魏龍威，牛亞凱，王振民，劉 陽,2，李 娟，陳 巍,2*

（1.河北師范大學(xué) 體育學(xué)院， 河北 石家莊 050024；2.河北省人體運動生物信息測評重點實驗室，河北 石家莊 050024）

肥胖與過度進(jìn)食及體力活動不足有關(guān)（陳巍等，2018；魏龍威 等，2020；Ferrario et al.，2016）。過度進(jìn)食通常由超越能量穩(wěn)態(tài)信號的獎賞環(huán)路所介導(dǎo)，該環(huán)路激活可增強(qiáng)進(jìn)食動機(jī)（魏龍威 等，2020；Ferrario et al.，2016）。其中，來自腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）的多巴胺（dopamine，DA）以及來自前額葉皮層和杏仁核的谷氨酸（glutamate，Glu）投射對此過程具有重要影響。上述神經(jīng)信息匯聚到腹側(cè)紋狀體γ-氨基丁酸能的中等棘狀神經(jīng)元（medium spiny neurons，MSNs）（Brown et al.，2017；Fer?rario et al.，2016）進(jìn)而產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。Glu是MSNs的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸型受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicaci re?ceptors，AMPARs）作為Glu的快速配體門控陽離子通道對紋狀體的突觸可塑性具有關(guān)鍵作用。肥胖易感群體處于同樣環(huán)境中具有更高的肥胖風(fēng)險，伏隔核對食物獎賞信息加工異?？赡苁欠逝诛L(fēng)險增加的重要原因之一（陳巍等，2018；Stice et al.，2010）。例如，肥胖易感動物伏隔核MSNs表現(xiàn)為過度興奮，引起皮層-基底神經(jīng)節(jié)獎賞信息網(wǎng)絡(luò)改變，進(jìn)食動機(jī)增強(qiáng)，這可能與伏隔核Glu傳遞增強(qiáng)有關(guān)（Oginsky et al.，2016，2019）。因此，肥胖也被視為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙（Souza-Fagundes et al.，2015），這可能包括單類神經(jīng)元或以局部病理性振蕩活動為特征的異常神經(jīng)元群活動。局部腦區(qū)振蕩活動會影響?yīng)勝p信號處理（Brown et al.，2011），伏隔核 AMPARs功能對神經(jīng)元及其局部群活動具有重要的調(diào)控作用。

運動可減少肥胖嚙齒類動物的過度進(jìn)食行為，緩解其體重增長（Chen et al.，2019；Lee et al.，2020）。研究表明，運動可改善PD動物運動皮層-紋狀體β振蕩相干系數(shù)和相位同步指數(shù)，并促進(jìn)其自主活動（時凱旋等，2020）；有氧運動可調(diào)節(jié)阿爾茲海默癥大鼠海馬區(qū)θ頻段異常振蕩活動改善記憶能力及認(rèn)知行為（Mehak et al.，2022）。鑒于AMPARs與神經(jīng)元及其局部群活動的關(guān)系，推測其可能參與了運動改善肥胖相關(guān)過度進(jìn)食行為。伏隔核作為誘導(dǎo)獎賞和成癮的關(guān)鍵腦區(qū)，其介導(dǎo)肥胖發(fā)生及其運動干預(yù)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制尚未完全闡明。Ca可滲透性AM?PA 受體（Ca-permeable AMPA receptors，CP-AMPARs）在肥胖引起伏隔核突觸可塑性改變中的作用已有報道（Alonso-Caraballo et al.，2021），但其如何調(diào)節(jié)進(jìn)食行為以及是否參與了有氧運動防治肥胖的過程，仍未取得一致認(rèn)識。本研究利用行為學(xué)、在體電生理學(xué)、分子生物學(xué)等手段，探討伏隔核CP-AMPARs在有氧運動調(diào)節(jié)肥胖易感大鼠食物獎賞中的作用。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物及分組

采用高脂飲食方案篩選肥胖易感（obesity-prone，OP）與肥胖抵抗（obesity-resistant，OR）大鼠。雄性SD大鼠（152.5 g±4.8 g）購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司［生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-0001］，鑒于術(shù)后恢復(fù)需要，采取單籠單只飼養(yǎng)，12 h/12 h晝夜循環(huán)，動物房溫度22℃～26℃。實驗程序嚴(yán)格遵守河北師范大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會要求（編號：2021LLSC050）。

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分為普通飲食組（C，n=15）和高脂飲食組（high food diet，HFD，n=45），分別給予普通飼料（3.31 kcal/g、12.5%脂肪、62.9%碳水化合物、24.6%蛋白質(zhì)）和高脂飼料（5.24 kcal/g、60%脂肪、20%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)）。每3天稱一次大鼠體質(zhì)量，每天計算熱量攝入。自由飲水、進(jìn)食8周后，以體質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)篩選OP大鼠（HFD體質(zhì)量前1/3大鼠，n=15）和OR大鼠（HFD體質(zhì)量后1/3大鼠，n=15）。OP組隨機(jī)分為肥胖易感對照組（OPC）和肥胖易感運動組（OPE），OR組隨機(jī)分為肥胖抵抗對照組（ORC）和肥胖抵抗運動組（ORE），每組7只。

1.2 運動干預(yù)及給藥方案

運動方案參考H?ydal等和Wang等的研究（H?ydal et al.，2007；Wang et al.，2020）：采用電動跑臺，零坡度，初始速度為14 m/min，每周增加2 m/min。訓(xùn)練時間50 min/天，其中熱身及整理活動速度均為10 m/min×5 min，每周連續(xù)訓(xùn)練6天，持續(xù)6周。

藥物輸注方案：將CP-AMPARs選擇性拮抗劑NASPM（20 μg/0.5 μL）溶于含 6%DMSO 的 ACSF溶液。給藥時將導(dǎo)管與微量注射泵相連，以0.25 μL/min的速度進(jìn)行藥物輸注，輸注1 μL后注射內(nèi)管停留10 min，封閉防塵帽（Derman et al.，2018；Twomey et al.，2018）。

1.3 操作式條件反射進(jìn)食行為訓(xùn)練及測試

8周高脂飲食及分組后進(jìn)行操作式條件反射進(jìn)食行為訓(xùn)練，當(dāng)大鼠按下獎賞側(cè)壓桿時，指示燈亮并釋放1粒適口性食物。按下非獎賞側(cè)壓桿時，另一指示燈亮但不釋放食物。每次訓(xùn)練將兩側(cè)壓桿互換位置，訓(xùn)練及測試時間均為45 min/天，訓(xùn)練期第1～7天大鼠以固定按壓比率FR1（fixed ratio 1，F(xiàn)R1）自給食物，即主動按壓獎賞壓桿1次可獲1粒食物。第8～12天為固定按壓比率FR3（即主動按壓獎賞壓桿3次可獲1粒食物）、第13～17天為固定按壓比率FR5（即主動按壓獎賞壓桿5次可獲1粒食物）。第18、19天進(jìn)行漸進(jìn)比率（progressive ratio，PR）測試期（Brown et al.，2017）。PR 測試期漸進(jìn)比率=［5e］-5，其中R為已獲食物顆粒數(shù)加1（Alonso-Caraballo et al.，2019；Richardson et al.，1996；Sharma et al.，2012）。漸進(jìn)比率計劃為1、2、4、6、9、12、15、20、25、32、40、50、62、77、95、118、145、178、219、268、328、402、492、603……。以此得出PR測試期對應(yīng)的斷點（Breakpoint）值（兩次按壓間隔超過20 min或45 min測試總時到，判定終止）。訓(xùn)練期給予大鼠的食量為日常每日攝入量的70%～80%（Inbar et al.，2019；Oginsky et al.，2019）。運動干預(yù)6周及伏隔核CP-AMPARs拮抗劑給藥后，分別再次進(jìn)行測試。訓(xùn)練及測試時間段為19：00至次日07：00。

1.4 條件位置偏愛測試

條件位置偏愛（conditioned place preference，CPP）檢測箱（40 cm×70 cm×40 cm）包括3個不同背景隔室，其中，中間為白色，一側(cè)為灰色，另一側(cè)黑白相間。訓(xùn)練前，預(yù)先讓大鼠熟悉環(huán)境，大鼠在每個隔室停留時間無顯著差異。首先，給予大鼠1 g適口性食物以避免食物新穎性影響。訓(xùn)練中，隨機(jī)分配10 g適口性食物放置任一室內(nèi)，然后將大鼠放置中間室，自由活動15 min，連續(xù)訓(xùn)練8天后正式測試（Tuplin et al.，2019）。當(dāng)大鼠全身2/3處于新室時，可判定其已從一室移至另一室。計算大鼠進(jìn)入每一室停留總時間，根據(jù)“［獎賞區(qū)所處總時間/（獎賞區(qū)所處總時間＋非獎賞區(qū)所處總時間）］×100%”計算適口性食物誘導(dǎo)的條件位置偏愛度。運動干預(yù)后及伏隔核CPAMPARs拮抗劑給藥后分別再次測試。

1.5 給藥導(dǎo)管及電極植入手術(shù)

大鼠禁食24 h后，腹腔注射水合氯醛（0.35 mL/100 g）深度麻醉后固定于腦立體定位儀，下置保溫墊。使前后囟處同一水平，根據(jù)大鼠腦立體圖譜（Paxinos et al.，1997）以前囟為零點定位伏隔核，顱骨鉆打孔，將給藥套管固定于夾持器以0.2 mm/min推進(jìn)速度植入伏隔核上方（AP：1.4 mm，ML：-2.2 mm；DV：-5.6 mm）。將4個不銹鋼螺釘植入顱骨作為錨點，連接地線。選取伏隔核核部（AP：＋0.8～2.2 mm，ML：1.2～2.4 mm；DV：-6.5～-7.5 mm）植入16通道陣列電極（電極間距100 μm，2×8模式），監(jiān)測各通道神經(jīng)元活動，出現(xiàn)3通道穩(wěn)定信號后，利用生物硅膠封口，牙科水泥固定，術(shù)后連續(xù)3天腹腔注射10萬單位青霉素，然后按原方案繼續(xù)飼養(yǎng)。實驗結(jié)束后采用尼氏染色確定導(dǎo)管及電極位置（圖1）。

圖1 大鼠給藥導(dǎo)管埋藏與電生理手術(shù)記錄位點示意圖Figure 1.Schematic Diagram of Recording Sites of Drug Administration Catheter Embedding and Electrophysiologic Operation in Rats

1.6 Western blotting

禁食24 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.40 mL/100 g）麻醉，生理鹽水主動脈灌流，迅速取腦，置冰上分離腹側(cè)紋狀體。稱取30 mg紋狀體組織，按100 mg/mL加入300 μL細(xì)胞裂解液，超聲粉碎，4℃靜置2 h，12 000 r/min離心20 min，取上清液。采用BCA法測蛋白濃度，加熱變性后，-80℃儲存。配制10%分離膠，4%濃縮膠，膠孔加蛋白樣品，恒壓80 V電泳50 min后，改為恒壓150 V繼續(xù)電泳120 min。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，300 mA恒流2.5 h，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；TBST清洗3次，每次5 min，一抗4℃孵育過夜（abcam，GluA1 1∶2 000；GluA2 1∶5 000），TBST洗膜4次，分別為5 min、10 min、10 min、5 min，加入二抗室溫低速搖床孵育1.5 h，TBST洗膜5次，每次5 min，加同體積混合顯影液和定影液后蛋白條帶發(fā)光，F(xiàn)usion FX成像系統(tǒng)分析，以目標(biāo)條帶與β-actin的積分光密度（IOD）比值表示相對表達(dá)量。

1.7 免疫熒光實驗

禁食24 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.40 mL/100 g）過度麻醉，生理鹽水主動脈灌流，迅速取腦。脫水后OCT包埋，切片（4 μm），切片置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH=6.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)中火8 min至沸，?；? min，再轉(zhuǎn)中低火7 min，置PBS（pH=7.4）洗滌3次，每次5 min，后血清封閉，滴加BSA，封閉30 min。加一抗4℃孵育過夜（abcam，GluA1∶1 00，GluA2 1∶200），玻片置于PBS（pH=7.4）中搖床洗滌3次，每次5 min。加二抗，避光室溫孵育50 min。PBS（pH=7.4）洗滌3次，每次5 min，滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min，淬滅組織加自發(fā)熒光淬滅劑5 min，后沖洗10 min。甩干后抗熒光淬滅封片劑封片，鏡檢拍照，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。使用Image J軟件定量分析免疫熒光結(jié)果，測得陽性細(xì)胞數(shù)量。每一樣本均選取伏隔核核部區(qū)域，測量免疫陽性細(xì)胞表達(dá)。

1.8 電生理數(shù)據(jù)采集及分析

設(shè)置Spike帶通250 Hz，采樣頻率2 000 Hz，記錄電信號。單次信號采集時間20 min～30 min。分別采用Neu?roExplorer、Offline Sorter分析局部場電位（local field poten?tials，LFPs）、峰電位（spike）、Spike-LFPs相干性等。超過3∶1信噪比和自動波形檢測功能設(shè)置閾值，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）、K-均值（K-mean）及波谷波峰（valley-seeking）算法將每個通道波形分離成不同簇。根據(jù)神經(jīng)元波形、峰谷持續(xù)時間、峰峰間隔直方圖、峰峰持續(xù)時間、放電頻率及波形對稱指數(shù)等識別Spike。P＜0.05為獨立聚類間差異顯著（Geng et al.，2019；Wang et al.，2016）。

LFPs分為 5 個主頻段：delta（1～4 Hz）、theta（4～8 Hz）、alpha（8～12 Hz）、beta（12～30 Hz）和 gamma（30～80 Hz）。Spike-LFPs相干值顯示伏隔核Spike與LFPs間的關(guān)系（圖2），通過計算每一個通道LFPs和Spike譜函數(shù)Sx(f)和Sy(f)互譜Sxy(f)，可計算頻域相干函數(shù)Cxy(f)（劉迢迢 等，2011；Van Der Meer et al.，2009；）。

圖2 Spike與LFPs振蕩關(guān)系示意圖Figure 2.Diagram of Spike and LFPs Oscillation

計算一個固定窗口Spike-LFPs數(shù)據(jù)在頻域相干函數(shù)Cxy(f)，以步長逐個移動時間窗口，Cxy(f)為時間t的函數(shù)，記為：

式中：Sx(f，t)、Sy(f，t)、Sxy(f，t)為一通道同時記錄不同模態(tài)信號LFPs和Spike的Multitaper頻譜和互譜；Cxy(f，t)為2者在頻率f、時間t時相干值，表示同一通道LFPs和Spike在頻率域中同步程度及其隨時間變化相干值，相干值在0和1之間變化，0表示兩個信號在該頻域無關(guān)系，1表示完全相關(guān)。

1.9 統(tǒng)計分析

計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，采用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8軟件分析數(shù)據(jù)及制圖。不同組別大鼠體質(zhì)量、熱量攝入在不同時間的比較，采用重復(fù)測量雙因素方差分析（two-way repeated measures ANOVA）。運動干預(yù)前行為變化比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。運動干預(yù)后各變量比較采用雙因素方差分析（two-way ANOVA）；以“運動”與“肥胖程度”為主因素，交互效應(yīng)顯著（P＜0.05）進(jìn)行簡單效應(yīng)分析，不顯著（P＞0.05）比較主效應(yīng)；每個因素主效應(yīng)顯著（P＜0.05），表示存在組間差異。多重比較采用Turkey檢驗，相關(guān)性采用Pear?son檢驗，顯著水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食后大鼠體質(zhì)量及熱量攝入變化

8周高脂飲食后，大鼠體質(zhì)量增加呈正態(tài)分布（圖3A）。按標(biāo)準(zhǔn)將HFD大鼠分為OP大鼠（575.5 g±13.3 g）和OR大鼠（478.3 g±10.5 g）。大鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長，“時間”與“飲食”存在顯著交互效應(yīng)（P＜0.01）。OP組大鼠體質(zhì)量增長顯著高于C組與OR組大鼠（P＜0.01，圖3B）。此外，大鼠熱量攝入呈遞增趨勢，“時間”與“飲食”存在交互效應(yīng)（P＜0.05）。OP組大鼠熱量攝入顯著高于C組與OR組大鼠（P＜0.01，圖3C）。

圖3 前8周各組大鼠體質(zhì)量及熱量攝入變化Figure 3.Changes of Body Weight and Caloric Intake in Each Group at the First 8 Weeks

2.2 高脂飲食后大鼠進(jìn)食行為學(xué)變化

如圖4B～I(xiàn)，8周高脂飲食后，大鼠操作式條件反射進(jìn)食行為訓(xùn)練中FR1測試期獎賞壓桿次數(shù)存在組間差異。與C組大鼠比較，OP大鼠獎賞壓桿次數(shù)顯著增高（P＜0.05）。FR3測試期與FR5測試期獎賞壓桿次數(shù)均存在組間差異，OP大鼠獎賞壓桿次數(shù)顯著高于C組和OR大鼠（P＜0.05）。漸進(jìn)比率PR測試期獎賞壓桿次數(shù)結(jié)果顯示，與C組和OR組比較，OP組大鼠獎賞壓桿次數(shù)均顯著升高（P＜0.01）。OP大鼠的斷點值顯著高于C組大鼠（P＜0.001）與OR大鼠（P＜0.01）。此外，OP大鼠在PR測試期獎賞壓桿次數(shù)（R=0.561，P＜0.05）及斷點值（R=0.567，P＜0.05）與體質(zhì)量增長均呈顯著正相關(guān)。

圖4 8周高脂飲食后各組大鼠行為學(xué)測試結(jié)果Figure 4.Behavioral Test Results in Each Group after 8 Weeks of Diet

8周高脂飲食后，大鼠進(jìn)行8天適口性食物誘導(dǎo)CPP訓(xùn)練，OP大鼠與OR大鼠適口性食物誘導(dǎo)CPP偏愛度顯著高于C組大鼠（P＜0.05）。OP大鼠體質(zhì)量增加與適口性食物誘導(dǎo)CPP偏愛度呈顯著正相關(guān)（R=0.284，P＜0.05）。

2.3 運動干預(yù)后大鼠體質(zhì)量與熱量攝入變化

結(jié)果顯示，6周有氧運動后，大鼠體質(zhì)量與熱量攝入均存在組間差異（圖5A～C）?！斑\動”與“肥胖程度”不存在交互效應(yīng)（P＞0.05）。ORE組大鼠與OPE組大鼠體質(zhì)量從運動干預(yù)第6天開始顯著下降（P＜0.01）。此外，ORE組大鼠在運動干預(yù)第12天后每日熱量攝入均顯著低于ORC組大鼠（P＜0.05，P＜0.01），OPE組大鼠在運動干預(yù)第6天后每日熱量攝入顯著低于OPC組大鼠（P＜0.01）。此外，運動干預(yù)后大鼠體質(zhì)量增長率存在組間差異。與ORC大鼠比較，OPC大鼠體質(zhì)量增長率顯著升高，ORE大鼠顯著降低（P＜0.05），而OPE大鼠體質(zhì)量較OPC大鼠顯著降低（P＜0.01）。

圖5 大鼠體質(zhì)量與熱量攝入變化Figure 5.Changes of Weight Gain and Caloric Intake in Rats

2.4 運動干預(yù)后大鼠進(jìn)食行為學(xué)變化

結(jié)果顯示，運動干預(yù)后FR1測試期、FR3測試期、FR5測試期、PR測試期獎賞壓桿次數(shù)及斷點值均存在組間差異（圖6A～E）?！斑\動”與“肥胖程度”間無交互效應(yīng)（P＞0.05）。OPC大鼠FR1測試期、FR3測試期、FR5測試期、PR測試期獎賞壓桿次數(shù)及斷點值均顯著高于ORC大鼠（P＜0.05）。與OPC大鼠比較，OPE大鼠FR1測試期、FR5測試期、PR測試期獎賞壓桿次數(shù)及斷點值均顯著降低（P＜0.05）。

圖6 運動干預(yù)后大鼠進(jìn)食行為測試結(jié)果Figure 6.Comparison of Feeding Behavior after Exercise Intervention

6周有氧運動后，大鼠適口性食物誘導(dǎo)的CPP偏愛度顯著改變?！斑\動”與“肥胖程度”間無交互效應(yīng)（P＞0.05），OPE大鼠適口性食物誘導(dǎo)的CPP偏愛度顯著低于OPC大鼠（P＜0.05，圖6F）。

2.5 伏隔核NASPM注射對大鼠進(jìn)食行為學(xué)的影響

伏隔核注射CP-AMPARs拮抗劑NASPM后，F(xiàn)R1測試期、FR3測試期、FR5測試期、PR測試期獎賞壓桿次數(shù)及斷點值均顯著改變（圖7A～E）?！斑\動”與“肥胖程度”間無交互效應(yīng)（P＞0.05）。OPC大鼠的FR3測試期、FR5測試期、PR測試期獎賞壓桿次數(shù)及斷點值均顯著高于ORC大鼠（P＜0.01或P＜0.05）。與OPC大鼠比較，OPE大鼠的FR1測試期與FR5測試期獎賞壓桿次數(shù)顯著降低（P＜0.05）。以8周高脂飲食后結(jié)果為基礎(chǔ)，計算伏隔核NASPM注射后FR1測試期、FR3測試期、FR5測試期、PR測試期獎賞壓桿次數(shù)及斷點值的變化比值（圖7F～J）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“運動”與“肥胖程度”間無交互效應(yīng)（P＞0.05），OPC大鼠的FR1測試期與PR測試期獎賞壓桿次數(shù)下降比顯著低于ORC大鼠（P＜0.05）。與OPC大鼠比較，OPE大鼠的FR1測試期、FR3測試期、PR測試期獎賞壓桿次數(shù)與斷點值的下降比均顯著上升（P＜0.05）。

注射CP-AMPARs拮抗劑NASPM后，大鼠適口性食物誘導(dǎo)CPP偏愛度顯著改變?！斑\動”與“肥胖程度”間無交互效應(yīng)（P＞0.05），OPC大鼠的偏愛度顯著高于ORC大鼠（P＜0.05），OPE大鼠的偏愛度顯著低于OPC大鼠（P＜0.01，圖7K）。以8周高脂飲食后結(jié)果為基礎(chǔ)，計算伏隔核NASPM注射后偏愛度的變化比值。結(jié)果顯示“運動”與“肥胖程度”間無交互效應(yīng)（P＞0.05），OPC大鼠偏愛度的下降比顯著低于ORC大鼠（P＜0.05），而OPE大鼠的下降比顯著高于OPC大鼠（P＜0.05，圖7L）。

圖7 伏隔核NASPM注射后大鼠進(jìn)食行為變化Figure 7.Changes in Feeding Behavior after NASPM Injection in Nucleus Accumbens

2.6 腹側(cè)紋狀體及伏隔核GluA1與GluA2蛋白表達(dá)變化

2.6.1 腹側(cè)紋狀體GluA1與GluA2蛋白表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，“運動”與“肥胖程度”對腹側(cè)紋狀體GluA1與GluA2蛋白表達(dá)影響無交互效應(yīng)（P＞0.05），OPC大鼠GluA1表達(dá)顯著高于ORC大鼠（圖8A、8B），GluA2表達(dá)則低于ORC大鼠（圖8C），而GluA1∶GluA2表達(dá)比值顯著高于ORC大鼠（P＜0.05，圖8D）。此外，與ORC大鼠比較，ORE大鼠的GluA2表達(dá)升高，GluA1∶GluA2比值則顯著降低（P＜0.05）。與OPC大鼠比較，OPE大鼠的GluA1表達(dá)降低，GluA2表達(dá)增加，GluA1∶GluA2比值降低，差異顯著（P＜0.05）。

2.6.2 伏隔核核部GluA1與GluA2蛋白表達(dá)及共表達(dá)情況

免疫熒光實驗結(jié)果顯示，大鼠伏隔核核部膜表面GluA1、GluA2及其共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)量存在組間差異。“運動”與“肥胖程度”間無交互效應(yīng)（P＞0.05）。OPC大鼠伏隔核核部GluA1、GluA2及其共表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著高于ORC大鼠（P＜0.05）。此外，與OPC大鼠比較，OPE大鼠GluA1、GluA2、共表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)量及GluA1與GluA2膜表面細(xì)胞比值均顯著降低（P＜0.05，圖8F～J）。

圖8 腹側(cè)紋狀體及伏隔核核部GluA1與GluA2蛋白表達(dá)Figure 8.Expression of GluA1 and GluA2 in Ventral Striatum and Nucleus Accumbens Core

2.7 伏隔核神經(jīng)元Spike類型分析

本研究記錄了12只大鼠伏隔核神經(jīng)元活動，共篩選出41個MSNs，其在3個主要成分中呈不同分布（圖9A、9B），放電較規(guī)則，頻率為1.58±1.46 Hz，且基線放電率低于5 Hz（圖9C），結(jié)合峰峰間期（interspike interval，ISI）直方圖及自相關(guān)圖直方圖（圖9F、9G），根據(jù)神經(jīng)元波形特征（圖9E、9H）篩選出谷峰持續(xù)時間、峰峰持續(xù)時間、波形對稱指數(shù)和平均發(fā)放頻率的變異系數(shù)（CV）可區(qū)分MSNs（圖 9I～M）（Bakhurin et al.，2016；Bouabid et al.，2018；Sjul?son et al.，2018；Soares-Cunha et al.，2018）。

與ORC大鼠比較，OPC大鼠的MSNs平均發(fā)放頻率顯著增高（P＜0.01），ORE大鼠顯著降低（P＜0.01）。與OPC大鼠比較，OPE大鼠MSNs的平均發(fā)放頻率顯著降低（P＜0.01，圖9D）。

圖9 伏隔核神經(jīng)元分類Figure 9.Classification of Neurons in Nucleus Accumbens

2.8 伏隔核LFPs及Spike-Field相干性分析

大鼠伏隔核LFPs功率譜密度值對比中各組大鼠θ頻段（4～8 Hz）功率譜密度出現(xiàn)顯著差異（圖10A、10B）。與ORC大鼠比較，OPC大鼠伏隔核LFPs在θ頻段（4～8 Hz）功率譜密度顯著增高（P＜0.01），ORE大鼠則顯著降低（P＜0.05）。與OPC大鼠比較，OPE大鼠功率譜密度呈現(xiàn)降低，差異顯著（P＜0.01，圖10C）。此外，LFPs功率頻譜分析中，與ORC大鼠比較，OPC大鼠（4～8 Hz）振蕩能量帶增強(qiáng)，ORE大鼠對比ORC大鼠，OPE大鼠比OPC大鼠減弱（圖10D、10E）。在各組大鼠MSNs的Spike-LFPs相干性對比中，θ頻段出現(xiàn)差異（圖10F、10G）。與ORC大鼠比較，OPC大鼠MSNs的Spike-LFPs相干性在θ頻段顯著升高（P＜0.001），OPE大鼠則顯著降低（P＜0.01，圖10H）。

圖10 伏隔核功率譜密度及Spike-LFPs相干值比較Figure 10.Comparison of Nucleus Accumbens Power Spectral Density and Coherence Values of Spike-LFPs

3 分析與討論

與高適口食物相關(guān)的線索即使在能量儲備充足時，仍可引發(fā)進(jìn)食行為，肥胖易感個體對食物線索誘導(dǎo)的進(jìn)食動機(jī)更為明顯，同時伴隨中腦邊緣環(huán)路更強(qiáng)的激活（Yo?kum et al.，2014）。表明肥胖易感個體中腦邊緣系統(tǒng)對食物線索的動機(jī)反應(yīng)存在異常，這與過度進(jìn)食及體質(zhì)量增加有關(guān)（魏龍威 等，2020；Ferrario et al.，2016）。觸發(fā)進(jìn)食動機(jī)的關(guān)鍵是食物獎賞，后者是指通過多種神經(jīng)心理學(xué)成分賦予食物積極價值。改善食物獎賞對矯正異常進(jìn)食行為及防治肥胖具有重要意義。前期研究已證實，有氧運動對緩解肥胖及其相關(guān)進(jìn)食行為異常具有積極作用（曹姍姍 等，2020；陳巍 等，2018；Chen et al.，2019）。然而，其中的具體調(diào)控機(jī)制尚未明確。

3.1 有氧運動對肥胖易感大鼠進(jìn)食行為的調(diào)節(jié)作用

通過數(shù)周的高脂飲食，部分嚙齒類動物的體質(zhì)量會迅速增加，而部分動物的體質(zhì)量增長并不明顯，甚至略低于普通飼料喂養(yǎng)的動物。利用這種特性，根據(jù)體質(zhì)量的三分位或四分位法可成功篩選出OP與OR表型動物，這與人群肥胖發(fā)生的異質(zhì)性相似（Barry et al.，1997；Brown et al.，2017；Giles et al.，2016；Lu et al.，2021；Rada et al.，2010）。本研究采用8周高脂飲食方案，以三分位法成功篩選出OP與OR大鼠。采用操作式條件反射及條件位置偏愛實驗評價大鼠的進(jìn)食動機(jī)及食物獎賞。研究發(fā)現(xiàn)，OP大鼠進(jìn)食適口性食物的動機(jī)較OR大鼠明顯增強(qiáng)，且與體質(zhì)量增長呈顯著正相關(guān)，即OP大鼠需攝入更多適口

性食物才可達(dá)到預(yù)期的食物獎賞。長期高脂飲食可改變伏隔核突觸可塑性（Ankney et al.，2018），因為高適口性食物與具有強(qiáng)化效應(yīng)的藥物一樣可增加中腦邊緣環(huán)路和伏隔核內(nèi)的Glu能傳遞（許本柯 等，2018；Brown et al.，2011），引起伏隔核神經(jīng)元樹突棘、突觸聯(lián)系及Glu受體表達(dá)改變（Dingess et al.，2017）。在藥物成癮模型中，皮層-伏隔核Glu能突觸可塑性在強(qiáng)迫性覓藥行為中同樣發(fā)揮了重要作用（Ankney et al.，2018）。因此，伏隔核MSNs的Glu能突觸傳遞異常是藥物成癮的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)（Bag?etta et al.，2012；Shen et al.，2011）。OP大鼠伏隔核核部突觸存在類似功能障礙（Brown et al.，2017），提示本研究中OP大鼠食物獎賞不足及進(jìn)食動機(jī)增強(qiáng)可能與伏隔核Glu能信號改變有關(guān)。經(jīng)過6周有氧運動干預(yù)，不僅OP大鼠的體質(zhì)量及熱量攝入增長得到了緩解，同時還改善了食物獎賞并降低了進(jìn)食動機(jī)。采用藥理學(xué)手段逆轉(zhuǎn)飲食誘導(dǎo)的伏隔核Glu能突觸功能變化可改善進(jìn)食行為異常（Alonso-Caraballo et al.，2021；Moussawi et al.，2009），提示有氧運動對OP大鼠進(jìn)食行為的影響可能也與伏隔核Glu能的突觸功能變化有關(guān)。

3.2 有氧運動對肥胖易感大鼠伏隔核CP-AMPARs表達(dá)與功能的影響

伏隔核信息傳遞在很大程度上依賴AMPARs的激活（Benke et al.，2019）。生理狀態(tài)下，伏隔核內(nèi)存在少量缺乏GluA2亞基（GluA1/1或GluA1/3）的AMPARs（CP-AMPARs），其對Ca具有高通透性及內(nèi)向整流作用，在Glu突觸可塑性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究表明，CP-AMPARs激活對食物和藥物誘導(dǎo)的動機(jī)反應(yīng)是必要的（Derman et al.，2018；Ferrario.2017；Oginsky et al.，2016a）。本研究發(fā)現(xiàn)，OP大鼠伏隔核核部膜表面AMPARs及CP-AMPARs陽性細(xì)胞數(shù)量顯著高于OR大鼠。這與Derman等（2018）的結(jié)果一致。AMPARs及其亞基只有嵌合插入質(zhì)膜表面才具有生物活性，膜表面AMPARs水平變化與突觸傳遞的動態(tài)調(diào)節(jié)密切相關(guān)（Choquet，2010）。由此推測，OP大鼠伏隔核核部CP-AMPARs突觸插入增加。另有研究顯示，OP大鼠伏隔核核部膜表面GluA1亞基的增加伴隨著胞內(nèi)GluA1表 達(dá) 上 調(diào)（Alonso-Caraballo et al.，2021；Derman et al.，2018）。入膜后的AMPARs及CP-AMPARs內(nèi)化速度更快，這會影響到突觸傳遞。由此可見，伏隔核核部具有更多的CP-AMPARs突觸插入，這可能是OP大鼠進(jìn)食動機(jī)及體質(zhì)量增加的重要原因之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，6周有氧運動可降低OP大鼠伏隔核核部膜表面AMPARs與CP-AMPARs陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量，提示有氧運動對肥胖相關(guān)進(jìn)食行為的影響可能與此有關(guān)。長期高脂飲食會在很大程度上選擇性降低適口性食物的獎賞成分及轉(zhuǎn)換效價，引發(fā)食物獎賞不足，進(jìn)而攝取更多的適口性食物才可獲得預(yù)期獎賞。在獎賞尋求效價編碼模型中，伏隔核MSNs中的CPAMPARs突觸插入通過改變不同類型神經(jīng)元之間的興奮性調(diào)節(jié)獎賞閾值，進(jìn)而外化為進(jìn)食動機(jī)（Carr，2020）?？梢?，有氧運動可通過改變伏隔核核部GluA1與GluA2的表達(dá)水平及CP-AMPARs功能，調(diào)節(jié)食物獎賞，緩解OP大鼠過高的進(jìn)食動機(jī)。

目前，關(guān)于高脂飲食如何誘發(fā)并維持CP-AMPARs的突觸插入及膜轉(zhuǎn)運，尚未完全闡明。有研究認(rèn)為，CP-AMPARs的突觸插入及膜轉(zhuǎn)運的生理變化可能是一種維持獎賞穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞反應(yīng)（Alonso-Caraballo et al.，2021；Carr，2020）。有氧運動提高OP大鼠伏隔核AMPARs中GluA2磷酸化水平及突觸占有率，可引起Ca通道內(nèi)產(chǎn)生正電荷，阻斷陽離子流動，降低Ca電導(dǎo)，減少Glu突觸強(qiáng)度（Lee，2012；Teichert et al.，2017）。此外，DA不足可能是促進(jìn)CP-AMPARs突觸轉(zhuǎn)運的另一個相關(guān)事件，諸如DA缺失的PD小鼠模型中紋狀體GluA1和GluA1-Ser845磷酸化水平明顯上升（Koutsokera et al.，2014）。DA缺失可引起背側(cè)紋狀體突觸CP-AMPARs轉(zhuǎn)運增加（Bagetta et al.，2012）。長期高脂飲食可降低紋狀體DA基礎(chǔ)水平，提示OP大鼠伏隔核CPAMPARs上調(diào)可能與DA傳遞改變有關(guān)。而運動干預(yù)可改變PD動物紋狀體AMPARs特異性亞基表達(dá)及胞外Glu水平（陳巍 等，2015；時凱旋 等，2020；Fisher et al.，2004），同時在肥胖動物模型研究中，運動干預(yù)可通過提高中腦-紋狀體酪氨酸羥化酶的表達(dá)，提高紋狀體DA水平，改善肥胖動物高脂飲食偏愛（陳巍等，2018）。這些研究均表明，伏隔核AMPARs具有較強(qiáng)的運動依賴可塑性。

AMPARs的Ca通透性取決于四聚體內(nèi)是否存在GluA2亞基（雷蕾 等，2015；Twomey et al.，2018；Wright et al.，2012；）。CP-AMPARs的選擇性拮抗劑 NASPM 可阻斷陽離子流動，在短時間內(nèi)調(diào)節(jié)Glu突觸強(qiáng)度（Lalanne et al.，2018；Twomey et al.，2017，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過6周有氧運動，OP大鼠進(jìn)食行為指標(biāo)在伏隔核NASPM注射后測試中變化更明顯。提示伏隔核CP-AMPARs在有氧運動調(diào)節(jié)OP大鼠食物獎賞與進(jìn)食動機(jī)中具有關(guān)鍵作用。

3.3 有氧運動調(diào)節(jié)肥胖易感大鼠伏隔核神經(jīng)元活動

MSNs可接受并整合來自前額葉皮層、海馬和杏仁核等的Glu信號，以及來自中腦的DA信號，進(jìn)而驅(qū)動動機(jī)性行為。OP和OR群體的DA系統(tǒng)存在潛在的基礎(chǔ)差異已有報道（Cosgrove et al.，2015；Volkow et al.，2008，2011）。此外，OP與OR大鼠伏隔核核部的MSNs興奮性也存在差異（Alonso-Caraballo et al.，2021；Oginsky et al.，2019），其原因可能與Glu傳遞有關(guān)（Kasanetz et al.，2009）。OP大鼠MSNs的AMPARs介導(dǎo)的內(nèi)向整流性K電流（IKir）和A型K電流（IA）提高可引起其興奮性增強(qiáng)，進(jìn)而改變核團(tuán)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動（Alonso-Caraballo et al.，2019；Oginsky et al.，2016b，2019）。例如，探索新異環(huán)境時，ClockΔ19 KO小鼠由于DA信號增強(qiáng)，而表現(xiàn)出伏隔核神經(jīng)振蕩的跨頻相位偶聯(lián)與中腦邊緣系統(tǒng)相一致的現(xiàn)象（Dzirasa et al.，2010）。而伏隔核相位偶聯(lián)依賴于Glu信號，其受體功能變化可引起MSNs突觸重塑（Wolf et al.，2005）。高脂飲食動物表現(xiàn)為DA系統(tǒng)及獎賞環(huán)路障礙時，可能已改變了伏隔核神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動，但是運動調(diào)節(jié)伏隔核AMPARs功能是否改變其神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動，鮮見報道。

Spike-LFPs相干性代表了局部神經(jīng)核團(tuán)單個神經(jīng)元活動與神經(jīng)系統(tǒng)集合LFPs之間的同步性，可描述神經(jīng)元的通訊與編碼機(jī)制（Buzsaki，2010；Buzsaki et al.，2014）。在感知、注意、記憶和運動控制等研究中廣泛使用。例如，在PD模型中被用于皮層-基底神經(jīng)節(jié)通路變化的機(jī)制分析（Buzsaki et al.，2012，2014；Geng et al.，2019），發(fā)現(xiàn)PD動物模型腳橋核（pedunculopontine nucleus，PPN）和運動皮層之間發(fā)生Spike-LFPs相干性改變是其行為障礙的重要原因。獎賞任務(wù)的研究也顯示，腹側(cè)紋狀體及伏隔核Spike-LFPs相干性與動機(jī)性行為有關(guān)（An et al.，2019；Berke.2009；Tanaka et al.，2018）。本研究中，OP大鼠伏隔核MSNs的Spike-LFPs相干性θ頻段節(jié)律性振蕩功率顯著上升，而θ頻段節(jié)律性振蕩變化是獎賞回路對反饋性刺激響應(yīng)的重要組成部分（Amarante et al.，2017；Knudsen et al.，2020；McCane et al.，2018）。因此推測，OP大鼠伏隔核AMPARs改變導(dǎo)致MSNs過度興奮，從而引起伏隔核LFPs特定獎賞相關(guān)頻段改變。LFPs可反映記錄電極附近神經(jīng)元的突觸活動總和（Buzsaki et al.，2012；Denker et al.，2011；Nauhaus et al.，2009）。與本研究結(jié)果類似，非人靈長類動物研究中，與獎賞相關(guān)信息的編碼在低頻信號（＜32 Hz）中同步，而高頻信號（＞33 Hz）與預(yù)測獎賞值呈負(fù)相關(guān)。高頻信號可能反映了獎賞抑制過程，這為解釋獎賞信息多維處理提供了新的見解（Pasquereau et al.，2019）。有氧運動干預(yù)后，OP大鼠伏隔核LFPs的θ頻段節(jié)律性振蕩功率顯著下降，提示有氧運動通過調(diào)節(jié)伏隔核神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接在一定程度上恢復(fù)了該核團(tuán)的功能完整性，從而改善了食物獎賞及進(jìn)食行為，為降低肥胖易感風(fēng)險發(fā)揮了積極作用。

4 結(jié)論

6周有氧運動干預(yù)可改善肥胖易感大鼠的食物獎賞功能，降低進(jìn)食動機(jī)，并延緩體質(zhì)量增長，相關(guān)機(jī)制可能與有氧運動降低了肥胖易感大鼠伏隔核核部膜表面GluA1：GluA2表達(dá)比值，減少CP-AMPARs突觸插入，降低伏隔核MSNs的Spike-LFPs異常同步活動有關(guān)。