木霉菌株?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】國(guó)內(nèi)外報(bào)道用于防治辣椒枯萎病的生防資源相對(duì)較少，在貴州鮮見(jiàn)利用生防菌防治辣椒枯萎病的報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用平板稀釋法分離辣椒連作區(qū)域內(nèi)植株根際土壤微生物，再采用平板對(duì)峙法篩選對(duì)辣椒枯萎病有拮抗效果的生防菌，最后利用菌落直徑測(cè)量法結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性及拮抗菌株種類，以期為綠色防控辣椒枯萎病提供有效的生防資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤 供試土壤為辣椒根際土壤，采自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)(北緯26°30′40″，東經(jīng)106°39′44″，海拔1 174 m，丘陵地形，旱地黃壤土，四季降雨，年均降雨量1 130 mL)辣椒連作區(qū)。

1.1.2 病原菌 供試病原菌為尖孢鐮刀菌辣椒枯萎病致病?；停暧少F州省植物保護(hù)研究所生物防治研究室分離保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18.5 g，純水1 000 mL；為了更高地分離土壤真菌，在PDA培養(yǎng)基中額外加入0.05 g鏈霉素和0.25 g氯霉素[11]。木霉選擇性培養(yǎng)基：五氯硝基苯0.3 g，葡萄糖3.0 g，MgSO40.2 g，KH2PO40.9 g，NH4NO31.0 g，KCl 0.15 g，玫瑰紅0.15 g，瓊脂18 g，氯霉素0.25 g，鏈霉素0.05 g以及1 000 mL蒸餾水[12]。PD液體培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL，葡萄糖20 g，土豆200 g，自然pH[13]。

1.2 方法

1.2.1 辣椒根際土壤微生物分離純化 于辣椒苗期、花期、果實(shí)采摘前和果實(shí)采摘后4個(gè)階段，采用5點(diǎn)取樣法采集辣椒種植區(qū)域距土表10～15 cm的根際土壤并混勻，每個(gè)時(shí)期各采集土樣3份，記錄采集時(shí)間、辣椒生長(zhǎng)狀態(tài)和采集量等。將無(wú)菌水和采集的土樣按照10∶1比例稀釋后，在搖床上以150 r/min的速度振蕩20 min制備土壤初懸浮液，采用梯度稀釋法，逐級(jí)制備濃度為1×10-1CFU/mL、1×10-2CFU/mL、1×10-3CFU/mL和1×10-4CFU/mL的土壤懸浮液[14-15]。在PDA培養(yǎng)基上均勻涂布100 μL土壤懸浮液，每個(gè)濃度3次重復(fù)。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3 d后觀察記錄真菌菌落數(shù)量，并挑選生長(zhǎng)單一完整的菌落，利用木霉選擇性培養(yǎng)基分離純化得到木霉菌，并保存。

1.2.2 平板對(duì)峙法初篩 以尖孢鐮刀菌病原菌為靶標(biāo)病原菌，分離得到的木霉菌株為待測(cè)菌。在PDA培養(yǎng)基的兩側(cè)分別接種直徑5 mm的病原菌和待測(cè)菌菌餅，參照樊炳君等[16]的方法，28℃培養(yǎng)6 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況，有明顯抑制病原菌生長(zhǎng)的待測(cè)菌標(biāo)定為拮抗菌，并測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率，獲得辣椒枯萎病拮抗菌株并保存。

1.2.3 拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性試驗(yàn) 將拮抗菌株的菌塊接種于PD液體培養(yǎng)基中，26℃ 150 r/min培養(yǎng)4 d，取10 mL培養(yǎng)液于7 500 r/min離心10 min。上清液過(guò)0.45 μm過(guò)濾器去除菌體，獲得含有拮抗菌次生代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，與PDA按1∶10混勻配制培養(yǎng)基。未添加菌株發(fā)酵液的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，接種尖孢鐮刀菌菌塊，26℃培養(yǎng)7 d，測(cè)量尖孢鐮刀菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=[(空白對(duì)照菌落直徑-處理組菌落直徑)/空白對(duì)照菌落直徑]×100%

1.2.4 拮抗菌株鑒定 形態(tài)學(xué)方法鑒定：選取有抑菌效果的菌株，在PDA上26℃培養(yǎng)7 d后，觀察記錄菌落形態(tài)及顏色，刮取菌絲及孢子，以蒸餾水作為懸浮劑制片，在顯微鏡下觀察菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)，并測(cè)量孢子大小[17]。

分子系統(tǒng)學(xué)鑒定：拮抗菌接種于鋪滿無(wú)菌玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，待菌絲生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，收集菌絲體、在液氮中研磨至粉末狀，提取DNA；采用ITS1、ITS4和TEF1-728F、TEF1-rev引物分別擴(kuò)增ITS和TEF基因，ITS引物的反應(yīng)體系參照卯婷婷等[13]的方法，采用25 μL反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，上下游通用引物ITS1和ITS4各1 μL，2×EsTaqMaster Mix 12.5 μL，無(wú)菌水9.5 μL；TEF引物的反應(yīng)體系同為25 μL反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，上下游通用引物TEF各1 μL，2×EsTaqMaster Mix 12.5 μL，無(wú)菌水9.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，34次循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。在GeneBank中下載拮抗菌株近緣種的ITS和TEF序列，采用ClustalW對(duì)齊后拼接，在MEGA 11中用Maximum Likelihood方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用bootstrap自舉檢驗(yàn)1 000次。根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)確定拮抗菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒根際土壤微生物分離

從表1看出，利用PDA培養(yǎng)基從采集的12份有效土樣中共分離純化得到真菌50株，其中，從苗期土樣中分離到LJ060209、LJ060210和LJ060201等共22株菌株，從開(kāi)花期土樣中分離到LJ07160601、LJ07160843和LJ07160121等共16株菌株，從果實(shí)采摘前土樣中分離到LJ08072、LJ08074和LJ080726等共9株菌株，從果實(shí)采摘后土樣中分離到LJ09240301、LJ09240303和LJ09240304共3株菌株，分別占總分離菌株的44%、32%、18%和6%。

表1 辣椒根際土壤分離獲得的真菌菌株

2.2 分離菌株的抑菌效果

從表2看出，菌株LJ06020803、LJ060204、LJ060205、LJ060211和LJ09240304共5株菌株對(duì)辣椒枯萎病病原菌有顯著抑制作用，各處理病原菌菌落直徑為10.83～19.50 mm，表現(xiàn)為L(zhǎng)J06020803LJ060211>LJ060205>LJ09240304>LJ060204。其中，菌株LJ06020803的抑菌率最高，極顯著高于其余處理；菌株LJ060211其次，抑菌率為70.61%，極顯著高于其余處理；菌株LJ060204和菌株LJ09240304的抑菌率最低，二者無(wú)顯著差異，但均極顯著低于其余處理。從封二圖Ⅰ看出，空白對(duì)照處理辣椒枯萎病病原菌已幾乎鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿，而菌株LJ06020803處理辣椒枯萎病病原菌菌落生長(zhǎng)明顯被抑制。

表2 拮抗菌株對(duì)辣椒枯萎病病原菌的抑菌效果

2.3 發(fā)酵液的抑菌活性

從封二圖Ⅱ看出，LJ06020803菌株無(wú)菌體發(fā)酵液對(duì)辣椒枯萎病病原菌有一定的抑制作用，在含LJ06020803菌株無(wú)菌體發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后，辣椒枯萎病病原菌的菌落直徑為33.5 mm，空白對(duì)照的菌落直徑為56.7 mm，抑菌率為40.92%。

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué) 從封二圖Ⅲ看出，菌株LJ06020803在木霉選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，易產(chǎn)孢，淺綠色。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h后，菌落直徑為90 mm，菌絲白色，產(chǎn)孢稀少；培養(yǎng)至7 d后，菌落正面黃綠色至草綠色，產(chǎn)孢區(qū)聚集狀；菌絲無(wú)色，分生孢子梗無(wú)色，簡(jiǎn)單分枝, 初級(jí)分枝近似直角，瓶梗輪枝狀，大小為(4.5～7.5)μm×(2.0～3.0)μm；分生孢子卵圓形至橢圓形，大小為(2.0～3.0)μm×(2.5～3.5)μm，淺欖黃色至淺草綠色。與GAMS等[14]描述的哈茨木霉(T.harzianum)的形態(tài)一致。

2.4.2 分子生物學(xué) 通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得菌株LJ06020803的ITS和TEF基因序列，長(zhǎng)度約550 bp。從圖1看出，在由ITS序列和TEF序列共同構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，菌株LJ06020803的近緣種均以二分支樹(shù)的形式聚集在一起，菌株LJ06020803與哈茨木霉(T.harzianum)處于同一分支，自舉支持率(MPBS)100。與非洲哈茨木霉(T.afroharziaum)形成姊妹支，自舉支持率為(MPBS)80%。結(jié)合形態(tài)特征及分子系統(tǒng)學(xué)特征，確定菌株LJ06020803為哈茨木霉菌(T.harzianum)。

圖1 基于菌株LJ06020803的ITS和TEF序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

篩選自然界中抑菌微生物作為農(nóng)作物病害的綠色防控生防資源是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，也是今后綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展方向。已有研究表明，多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)對(duì)于小麥赤霉病、黃瓜霜霉病、辣椒疫霉病、白菜莖腐病和番茄根結(jié)線蟲(chóng)等均有較好的防治效果[18-22]；木霉菌(Trichodermaspp.)施用后，通過(guò)產(chǎn)生木聚糖、低聚糖、內(nèi)肽化合物等小分子量化合物誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)[23-25]，同時(shí)具有一定促進(jìn)作物增產(chǎn)的效果[26]，目前被廣泛用于防治西瓜枯萎病和煙草黑脛病等多種病害[27-28]。前人專門針對(duì)中國(guó)西南地區(qū)由連作導(dǎo)致的辣椒病害的生防研究相對(duì)較少，且大多采用單次采樣的方法收集土壤。研究選取年降雨量約1 000 mL的貴州丘陵地帶旱地辣椒連作區(qū)域的土壤，在辣椒不同生階段長(zhǎng)期調(diào)查其根系土壤微生物，多次采集土樣，按照常規(guī)拮抗微生物分離和篩選方法，以區(qū)域常見(jiàn)病害辣椒枯萎病的病原菌作為靶標(biāo)菌，應(yīng)用PDA、木霉選擇性培養(yǎng)基、PD液體培養(yǎng)基，通過(guò)平板對(duì)峙法篩選出對(duì)辣椒枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌有較好抑制效果的菌株LJ06020803；形態(tài)學(xué)特征鑒定發(fā)現(xiàn)，菌株LJ06020803的培養(yǎng)形狀及形態(tài)學(xué)特征與GAMS等[14]描述的哈茨木霉(T.harzianum)一致；分子生物學(xué)鑒定其與哈茨木霉(T.harzianum)處于同一分支，自舉支持率為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定菌株LJ06020803為哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)。研究還發(fā)現(xiàn)，在對(duì)峙培養(yǎng)中菌株LJ06020803對(duì)尖孢鐮刀菌具有顯著的抑制作用，抑制率為78.04%，菌株LJ06020803的無(wú)菌體發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌率為40.92%，具有拮抗作用。同時(shí)也說(shuō)明，該菌株可產(chǎn)生有抑菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，但目前該代謝產(chǎn)物種類及抑菌機(jī)理尚不明確，后期將進(jìn)一步深入研究，明確抑菌機(jī)理，并開(kāi)發(fā)其大田應(yīng)用技術(shù)。

4 結(jié)論

貴州辣椒連作地的根際土壤中有較多的木霉菌，試驗(yàn)共獲得5株對(duì)尖孢鐮刀菌具有較好拮抗作用的木霉菌株(Trichodermaspp.)，其中，菌株LJ06020803的對(duì)峙培養(yǎng)抑制率最高，為78.04%，其不含菌體的發(fā)酵液抑菌率為40.92%。通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定，菌株LJ06020803為哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)。該菌株對(duì)尖孢鐮刀菌具有較好的抑制作用，可作為生防菌資源開(kāi)發(fā)防治辣椒枯萎病的生防制劑。