吳倩倩,馬麗霞,劉 陽,董 浩,王憲朋

(山東省藥學(xué)科學(xué)院,山東省醫(yī)用高分子材料重點實驗室,濟南 250100)

緩釋制劑通過溶解或分散的形式將藥物包含于載體基質(zhì)中,藥物作用于人體后可在較長時間內(nèi)緩慢穩(wěn)定釋放,達(dá)到提高療效和患者耐受性、減少不良反應(yīng)等效果。目前長效緩釋微球制劑大多以生物可降解聚合物為載體,具有靶向性,藥物穩(wěn)定性高、緩釋周期長,其緩釋對象以多肽、蛋白類及部分小分子化學(xué)藥物為主,臨床上多用于治療腫瘤、精神障礙、退化性病變等疾病,成為國內(nèi)外學(xué)者和制劑研發(fā)人員的研究熱點。

丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)作為一種藥用輔料早已被收錄到?中華人民共和國藥典?,由于具有良好的可降解性和生物相容性,且對人體無毒,常被用于緩釋制劑載體[1-3]。目前較多研究者將研究重點放在緩釋制劑的制備工藝上[4-8],而對于聚合物合成過程中可能殘留的單體含量卻沒有探討。當(dāng)PLGA作為藥物緩釋制劑載體時,單體殘留量太大會加快載體的降解速率,進(jìn)而影響藥物的緩釋效果。此外,某些藥物會與殘留單體上的基團發(fā)生相互作用,形成雜質(zhì),影響制劑質(zhì)量。為此,本課題組在前期研究中制備了低殘留緩釋制劑載體PLGA50/50[9]。

目前多采用直接進(jìn)樣-氣相色譜法測定聚合物中單體的殘留量[10-13],該方法得到的樣品溶液含有一定量的聚合物,在測定時一同進(jìn)入系統(tǒng),對進(jìn)樣系統(tǒng)造成污染,同時聚合物在測定過程中可能受氫火焰影響而發(fā)生分解,使得單體峰出現(xiàn)不同程度拖尾,尤其當(dāng)聚合物中單體殘留量較小時,拖尾現(xiàn)象對測定結(jié)果的影響尤為顯著,因此此方法不適用于PLGA 中單體殘留量的測定。此外,還有研究者采用萃取等方式處理樣品[14-15],也存在操作復(fù)雜、回收率不高等不足。文獻(xiàn)[16]采用溶解沉淀法處理樣品,但是研究還不夠深入,存在沉淀劑制備較復(fù)雜、回收率較低等不足。

為了解決上述問題,準(zhǔn)確、方便地測定PLGA單體殘留量,本工作利用聚合物和單體在有機溶劑中的溶解度差異,采用溶解沉淀法,有效降低直接進(jìn)樣法所帶來的系統(tǒng)污染,也大幅提高了檢測準(zhǔn)確度,提出了一種適用于低殘留PLGA 中單體殘留量測定的氣相色譜法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6890N 型氣相色譜儀,配氫火焰離子化檢測器(FID);BS224S 型電子分析天平(感量0.000 1 g)。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1.000 g·L－1,精密稱取丙交酯(DL-LA)和乙交酯(GA)各0.1 g,加二氯甲烷溶解并定容至10 mL,搖勻。取上述溶液1 mL 置于10 mL 容量瓶中,用二氯甲烷定容,配制成質(zhì)量濃度為1.000 g·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合對照品溶液:0.050 g·L－1,移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.50 mL,置于10 mL容量瓶中,用二氯甲烷稀釋至刻度,搖勻,配制成質(zhì)量濃度為0.050 g·L－1的混合對照品溶液。

混合對照品溶液系列:移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.05,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60 mL,分別置 于10 mL容量瓶中,用二氯甲烷稀釋至刻度,搖勻,配制成質(zhì)量濃度分別為0.005,0.010,0.020,0.030,0.040,0.050,0.060 g·L－1的混合對照品溶液系列。

DL-LA、GA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不小于99.5%;正己烷、二氯甲烷均為分析純。

用于前期研究的高殘留樣品PLGA50/50 1批,批號18080802,質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于99.5%;用于回收率測定的低殘留樣品PLGA50/50 1 批,批號18101909,質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于99.5%;用于測定單體含量或重復(fù)性的低殘留樣品PLGA50/50 3批,批號分別為19021301、19021401、19021801,質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于99.5%。

1.2 色譜條件

Agilent HP-INNOWax毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃,柱 溫160 ℃,檢測器溫度300 ℃;載氣為高純氮氣,流量8 mL·min－1;分流比10∶1;進(jìn)樣量3μL。

1.3 試驗方法

精密稱取樣品約0.1 g,加7 mL 二氯甲烷(溶劑)溶解后,置于10 mL 容量瓶中[16],加正己烷(沉淀劑)稀釋至刻度,搖勻,置于離心管中,以轉(zhuǎn)速3 000 r·min－1離心10 min,取上清液作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性

取空白溶劑二氯甲烷與混合對照品溶液,分別注入氣相色譜儀,按照1.2節(jié)色譜條件測定,記錄色譜圖?？瞻兹軇┡c混合對照品溶液的色譜圖見圖1。

圖1 典型氣相色譜圖Fig.1 Typical gas chromatograms

由圖1可知,在此條件下,GA 和DL-LA 得到有效分離,且空白溶劑對兩種單體的測定無干擾。

混合對照品溶液中GA 和DL-LA 之間的分離度及理論塔板數(shù)如表1所示。

表1 單體殘留量系統(tǒng)適用性試驗數(shù)據(jù)Tab.1 Data of test for system suitability of monomer residue

由表1可知,兩種單體分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)均大于10 000,系統(tǒng)適用性滿足要求。

2.2 前處理方法的選擇

在前期的工作中發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)的高殘留樣品(批號為18080802)直接用二氯甲烷溶解后進(jìn)樣時,因受到溶解的聚合物的影響而出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象。這不僅會干擾測定結(jié)果,還會污染襯管。因此,嘗試采用溶解沉淀法,減少測定溶液中的聚合物,降低對測定結(jié)果的影響。如圖2所示,樣品采用溶解沉淀法后,單體峰拖尾現(xiàn)象顯著改善(兩種單體峰中間的峰是樣品中的不明雜質(zhì),不影響兩種單體的含量測定)。

圖2 直接進(jìn)樣法和溶解沉淀法的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatograms by direct injection method and dissolving-precipitation method

用溶解沉淀法處理樣品后,不僅單體峰的拖尾現(xiàn)象可以明顯改善,而且經(jīng)過反復(fù)試驗,系統(tǒng)也不會再受到樣品的污染,多次試驗后襯管依然潔凈。因此,試驗采用溶解沉淀法進(jìn)行前處理。

2.3 溶劑和沉淀劑體積比的選擇

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn),樣品處理過程中,沉淀劑比例越高,單體峰的拖尾越不明顯,但是單體回收率會越低。為了保證在回收率合格的情況下得到準(zhǔn)確的測定結(jié)果,試驗考察了不同體積比的溶劑(二氯甲烷)和沉淀劑(正己烷)對單體回收率的影響,結(jié)果見表2。

表2 溶劑和沉淀劑體積比對單體回收率的影響Tab.2 Effect of volume ratio of solvent to precipitant on monomer recovery

由表2可知,當(dāng)溶劑與沉淀劑的體積比為7∶3時,即樣品用7 mL二氯甲烷溶解后再加3 mL正己烷進(jìn)行沉淀時,測得的回收率滿足?中華人民共和國藥典?要求(92.0%～108%)。因此,試驗選擇溶劑與沉淀劑的體積比為7∶3。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

取混合對照品溶液系列注入氣相色譜儀,按照1.2節(jié)色譜條件進(jìn)行測定。以單體的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見表3。

分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量,加二氯甲烷逐級稀釋,按照1.2 節(jié)色譜條件分別進(jìn)樣測定,以3倍信噪比(S/N)對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限(3S/N),以10 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度為測定下限(10S/N),結(jié)果見表3。

表3 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度試驗

2.5.1 儀器精密度

取混合對照品溶液,按照1.2節(jié)色譜條件平行測定6次。結(jié)果表明,GA 和DL-LA 兩種單體6次測定峰面積的平均值分別為76.18,17.58,峰面積測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.3%,0.85%。說明儀器精密度滿足測定要求。

2.5.2 重復(fù)性試驗

取PLGA50/50(批號為19021401),按照1.3節(jié)試驗方法配制6份供試品溶液,按照1.2節(jié)色譜條件測定。結(jié)果表明,供試品溶液中GA 和DL-LA 的殘留量分別為0.042 5%,0.036 4%,測定值的RSD分別為2.9%,2.5%,均小于3.0%,說明方法滿足重復(fù)性要求。

2.6 回收試驗

精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.50 mL,置于10 mL容量瓶中,加6.5 mL 二氯甲烷后再用正己烷定容,搖勻,作為100%回收率對照品溶液(用于測定加標(biāo)量)。

精密稱取樣品約0.1 g,加入6.5 mL二氯甲烷溶解樣品,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,然后加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.5 mL,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,置于離心管中,以轉(zhuǎn)速3 000 r·min－1離心10 min,取上清液作為100%回收率樣品溶液,平行制備6份。

精密稱取樣品約0.1 g,加入7 mL 二氯甲烷溶解樣品,轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中,并用正己烷稀釋至刻度,搖勻,置于離心管中,以轉(zhuǎn)速3 000 r·min－1離心10 min,取上清液作為樣品溶液(用于測定本底值),并平行制備3份。

按照1.2節(jié)色譜條件分別測定100%回收率對照品溶液、100%回收率樣品溶液和樣品溶液的峰面積,兩種單體的回收率結(jié)果如表4所示。

表4 回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of test for recovery(n＝6)

由表4 可知,DL-LA 的回收率為101%,RSD為1.2%,GA 的回收率為97.0%,RSD 為1.5%。

2.7 樣品分析

取3 批樣品,按照試驗方法進(jìn)行測定,結(jié)果見表5。

表5 樣品分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of the samples

由表5可知,各批樣品中兩種單體殘留量均小于0.050%。3批樣品的氣相色譜圖如圖3所示。

圖3 3批樣品的色譜圖Fig.3 Gas chromatograms of three batches of samples

本工作以二氯甲烷為溶劑,正己烷為沉淀劑,并用離心的方法得到供試品溶液,采用氣相色譜法測定低殘留PLGA 中DL-LA 和GA 兩種單體的殘留量。方法精密度高、回收率高,單體質(zhì)量濃度在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系,溶解沉淀法有效降低了直接進(jìn)樣法所帶來的系統(tǒng)污染,也大幅提高了檢測準(zhǔn)確度,對于低殘留PLGA 的質(zhì)量控制和緩釋制劑載體的研究開發(fā)具有重要意義。