謝 楠 ,劉志榮 ,張明童? ,張 平 ,李冬華 ,馬 瀟 ,郭朝暉,鄭全林

(1.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院,蘭州 730070;2.甘肅省中藏藥檢驗(yàn)檢測技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070;3.中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070;4.遂寧天地網(wǎng)川白芷產(chǎn)業(yè)有限公司,遂寧 629000)

白芷是一味中醫(yī)臨床常用傳統(tǒng)中藥材,為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.F或杭白芷A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.F.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根,始載于?神農(nóng)本草經(jīng)?,其性溫,氣芳香,味辛,微苦,具有散風(fēng)除濕、通竅止痛作用,臨床多用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻淵等[1-2]。白芷中含有香豆素類[3-6]、揮發(fā)油類[7]、多糖類[8]、生物堿類[9]等多種化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明香豆素類化學(xué)成分具有多種藥理活性,如鎮(zhèn)痛、消炎、抗氧化、抗腫瘤和抗高血壓等[7-9]。

不同產(chǎn)地及不同加工方式對白芷質(zhì)量均有所影響[10-11]。白芷藥材經(jīng)硫磺熏蒸(以下簡稱硫熏)后易于干燥,硫熏具有殺菌防腐、防蟲蛀、增加色澤美感等優(yōu)點(diǎn),但大量研究發(fā)現(xiàn)硫熏對藥材的質(zhì)量影響巨大,影響其化學(xué)成分及活性[12-15],并且導(dǎo)致有害物質(zhì)(如二氧化硫)殘留。目前,針對白芷的化學(xué)成分的研究報(bào)道廣泛[16-18],但系統(tǒng)評價白芷質(zhì)量的報(bào)道較少,如何全面、系統(tǒng)、有效地評價白芷的質(zhì)量仍然備受中醫(yī)藥研究者關(guān)注。

本工作采用高效液相色譜法(HPLC)同時測定白芷藥材中歐前胡素、異歐前胡素、補(bǔ)骨脂素、水合氧化前胡素、佛手苷內(nèi)酯、白當(dāng)歸腦、花椒毒酚、氧化前胡素、白當(dāng)歸素等9種香豆素類化學(xué)成分的含量,并利用SPSS 26軟件和SIMCA 14.1軟件,結(jié)合聚類分析(CA)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對所測香豆素類化學(xué)成分進(jìn)行綜合分析,為更全面、系統(tǒng)地評價白芷藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters AcQuity Arc型高效液相色譜儀。

混合對照品儲備溶液:稱取適量的9種香豆素類化學(xué)成分對照品,用甲醇溶解并配制成歐前胡素質(zhì)量濃度為130 mg·L－1,異歐前胡素質(zhì)量濃度為60 mg·L－1,補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度為40 mg·L－1,水合氧化前胡素質(zhì)量濃度為140 mg·L－1,佛手苷內(nèi)酯質(zhì)量濃度為130 mg·L－1,白當(dāng)歸腦質(zhì)量濃度為140 mg·L－1,花椒毒酚質(zhì)量濃度為240 mg·L－1,氧化前胡素質(zhì)量濃度為160 mg·L－1,白當(dāng)歸素質(zhì)量濃度為130 mg·L－1的混合對照品儲備溶液,于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

歐前胡素(110826-201918)、異歐前胡素(110827-201812)、補(bǔ)骨脂素(110739-201918)、水合氧化前胡素(B21189)、佛手苷內(nèi)酯(B20395)、白當(dāng)歸腦(B20026)、花椒毒酚(B20537)、氧化前胡素(B21471)、白當(dāng)歸素(P01028SA13);30批白芷藥材由某公司提供,經(jīng)鑒定均為白芷Angelicadahurica的干燥根,樣品信息見表1。

表1 白芷藥材樣品信息Tab.1 Information for Angelica dahurica samples

1.2 色譜條件

CAPCELLPAK C18MGⅡ色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流 量1.0 mL·min－1;進(jìn)樣量20μL;檢測波長254 nm;流動相A 為水,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～16 min時,A 由90%降至55%;16～30 min 時,A 由55%降 至43%;30～40 min時,A 由43%降至37%,保持5 min。

1.3 試驗(yàn)方法

將白芷藥材晾干,反復(fù)粉碎后,精密稱取白芷藥材粉末[過65目篩,孔徑為(250±9.9)μm]0.2 g,加入甲醇20 mL,按照?中華人民共和國藥典?(2020年版)一部白芷藥材含量測定方法進(jìn)行處理,所得溶液按照色譜條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照色譜條件測定混合對照品溶液和白芷樣品溶液,所得色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液和白芷樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution and Angelica dahurica sample solution

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

將混合對照品儲備溶液用甲醇逐級稀釋配制成混合對照品溶液系列,按照色譜條件測定。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得各目標(biāo)物的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表2。

以3倍信噪比(S/N)對應(yīng)的目標(biāo)物的質(zhì)量濃度作為檢出限(3S/N),結(jié)果見表2。

由表2可知,9種化學(xué)成分的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0,檢出限為0.1～0.7 mg·L－1。

表2 線性參數(shù)和檢出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

2.3 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

將花椒毒酚質(zhì)量濃度為4.8 mg·L－1、水合氧化前胡素質(zhì)量濃度為2.8 mg·L－1、白當(dāng)歸素質(zhì)量濃度為2.6 mg·L－1、補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度為0.8 mg·L－1、佛手苷內(nèi)酯質(zhì)量濃度為2.6 mg·L－1、白當(dāng)歸腦質(zhì)量濃度為2.8 mg·L－1、氧化前胡素質(zhì)量濃度為3.2 mg·L－1、歐前胡素質(zhì)量濃度為2.6 mg·L－1和異歐前胡素質(zhì)量濃度為1.2 mg·L－1的混合對照品溶液連續(xù)測定6次,計(jì)算9種化學(xué)成分的色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),考查儀器的精密度,結(jié)果見表3。

精密稱取樣品S1粉末0.2 g,按1.3節(jié)試驗(yàn)方法平行制備6份樣品溶液,進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),計(jì)算9種化學(xué)成分色譜峰面積的RSD,結(jié)果見表3。

精密稱取樣品S1粉末0.2 g,按1.3節(jié)試驗(yàn)方法制備樣品溶液,放置0,2,4,8,12,24,48 h后測定樣品溶液中9種化學(xué)成分的含量,計(jì)算9種化學(xué)成分色譜峰面積的RSD,考查樣品溶液的穩(wěn)定性,結(jié)果見表3。

由表3可知:混合對照品溶液中9種化學(xué)成分的色譜峰面積的RSD 為0.70%～1.8%,表明儀器精密度良好;6份樣品溶液中9種化學(xué)成分的色譜峰面積的RSD 為1.2%～2.4%,說明重復(fù)性較好;48 h內(nèi)樣品溶液中9種化學(xué)成分的色譜峰面積的RSD 為0.70%～2.2%,表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表3 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of tests for precision and stability

2.4 回收試驗(yàn)

精密稱取樣品S1粉末0.1 g,平行6份,進(jìn)行樣品加標(biāo)試驗(yàn),計(jì)算每種化學(xué)成分的回收率和測定值的RSD,結(jié)果見表4。

表4 回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of test for recovery(n＝6)

由表4 可知,9 種化學(xué)成分的回收率為99.1%～106%,測定值的RSD 為1.2%～2.5%,說明該方法的準(zhǔn)確度較好,可用于白芷中9種香豆素類化學(xué)成分含量的測定。

2.5 樣品分析

將產(chǎn)自四川、安徽、河北、河南的30批白芷藥材樣品按照1.3節(jié)試驗(yàn)方法制備成樣品溶液,按照色譜條件測定,計(jì)算9種化學(xué)成分在白芷藥材中的含量(以干燥品計(jì)算),結(jié)果見圖2。

圖2 30批白芷藥材樣品中9種化學(xué)成分的測定值Fig.2 Determined values of 9 chemical components in 30 batches of Angelica dahurica samples

結(jié)果表明,歐前胡素的平均含量最高(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 527μg·g－1),其次為氧化前胡素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)897μg·g－1),補(bǔ)骨脂素的平均含量最低(質(zhì)量分?jǐn)?shù)21μg·g－1)。

利用SPSS 26 軟件對未硫熏樣品和硫熏樣品中9種化學(xué)成分的含量分別進(jìn)行顯著性差異分析,結(jié)果如圖3 所示,“?”代表有顯著性差異(P＜0.05)。

圖3 硫熏對白芷藥材樣品中9種化學(xué)成分含量的影響Fig.3 Effect of sulphur fumigation on the contents of 9 chemical components in Angelica dahurica samples

結(jié)果顯示:未硫熏樣品和硫熏樣品中除花椒毒酚和補(bǔ)骨脂素含量無顯著性差異(P＞0.05),其余香豆素類化學(xué)成分含量均差異顯著(P＜0.05)。未硫熏樣品中歐前胡素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 161.2～2 794.7μg·g－1,氧化前胡素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為706.8～2 010.8μg·g－1,異歐前胡素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為576.3～1 003.7μg·g－1;硫熏樣品中歐前胡素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為236.6～893.0μg·g－1,氧化前胡素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3～2.9μg·g－1,異歐前胡素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為258.8～540.6μg·g－1,硫熏樣品中氧化前胡素、異歐前胡素、歐前胡素等的含量顯著低于未硫熏樣品。上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明硫熏的加工方法對白芷中香豆素類化學(xué)成分有顯著影響。

由于不同批次藥材樣品中9種香豆素類化學(xué)成分含量均有不同程度的差異,為進(jìn)一步分析不同批次白芷的質(zhì)量,以每批樣品中所測9種香豆素類化學(xué)成分含量的總和作為總香豆素含量,從圖4中可看出未硫熏樣品總香豆素含量明顯高于硫熏樣品,進(jìn)一步證明硫熏對白芷質(zhì)量有較大影響。

圖4 30批白芷藥材樣品中總香豆素含量Fig.4 Contents of total coumarins in 30 batches of Angelica dahurica samples

2.6 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.6.1 聚類分析

將所測30批白芷中9種香豆素類化學(xué)成分的含量利用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行CA,結(jié)果見圖5。

圖5 30批白芷藥材樣品的CA 結(jié)果Fig.5 Results of CA in 30 batches of Angelica dahurica samples

由圖5可知:各批次白芷樣品主要分為3類,所有硫熏樣品(S19～S30)聚為一類;產(chǎn)地為河南、河北的7批未硫熏樣品聚為一類,樣品編號為S1,S6,S9,S10,S12,S15和S18;產(chǎn)地為四川、安徽的11批未硫熏樣品聚為一類,樣品編號為S2～S5,S7,S8,S11,S13,S14,S16,S17。

2.6.2 主成分分析

利用SIMCA 14.1軟件對30批白芷藥材中9種化學(xué)成分的含量進(jìn)行PCA,共提取出2個主成分,其累積方差貢獻(xiàn)率為89.3%,包含了白芷藥材的大部分信息。從圖6中可以看出氧化前胡素、歐前胡素距離載荷圖原點(diǎn)較遠(yuǎn),表明氧化前胡素、歐前胡素對主成分的貢獻(xiàn)較大,對白芷藥材的整體質(zhì)量起主要作用。進(jìn)一步以主成分1和2得分做30批白芷藥材的PCA 得分圖,圖7表明PCA 結(jié)果與CA 結(jié)果基本一致,所有硫熏樣品聚為一類,產(chǎn)地為河南、河北的未硫熏樣品聚為一類,產(chǎn)地為四川、安徽的未硫熏樣品聚為一類。

圖6 30批白芷藥材樣品的主成分載荷圖Fig.6 Loading plot of principal components in 30 batches of Angelica dahurica samples

圖7 30批白芷藥材樣品的PCA 散點(diǎn)得分圖Fig.7 PCA scatter plot of 30 batches of Angelica dahurica samples

2.6.3 正交偏最小二乘法-判別分析

為進(jìn)一步分析不同類別白芷樣品之間的差異,依據(jù)CA 和PCA 結(jié)果,采 用SIMCA 14.1 軟件對30批白芷藥材樣品進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA 建模分析,散點(diǎn)得分圖見圖8,同CA 和PCA 分析結(jié)果基本一致,分為3類。該模型x軸方向的累積解釋率RX2和y軸方向的累積解釋率RY2分別為0.787和0.765,累計(jì)預(yù)測率Q2為0.674,均大于0.5,表明本試驗(yàn)所建立的模型成立[19],可用于白芷藥材的質(zhì)量控制。為進(jìn)一步確定對白芷藥材質(zhì)量貢獻(xiàn)較大的成分,利用變量重要性投影值(VIP)篩選,結(jié)果表明氧化前胡素、歐前胡素(VIP＞1.0)色譜峰對整體模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平,結(jié)果見圖9。這2個化合物是各批次白芷藥材產(chǎn)生差異的主要指標(biāo)性成分,該結(jié)果與PCA 中載荷圖尋找的對主成分貢獻(xiàn)較大的成分結(jié)果一致,表明氧化前胡素和歐前胡素的含量變化與白芷的質(zhì)量密切相關(guān)。單一指標(biāo)性成分的含量測定無法滿足白芷質(zhì)量評價,應(yīng)當(dāng)同時關(guān)注氧化前胡素和歐前胡素的含量變化。

圖8 30批白芷藥材樣品的OPLS-DA 散點(diǎn)得分圖Fig.8 OPLS-DA scatter plot of 30 batches of Angelica dahurica samples

圖9 30批次白芷藥材樣品中各化學(xué)成分的VIPFig.9 VIP plot of chemical components in 30 batches of Angelica dahurica samples

本工作采用HPLC對30批白芷藥材中9種香豆素類化學(xué)成分進(jìn)行測定,并結(jié)合CA、PCA、OPLS-DA 等分析手段,對白芷藥材質(zhì)量進(jìn)行了較為全面、系統(tǒng)、整體地分析,篩選出了與白芷質(zhì)量有關(guān)的指標(biāo)性成分氧化前胡素和歐前胡素。這不僅為白芷藥材的質(zhì)量評價提供了依據(jù),也為中藥材質(zhì)量控制指標(biāo)性成分的選擇提供了一種思路和方法。