柯娜，郝志云，王建清，甄慧敏，羅玉柱，胡江，劉秀，李少斌，趙志東，黃兆春，梁維煒，王繼卿

miR-221靶向抑制綿羊乳腺上皮細(xì)胞活力和增殖

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省牛羊基因改良工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070

【背景】MicroRNAs（miRNA）是一類小RNA分子（18—23nt），廣泛參與了家畜乳腺發(fā)育和泌乳性能的調(diào)控。項(xiàng)目組前期在小尾寒羊上應(yīng)用RNA-Seq研究發(fā)現(xiàn)，miR-221在空懷期乳腺組織中的表達(dá)量是泌乳期的3.6倍，但是尚不清楚miR-221對(duì)綿羊乳腺發(fā)育的調(diào)控機(jī)制?！灸康摹刻接憁iR-221是否通過靶向基因抑制綿羊乳腺上皮細(xì)胞的活力和增殖數(shù)量，為揭示miR-221對(duì)綿羊泌乳性能的分子調(diào)控機(jī)理提供理論參考?！痉椒ā坎杉∥埠蛉橄?、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、背最長(zhǎng)肌和卵巢等8個(gè)組織樣本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR, RT-qPCR）技術(shù)，構(gòu)建miR-221在綿羊8個(gè)組織中的表達(dá)譜。采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染、CCK-8和Edu等方法，研究miR-221對(duì)綿羊乳腺上皮細(xì)胞活力和增殖的影響。利用miRDB和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)miR-221的靶基因，結(jié)合功能富集分析，確定目標(biāo)靶基因，構(gòu)建靶基因的野生型和突變型載體，進(jìn)而用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-221與預(yù)測(cè)靶基因間的靶向關(guān)系。分析過表達(dá)和沉默miR-221對(duì)靶基因及其信號(hào)通路下游功能基因的影響?！窘Y(jié)果】RT-qPCR結(jié)果表明，miR-221在綿羊乳腺等8個(gè)組織中均表達(dá)，其中在肺臟和脾臟中的表達(dá)量最高，在背最長(zhǎng)肌和腎臟中的表達(dá)量最低。CCK-8結(jié)果表明，miR-221模擬物抑制了綿羊乳腺上皮細(xì)胞的活力（＜0.01），而miR-221抑制劑提高了乳腺上皮細(xì)胞的活力（＜0.05）。Edu試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-221模擬物減少了Edu標(biāo)記的陽性乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量（＜0.01），而miR-221抑制劑增加了Edu標(biāo)記的陽性乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量（＜0.01）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-221模擬物抑制了胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1, IRS1）基因3′UTR區(qū)域的雙熒光素酶活性（＜0.01），而miR-221抑制劑提高了該基因的活性（＜0.05），表明是miR-221的一個(gè)靶基因。RT-qPCR結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-221降低了綿羊乳腺上皮細(xì)胞中和的表達(dá)量（＜0.05），沉默miR-221則提高了這2個(gè)基因的表達(dá)量（＜0.05）。過表達(dá)或沉默miR-221對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量沒有顯著影響（＞0.05）?！窘Y(jié)論】miR-221通過抑制靶基因的表達(dá)量，最終抑制了綿羊乳腺上皮細(xì)胞的活力和增殖數(shù)量。

綿羊；miR-221；胰島素受體底物1；乳腺上皮細(xì)胞

0 引言

【研究意義】母羊的泌乳性能主要包括泌乳量，以及蛋白、脂肪、乳糖、全乳固體、非全乳固體含量等乳成分在內(nèi)的多個(gè)性狀。泌乳性狀是一類重要的經(jīng)濟(jì)性狀，因?yàn)樗@著影響了羔羊的繁殖成活率、斷奶前生長(zhǎng)速度和發(fā)育程度。腺泡中的乳腺上皮細(xì)胞是乳汁合成和分泌的唯一場(chǎng)所，它反復(fù)經(jīng)歷了增殖、分化和凋亡這一發(fā)育過程。研究表明，乳腺發(fā)育程度、乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量及其分泌活性直接決定了母羊的產(chǎn)奶量和乳成分[1-3]，它們受到多個(gè)功能基因和非編碼RNA的調(diào)控[4-5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】MicroRNAs（miRNA）是一類小RNA分子（18—23nt），它們能通過降解或抑制作用，最終降低靶向mRNA的表達(dá)量[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs通過參與乳腺發(fā)育[8]、上皮導(dǎo)管生長(zhǎng)[9]、上皮祖細(xì)胞維持[10]、乳腺上皮細(xì)胞的增殖凋亡[11-12]等過程，最終調(diào)控了哺乳動(dòng)物的泌乳量和乳成分。例如，Chu等[13]在小鼠乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-221顯著降低了其中的甘油三酯含量。相反，抑制miR-221顯著增加了甘油三酯的含量。包黎娟等[14]發(fā)現(xiàn)miR-92a促進(jìn)了奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的凋亡，抑制了它們的增殖。王褚悅等[15]發(fā)現(xiàn)miR-142-3p抑制了研究也表明，在不同的乳腺發(fā)育時(shí)期或者品種間，綿羊miRNAs的表達(dá)豐度也不同。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)與泌乳高峰期的母羊相比，空懷期乳腺組織中的8個(gè)miRNAs呈上調(diào)表達(dá)，15個(gè)miRNAs呈下調(diào)表達(dá)，這些miRNAs通過靶向PI3K-Akt-mTOR和Wnt等信號(hào)通路，最終參與了乳腺發(fā)育和調(diào)控。在具有不同泌乳性能的綿羊品種之間，乳腺組織中的18個(gè)miRNAs呈現(xiàn)出差異表達(dá)，它們的靶基因富集在MAPK、mTOR等一些與乳腺發(fā)育、乳蛋白和乳脂合成相關(guān)的信號(hào)通路上[17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】項(xiàng)目組前期以空懷期和泌乳期小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采集它們的乳腺組織，用small RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，miRNA-221是這兩個(gè)時(shí)期乳腺組織中的差異表達(dá)miRNAs之一，它在空懷期的表達(dá)量是泌乳期的3.6倍[16]，但其生物學(xué)功能和作用途徑還有待深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在構(gòu)建綿羊乳腺等8個(gè)組織中miR-221表達(dá)譜的基礎(chǔ)上，檢測(cè)其對(duì)乳腺上皮細(xì)胞活力和增殖的影響，驗(yàn)證miR-221與預(yù)測(cè)靶基因之間的靶向關(guān)系，分析過表達(dá)和沉默miR-221對(duì)靶基因及信號(hào)通路下游重要功能基因的影響，以期為揭示miR-221對(duì)綿羊泌乳性能的分子調(diào)控機(jī)理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年9月，在甘肅省天?？h松山鎮(zhèn)金子河綿羊繁育公司，選擇同一飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下、3歲左右、第4胎、處于泌乳高峰期（產(chǎn)后21 d）和空懷期（產(chǎn)后100 d）的小尾寒羊母羊各3只（共6只），采集血液和組織樣本。將5 mL頸靜脈血液采集至真空抗凝采血管中，用于提取DNA，擴(kuò)增靶基因的3′UTR區(qū)域；屠宰后采集乳腺，以及心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、背最長(zhǎng)肌和卵巢等8個(gè)組織樣本，用于提取各組織的總RNA。小尾寒羊乳腺上皮細(xì)胞為項(xiàng)目組前期培養(yǎng)的第4代傳代細(xì)胞，HEK293T細(xì)胞為項(xiàng)目組保存的細(xì)胞[3]。以下試驗(yàn)于2019年9月至2020年10月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（蘭州，甘肅）完成。

1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

參照王建清[3]建立的方法，提取8個(gè)組織中的總RNA，經(jīng)質(zhì)檢后反轉(zhuǎn)錄生成mRNA和miRNA的cDNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)及miR-221表達(dá)譜構(gòu)建

設(shè)計(jì)miRNA特異性引物（序列見表1），以U6[3]和18sRNA[18]作為管家基因，進(jìn)行RT-qPCR，用2-△△Ct法計(jì)算miR-221在乳腺等8個(gè)組織中的表達(dá)量。RT- qPCR反應(yīng)體系和程序參照王建清[3]描述的方法進(jìn)行。

表1 引物序列

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將凍存的乳腺上皮細(xì)胞置于37℃水浴鍋中，待其徹底解凍后，立即加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，然后將混合液移至含有5 mL培養(yǎng)基的離心管中。在1 000 r/min下離心5 min棄去上清液，獲取細(xì)胞沉淀，再加入適量的新鮮培養(yǎng)基，輕柔混勻，將混合液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)器皿中，之后根據(jù)王建清[3]描述的方法在24孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)細(xì)胞。待這些細(xì)胞生長(zhǎng)至70%—80%時(shí)，用INVI DNA & RNA轉(zhuǎn)染試劑（Invigentech，美國(guó)），將50 nmol·L-1的miR-221模擬物（mimic）（Ⅰ組）、相應(yīng)對(duì)照組miR-221 mimic-NC（Ⅱ組），以及100 nmol·L-1的抑制劑（inhibitor）（Ⅲ組）和miR-221 inhibitor- NC（Ⅳ組）分別轉(zhuǎn)染至乳腺上皮細(xì)胞中，每組設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 細(xì)胞活力及增殖檢測(cè)

對(duì)于其中3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，轉(zhuǎn)染46 h后，加入30 μL CCK-8試劑（碧云天, 北京），37°C培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀器在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)上清液的光密度值。

對(duì)于另外3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，轉(zhuǎn)染44 h后加入100 μL Edu試劑，37℃培養(yǎng)4 h，用CellLight? Edu試劑盒（碧云天, 北京）標(biāo)記增殖細(xì)胞，最后用IX73熒光倒置顯微鏡（Olympus，日本）拍照，并計(jì)算Edu陽性細(xì)胞的數(shù)量。

1.6 miR-221靶基因的功能注釋及篩選

用miRDB和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-221的靶基因，并將預(yù)測(cè)結(jié)果取交集。隨后，對(duì)靶基因進(jìn)行GO和KEGG代謝通路分析，在調(diào)控乳汁生成、乳蛋白和乳脂合成的重要通路上，選擇其中一個(gè)靶基因用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)

1.7.13′UTR區(qū)域雙熒光素酶載體構(gòu)建 用綿羊基因組DNA擴(kuò)增靶基因-胰島素受體底物1（Insulin Receptor Substrate 1,）的3′UTR區(qū)域（引物見表1），將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pmiR-RB-Report?載體上，構(gòu)建野生型載體。用Fast mutagenesis Kit V2突變?cè)噭┖校ㄖZ唯贊, 南京），將靶基因與miR-221結(jié)合的序列突變?yōu)槠浠パa(bǔ)序列，以阻止兩者的結(jié)合，最終構(gòu)建突變型載體。用Sanger測(cè)序驗(yàn)證兩種載體的正確性。

1.7.2 miR-221靶基因的驗(yàn)證 在細(xì)胞培養(yǎng)板中接種復(fù)蘇后的HEK293T細(xì)胞，待細(xì)胞匯聚程度達(dá)到培養(yǎng)板面積的70%—80%時(shí)，將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組分別與100ng野生型和突變型載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，之后用雙熒光素酶報(bào)告基因E1960試劑盒（Promega, 美國(guó)）和多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX（Thermo Lifetech, 美國(guó)）測(cè)定海參酶與螢火蟲酶活性。

1.8 過表達(dá)/沉默miR-221對(duì)靶基因及其通路下游重要功能基因表達(dá)量的影響

將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組轉(zhuǎn)染至綿羊乳腺上皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染成功后提取細(xì)胞中的RNA。選擇所在信號(hào)通路PI3K-AKT-mTOR和MAPK的下游重要基因-胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（Insulin-like Growth Factor 1 Receptor,）和磷酸肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（Phosphoinositide-3-Kinase Regulatory Subunit 1,），以作為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法計(jì)算它們的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 miR-221的組織表達(dá)譜

RT-qPCR結(jié)果表明，miR-221在綿羊8個(gè)組織中均表達(dá)，并表現(xiàn)出明顯的組織特異性。其表達(dá)量由高到低依次為肺臟＞脾臟＞卵巢＞心臟＞肝臟＞乳腺＞背最長(zhǎng)?。灸I臟（圖1-A）。

miR-221的表達(dá)也表現(xiàn)出明顯的時(shí)序性。在綿羊乳腺組織中，它在空懷期的相對(duì)表達(dá)量（3.956 ± 0.14）是泌乳期（2.077 ± 0.12）的1.9倍（＜0.01）（圖1-B）。

2.2 miR-221顯著影響了綿羊乳腺上皮細(xì)胞的活力和增殖能力

CCK-8試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-221 模擬物抑制了綿羊乳腺上皮細(xì)胞的活力（＜0.01），而miR-221抑制劑提高了乳腺上皮細(xì)胞的活力（＜0.05）（圖2-A）。

Edu檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，將miR-221模擬物轉(zhuǎn)染進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞后，Edu標(biāo)記的陽性乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少；在乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221抑制劑以后，Edu標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多（圖2-B）。

2.3 預(yù)測(cè)靶基因IRS1的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.3.1 雙熒光素酶載體的測(cè)序驗(yàn)證 構(gòu)建的雙熒光素酶載體經(jīng)酶切后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，外源基因已成功連接到載體上，并且外源基因的片段大小基本與目的片段一致（圖3-A）。測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)，野生型雙熒光素酶載體中存在與miR-221相結(jié)合的的種子序列（圖3-B），而突變型雙熒光素酶載體中不存在與miR-221相結(jié)合的序列（圖3-C），這表明野生型和突變型雙熒光素酶載體已被成功構(gòu)建。

2.3.2 預(yù)測(cè)靶基因的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在野生型雙熒光素酶載體中，miR-221模擬物降低了的雙熒光素酶活性（＜0.01），而miR-221抑制劑提高了該基因的雙熒光素酶活性（0.05, 圖4-A）。但是在突變型雙熒光素酶載體中，miR-221模擬物或抑制劑對(duì)基因的雙熒光素酶活性均無顯著影響（＞0.05, 圖4-B）。上述結(jié)果表明，是miR-221的一個(gè)靶基因。

a、b、c和d等字母表示差異顯著（P＜0.05）。**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。下同

A：miR-221 mimic、mimic-NC、inhibitor和inhibitor-NC轉(zhuǎn)染到乳腺上皮細(xì)胞48 h后，用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性的結(jié)果；B：miR-221 mimic、mimic-NC、inhibitor和inhibitor-NC轉(zhuǎn)染到乳腺上皮細(xì)胞48h后，用Edu實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖的結(jié)果

A圖中泳道1和B圖為野生型雙熒光素酶載體的鑒定結(jié)果；A圖中泳道2和C圖為突變型雙熒光素酶載體的鑒定結(jié)果；M：Marker

圖4 在野生型（A）和突變型（B）雙熒光素酶載體中，miR-221對(duì)IRS1基因雙熒光素酶活性的影響

2.4 miRNA-221對(duì)功能基因表達(dá)量的影響

在綿羊乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221模擬物后，和基因的表達(dá)量顯著降低（＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-221抑制劑后，和基因的表達(dá)量顯著升高（＜0.05）（圖5）。但是，miR-221模擬物和抑制劑對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量沒有顯著影響（＞0.05，圖5）。

3 討論

3.1 綿羊miR-221表達(dá)的組織特異性和時(shí)空特異性

miRNAs是真核生物中保守性較強(qiáng)的一類小分子RNAs，它們不編碼蛋白質(zhì)，但能降低靶基因的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)，這類RNAs在家畜乳腺生長(zhǎng)發(fā)育、泌乳量和乳成分方面發(fā)揮了重要調(diào)控作用。項(xiàng)目組前期研究表明，miRNA-221調(diào)控了小尾寒羊空懷期和泌乳期的乳腺組織發(fā)育[16]，但并未深入研究其分子機(jī)理。本研究構(gòu)建了miR-221在綿羊8個(gè)組織中的表達(dá)譜，通過靶基因驗(yàn)證以及對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的影響，研究了它的分子生物學(xué)功能和作用途徑。

圖5 miR-221對(duì)重要功能基因表達(dá)量的影響

RT-qPCR結(jié)果表明，miR-221在綿羊乳腺等8個(gè)組織中均表達(dá)，在脾臟和肺臟中的表達(dá)量最高，在背最長(zhǎng)肌和腎臟中的表達(dá)量最低（圖1-A）。這表明miR-221在上述8個(gè)組織的生長(zhǎng)發(fā)育過程中均發(fā)揮了重要作用。目前關(guān)于miR-221的研究多集中在人類腫瘤領(lǐng)域，例如，帥維等[19]研究表明，miR-221在人類肺臟組織中高度表達(dá)。Ogawa等[20]發(fā)現(xiàn)miR-221在人類肝臟組織中表達(dá)。但是，它在家畜不同組織中的表達(dá)情況未見報(bào)道。

項(xiàng)目組前期應(yīng)用small RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，miR-221在空懷期小尾寒羊乳腺組織中的表達(dá)量是泌乳期的3.6倍[16]，這與本研究用RT-qPCR方法取得的結(jié)果相一致（圖1-B）。然而，由于small RNA測(cè)序和RT-qPCR是衡量RNA表達(dá)量的兩種不同方法，它們?cè)谟?jì)算方法和原理等方面截然不同，因此兩者間的研究結(jié)果存在一定差異。研究表明，乳腺發(fā)育時(shí)期不同，它的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能也不同。在哺乳動(dòng)物的空懷期，乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量最少、活力最低。而在泌乳早期，乳腺上皮細(xì)胞活力、乳腺肺泡數(shù)量和大小都處于持續(xù)增加狀態(tài)[21]。本研究中，miR-221在乳腺不同時(shí)期的差異表達(dá)說明，它抑制了綿羊乳腺上皮細(xì)胞的活力和增殖，后續(xù)的CCK-8和Edu試驗(yàn)也印證了這一點(diǎn)。初美強(qiáng)[22]在小鼠乳腺組織中也發(fā)現(xiàn)，miR-221在非泌乳期的表達(dá)量高于泌乳高峰期，這與本研究結(jié)果相一致。另外，本研究發(fā)現(xiàn)miR-221在泌乳期乳腺中下調(diào)表達(dá)，由于該時(shí)期是乳腺合成乳蛋白和乳脂、分泌乳汁的重要時(shí)期，這也說明miR-221抑制了綿羊乳成分的合成與乳汁的分泌。

3.2 miR-221抑制了綿羊乳腺上皮細(xì)胞的活力與增殖

CCK-8和Edu試驗(yàn)表明，miR-221抑制了綿羊乳腺上皮細(xì)胞的活力（圖2-A），并降低了Edu標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)量（圖2-B）。前人研究表明，乳腺上皮細(xì)胞的活力和數(shù)量顯著影響了哺乳動(dòng)物的泌乳量和乳成分含量[23]，即乳腺上皮細(xì)胞活力越大，數(shù)量越多，則哺乳動(dòng)物的泌乳能力越強(qiáng)，乳蛋白和乳脂等成分的含量越高。這進(jìn)一步表明miR-221能抑制乳汁合成，以及乳中蛋白質(zhì)、脂肪等成分的含量。陸黎敏等[24]用透射電鏡發(fā)現(xiàn)，抑制miR-221后，小鼠乳腺上皮細(xì)胞上的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的數(shù)目明顯增多，腺泡體積也在增大。由于乳汁中蛋白質(zhì)、脂類等營(yíng)養(yǎng)成分在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成[25]，因此這也證實(shí)了miR-221能抑制小鼠乳蛋白質(zhì)、乳脂和乳糖的生成過程。Jiao等[26]也發(fā)現(xiàn)，miR-221抑制了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。除此之外，miR-221還能通過靶向雌激素受體α（estrogen receptor α, ERα）去抑制人類乳腺癌細(xì)胞的增殖[27]。

3.3 miR-221對(duì)靶基因及其他重要功能基因的影響

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明，miR-221模擬物抑制了的雙熒光素酶活性（＜0.01），而miR-221抑制劑則提高了它的雙熒光素酶活性（圖4-A；＜0.05），這表明是miR-221的一個(gè)靶基因，這種靶向關(guān)系在其他家畜的乳腺上皮細(xì)胞中已得到了證實(shí)。例如，焦蓓蕾[28]在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)是miR-221的一個(gè)靶基因。除了以外，前人在奶牛、奶山羊和小鼠乳腺中發(fā)現(xiàn)，[26]、和[22]也是miR-221的靶基因。這些研究也證實(shí)了一個(gè)miRNA可以同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因的表達(dá)量，從而實(shí)現(xiàn)它的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能。RT-qPCR試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-221模擬物抑制了靶基因的表達(dá)量，而miR-221抑制劑提高了靶基因的表達(dá)量（圖5）。這與焦蓓蕾[28]在奶牛上的研究結(jié)果一致，他們用RT-qPCR和Western Blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-221模擬物抑制了和在mRNA和蛋白質(zhì)層面的表達(dá)量，而miR-221抑制劑提高了它們的表達(dá)量。

研究表明，通過兩種途徑促進(jìn)乳汁分泌和乳蛋白的合成。首先，IRS1是IGF1R和胰島素受體（Insulin Receptor, IR）的停泊蛋白，也是IGF1參與乳腺發(fā)育和泌乳調(diào)控的關(guān)鍵蛋白。IR是一種酪氨酸激酶，當(dāng)與胰島素（Insulin, INS）結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)生快速的自身磷酸化，并促使IRS1等細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)底物發(fā)生磷酸化[29]。磷酸化后的IRS1激活了PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路，提高了乳腺上皮細(xì)胞的活力和增殖，最終促進(jìn)了乳汁和乳蛋白的合成[30]。其次，IRS1還可以通過抑制ATP酶的活性來激活蛋白激酶C，最終引起了INS的釋放[31]。研究表明，INS能促進(jìn)牛和小鼠乳腺上皮細(xì)胞的增殖，以及葉酸受體（Folate receptor alpha,）和甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase,）等相關(guān)乳汁蛋白基因的表達(dá)[32-33]，最終促進(jìn)了乳汁分泌和乳蛋白合成。

本研究發(fā)現(xiàn)，除了以外，miR-221也抑制了基因的表達(dá)（圖5）。研究表明，在小鼠乳腺中敲除后，小鼠泌乳性能顯著下降[34]。這表明能促進(jìn)小鼠泌乳。雖然目前尚未報(bào)道在家畜乳腺上皮細(xì)胞中的生物學(xué)作用，但在人類醫(yī)學(xué)中發(fā)現(xiàn)，可以介導(dǎo)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[35]。因此推測(cè)，也可以調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞的增殖能力，從而參與乳汁合成過程，但這還需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。

4 結(jié)論

miR-221在綿羊中的表達(dá)具有組織特異性，是它的一個(gè)靶基因。miR-221能夠抑制綿羊乳腺上皮細(xì)胞的活力和增殖，降低和的表達(dá)量。研究工作為進(jìn)一步闡明miR-221調(diào)控綿羊泌乳性能的分子機(jī)理提供了研究基礎(chǔ)。

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The miR-221 Inhibits the Viability and Proliferation of Ovine Mammary Epithelial Cells by Targeting

College of Animal Science and Technology/Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology/Gansu Engineering Lab of Genetic Improvement in Ruminants, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070

【Background】MicroRNAs (miRNA) are a type of small RNAs (18-23 nt) that are widely involved in the regulation of mammogenesis and milk traits in livestock animals. In our previous research, the expression level of miR-221 in non-lactating mammary gland was found to be 3.6-time higher than in mammary gland at lactation period in Small-Tailed Han sheep by using RNA-Seq. However, the regulatory mechanism of miR-221 on ovine mammary gland development is still unclear.【Objective】The aim of this study was to investigate the inhibition of miR-221 on the viability and proliferation of ovine mammary epithelial cells by targeting insulin receptor substrate 1 (IRS1) gene, so as to provide a theoretical reference for revealing the molecular regulation mechanism of miR-221 on ovine lactation performance.【Method】In the study, mammary gland, heart, liver, kidney, spleen, lung,muscle and ovary tissues were collected in Small-Tailed Han sheep, and the expression profiles of miR-221 were constructed in ovine eight tissues by using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). The effects of miR-221 on the viability and proliferation of ovine mammary epithelial cells (OMECs) were investigated by using cell transfection, CCK-8 and Edu assays. The miRDB and miRanda were used to predict the target genes of miR-221. Based on functional enrichment analysis, an investigated target gene was screened. The target relationship between miR-221 and the predicted target gene was investigated by constructing wild-type and mutant-type report vectors for the target gene by using dual luciferase reporter assay. Finally, the effects of over-expressed and silenced miR-221 on expression levels of the target gene and other functional genes in downstream signaling pathways were detected.【Result】The miR-221 was expressed in ovine eight tissues including mammary glands, with the highest expression levels in lung and spleen, and the lowest expression levels inmuscle and kidney. The CCK-8 assay result revealed that miR-221 mimic inhibited the viability of OMECs, whereas miR-221 inhibitor promoted the viability of OMECs. The Edu result found that miR-221 mimic reduced the number of Edu-labeled positive OMECs. On the contrary, miR-221 inhibitor increased the number of Edu-labeled positive OMECs. The result from dual luciferase reporter assays showed that the miR-221 mimics reduced the luciferase activity of the 3′UTR region of, while miR-221 inhibitor increased the luciferase activity. This suggested thatwas a target gene of miR-221. The results from RT-qPCR further found that over-expressed miR-221 reduced expression levels ofand＜0.05), while silenced miR-221 enhanced the levels of the two genes in expression (＜0.05). No effect onwas found for over-expressed and silenced miR-221 in OMECs (＞0.05).【Conclusion】The miR-221 inhibited the viability and proliferation of OMECs by reducingexpression.

sheep; miR-221; insulin receptor substrate1; mammary epithelial cells.

2021-04-09；

2022-03-07

國(guó)家自然科學(xué)基金（32060746和31860635）、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)青年導(dǎo)師扶持基金（GAU-QDFC-2020-01）、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)伏羲青年英才培育計(jì)劃（Gaufx-02Y02）、甘肅省基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項(xiàng)目（18JR3RA190）

柯娜，E-mail：ken@st.gsau.edu.cn。通信作者王繼卿，E-mail：wangjq@gsau.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.10.014

（責(zé)任編輯 林鑒非）