劉玉成，張俊琴

(1.河北金棘百益科技開(kāi)發(fā)有限公司，河北石家莊 050000；2.河北神興沙棘研究院，河北石家莊 050000；3.河北省衛(wèi)生健康委綜合監(jiān)督服務(wù)中心，河北石家莊 050000）

沙棘含有大量營(yíng)養(yǎng)成分，例如Vc，氨基酸，黃酮化合物，可強(qiáng)化人體對(duì)外界病毒與細(xì)菌的抵抗能力。通過(guò)發(fā)酵的方式，將沙棘加工成沙棘果酒，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)沙棘進(jìn)行精加工的主要方向，要想使加工效果更符合預(yù)期，關(guān)鍵要明確發(fā)酵給沙棘所帶來(lái)影響。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)所描述對(duì)象為微生物形成及生長(zhǎng)過(guò)程，對(duì)發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)與底物消耗、菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成的關(guān)系進(jìn)行研究，對(duì)發(fā)酵類(lèi)產(chǎn)品大規(guī)模生產(chǎn)有重要意義。過(guò)去，國(guó)內(nèi)學(xué)者以桑葚酒為研究對(duì)象，利用既有模型對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行了非線性擬合，所取得效果良好。本研究以現(xiàn)有研究及所得出結(jié)論為依據(jù)，選擇相應(yīng)模型，對(duì)沙棘果酒發(fā)酵期間，其抗氧化性及其他指標(biāo)進(jìn)行研究，供相關(guān)人員參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

冷凍沙棘果的含糖量約為65 mg/mL，含酸量約為18 g/L，酸堿度約為3.0 °T，原產(chǎn)地為俄羅斯。本次實(shí)驗(yàn)所用材料，還包括安琪活性干酵母，白砂糖。

試劑及耗材：果膠酶的酶活為10000 U/mL。Vc、沒(méi)食子酸以及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，均由國(guó)藥集團(tuán)提供。實(shí)驗(yàn)所用福林酚、草酸以及無(wú)水乙醇等化學(xué)試劑，屬于國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器設(shè)備：手持折光燈由潤(rùn)聯(lián)科技公司（河北）提供，型號(hào)為WS108；恒溫水槽由森信儀器公司（上海）提供，型號(hào)為DK-08；離心機(jī)由湘儀儀器公司（湖南）提供，型號(hào)為L(zhǎng)430；電子天平由奧豪斯公司（上海）提供，型號(hào)為EX326；打漿機(jī)由飛利浦電器公司（珠海）提供，型號(hào)為HR7633；光度計(jì)由凌析達(dá)公司（上海）提供，型號(hào)為UV-1100；顯微鏡由尼康公司（日本）提供，型號(hào)為YS100。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 更改沙棘果酒糖含量

對(duì)沙棘果酒進(jìn)行發(fā)酵的流程為：沙棘果冷凍打漿—酶解處理—更改糖度—?dú)⒕臃N—發(fā)酵培養(yǎng)—分析測(cè)定。

沙棘果發(fā)酵的要點(diǎn)如下：第一，將沙棘果置于室溫環(huán)境下，解凍，隨后利用打漿機(jī)對(duì)其進(jìn)行打漿處理，測(cè)定可溶固體物實(shí)際含量；第二，利用果膠酶將其酶解，在進(jìn)行酶解操作時(shí)，溫度需要控制在50 ℃左右，一般來(lái)說(shuō)，酶解時(shí)長(zhǎng)以3 h為宜；第三，添加適量白砂糖，確保糖度達(dá)到21 °Bx；第四，用1/3 沙棘汁、2/3 蒸餾水的混合溶液，將干酵母溶解，溶解后干酵母置于35 ℃環(huán)境下，進(jìn)行30 min 的活化處理；第五，在接種工作正式開(kāi)始前，相關(guān)人員應(yīng)將發(fā)酵液置于60 ℃環(huán)境下30 min，待發(fā)酵液冷卻到室溫后，加入5 g/L 濃度的活化酵母菌，將實(shí)驗(yàn)溫度控制在21 ℃左右，確保發(fā)酵液可盡快發(fā)酵。通常每隔24 h進(jìn)行1次取樣，重復(fù)3次取平均值即可。

既有模型對(duì)應(yīng)擬合相關(guān)系數(shù)，精確到小數(shù)點(diǎn)后四位，分別是Logistic-0.9916，Boltzmann-0.9952，SGompeertz-0.9922。由此可見(jiàn)，具有良好擬合效果的模型為Boltzmann，研究人員計(jì)劃利用該模型，對(duì)酒精生成情況進(jìn)行擬合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)行到第192 h時(shí)，酒精屬開(kāi)始結(jié)緩。

由表1 可知，既有模型中，可被用來(lái)對(duì)還原糖消耗情況進(jìn)行擬合的模型，首選DoseResp 及Boltzmann，二者所得出結(jié)果精確度大致相同。

表1 還原糖動(dòng)力學(xué)模型

1.2.2 測(cè)定發(fā)酵動(dòng)力學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)

利用蒸餾水對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行稀釋，將稀釋后發(fā)酵液滴至血球計(jì)數(shù)板上，通過(guò)顯微鏡進(jìn)行觀察，確定酵母菌具體數(shù)量。利用二硝基水楊酸對(duì)還原糖實(shí)際質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。利用密度瓶+蒸餾法，對(duì)果酒實(shí)時(shí)酒精度數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 測(cè)定果酒抗氧化性

DPPH 溶液配制的方法如下：第一步，稱取DPPH 19.8 mg；第二步，利用95%體積分?jǐn)?shù)的乙醇，將DPPH 完全溶解，獲得0.5 mmol/mL 濃度的溶液；第三步，將溶液質(zhì)量定容為100 mL，置于避光環(huán)境中保存，將環(huán)境溫度控制在2～4 ℃間。

取DPPH 溶液0.5 mL、稀釋樣液2 mL，將充分混合所得溶液置于37 ℃的避光環(huán)境中，靜置15～20 min。將無(wú)水甲醛設(shè)為空白，基于517 nm 對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果記為A。

取DPPH 溶液0.5 mL、無(wú)水甲醛2 mL，將充分混合所得溶液置于37 ℃的避光環(huán)境中，靜置15～20 min。將無(wú)水甲醛設(shè)為空白，基于517 nm 對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果記為A。

取無(wú)水甲醛0.5 mL、處理樣液2 mL，將充分混合所得溶液置于37 ℃的避光環(huán)境中，靜置15～20 min。將無(wú)水甲醛設(shè)為空白，基于517 nm 對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果記為A。

利用測(cè)定所得數(shù)據(jù)，對(duì)DPPH 清除率進(jìn)行計(jì)算，公式如下：

在上述計(jì)算公式中，A代表DPPH 溶液+發(fā)酵液的真實(shí)吸光度，A代表DPPH 溶液吸光度，A代表發(fā)酵液吸光度，單位均為%。

對(duì)抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定所用方法為T(mén)-AOC。

上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，利用相關(guān)軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，確定可被用來(lái)研究酒精度、酵母菌和還原糖含量的模型。通過(guò)對(duì)擬合相關(guān)系數(shù)加以比較，確定滿足定量描述要求的高擬合度模型。

1.2.4 測(cè)定其他指標(biāo)

1.2.4.1 Vc含量

對(duì)Vc 含量進(jìn)行測(cè)定所用元素為二氯靛酚，測(cè)定方法為滴定法。

1.2.4.2 總多酚含量

對(duì)總多酚含量進(jìn)行測(cè)定所用方程見(jiàn)表2。相關(guān)人員可結(jié)合樣品對(duì)應(yīng)吸光度、標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)實(shí)際含量進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4.3 總黃酮含量

對(duì)總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定所用方程見(jiàn)表2。相關(guān)人員可結(jié)合樣品對(duì)應(yīng)吸光度、標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)實(shí)際含量進(jìn)行計(jì)算。

表2 指標(biāo)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2 結(jié)果與分析

2.1 建立發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型

實(shí)驗(yàn)表明，酵母菌進(jìn)入衰亡期的時(shí)間節(jié)點(diǎn)為96 h。研究人員計(jì)劃對(duì)酵母菌120 h 內(nèi)發(fā)酵情況、酵母菌數(shù)量進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)既有模型擬合系數(shù)進(jìn)行對(duì)比可知，擬合效果最為理想的模型為SGompertz，該模型的相關(guān)系數(shù)約為0.96。通過(guò)擬合酵母菌大致生長(zhǎng)情況可知，經(jīng)過(guò)24 h 發(fā)酵的沙棘果酒，其酵母菌含量增速開(kāi)始提升，通常在第96 h，酵母菌數(shù)量達(dá)到峰值。

2.2 還原糖含量、酒精度和酵母菌

酵母菌增長(zhǎng)快速期為24～96 h，在此期間，酵母菌數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)，隨后，便過(guò)渡到穩(wěn)定期，最終進(jìn)入衰亡期。在96 h 時(shí)，酵母菌數(shù)量達(dá)到峰值，此后呈緩慢下降趨勢(shì)，究其原因，主要是受還原糖濃度偏低及酒精濃度偏高影響，酵母菌過(guò)渡到平穩(wěn)期并走向衰亡，隨著菌體自溶，大量沉淀生成。

表3 酵母菌動(dòng)力學(xué)模型

表4 酒精動(dòng)力學(xué)模型

發(fā)酵時(shí)間和還原糖含量呈負(fù)相關(guān)，即發(fā)酵時(shí)間增加，還原糖含量減少。192 h 為還原糖消耗情況轉(zhuǎn)折點(diǎn)，0～192 h 期間，還原糖被快速消耗，大量酵母菌向酒精進(jìn)行轉(zhuǎn)化，發(fā)酵時(shí)間達(dá)到192 h 后，消耗還原糖的速度逐漸放緩。沙棘果酒酒精度數(shù)的變化趨勢(shì)與還原糖大致相同，在發(fā)酵操作進(jìn)行到264 h時(shí)，酒精濃度最高，約為11.8%vol。

2.3 抗氧化性變化趨勢(shì)

DPPH 清除率的變化趨勢(shì)為先增后減，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，致使大量抗氧化物質(zhì)被浸出，多酚含量隨之增多。研究表明，酚類(lèi)物質(zhì)的共性特點(diǎn)，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是給出氫離子；二是經(jīng)由共振雜化處理，使自身性質(zhì)趨于穩(wěn)定。這也是酚類(lèi)物質(zhì)普遍具有理想清除能力的原因，其DPPH 清除率自然可維持在較高水平。最佳發(fā)酵時(shí)間為72～120 h，這一時(shí)期的清除率明顯高于其他時(shí)期。當(dāng)發(fā)酵反應(yīng)到72 h 時(shí)，果酒所對(duì)應(yīng)的DPPH 清除率達(dá)到峰值，約為76 %。在發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)行到第120 h 時(shí)，DPPH清除率開(kāi)始下降，主要是發(fā)酵時(shí)間增加，致使Vc、多酚物質(zhì)含量減少，清除能力隨之減弱。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，處于發(fā)酵狀態(tài)的沙棘果酒，抗氧化能力的變化趨勢(shì)為先升后降，這一趨勢(shì)和DPPH 清除率大致相同。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到72 h，抗氧化能力可達(dá)到峰值，測(cè)定結(jié)果為145 U/mL。該能力增強(qiáng)的原因，主要是Vc 以及多酚含量增多。待發(fā)酵進(jìn)行到120 h，受活性成分占比減小影響，抗氧化能力將出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。

2.4 其他指標(biāo)分析

2.4.1 Vc含量

Vc 含量變化趨勢(shì)為先增后減。正常情況下，經(jīng)過(guò)96 h 發(fā)酵的沙棘果酒，其Vc 含量將達(dá)到峰值，約為27 mg/100 mL。對(duì)沙棘果進(jìn)行酶解處理，極易破壞沙棘果細(xì)胞壁，致使大量?jī)?nèi)容物流出，在發(fā)酵時(shí)間增加的雙重影響下，沙棘果酒所含乙醇大幅增加，以Vc 為代表的活性物質(zhì)含量，通常會(huì)出現(xiàn)明顯波動(dòng)。隨著氧化程度以及降解反應(yīng)加劇，Vc 含量將持續(xù)走低。

2.4.2 總多酚含量

多酚含量變化趨勢(shì)為先上升后下降，實(shí)驗(yàn)測(cè)得果酒素汁含量較多的原因，可能是由于酵母菌的存在，使得大分子酚類(lèi)被轉(zhuǎn)化為小分子酚類(lèi)。經(jīng)過(guò)96 h 發(fā)酵后，多酚含量減少，主要是因?yàn)榻湍妇拇嬖?，加快了多酚物質(zhì)氧化速度，這與山竹酒多酚含量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系大致相同。

2.4.3 總黃酮含量

沙棘果酒含黃酮物質(zhì)的變化趨勢(shì)是先上升后下降，上升區(qū)間為24～72 h，發(fā)酵進(jìn)行到72 h 時(shí)，黃酮物質(zhì)含量達(dá)到峰值，約為12.5 mg/mL。在總發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行的背景下，素汁被大量占用，隨著酒精含量的增加，黃酮物質(zhì)浸素時(shí)間延長(zhǎng)，溶解量出現(xiàn)明顯變化。當(dāng)發(fā)酵加工進(jìn)入后期，黃酮物質(zhì)含量增速趨于平緩，原因有兩個(gè)：一是以乙醛為代表的諸多物質(zhì)，均會(huì)和黃酮物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，致使大量衍生物生成；二是多酚出現(xiàn)氧化及分解反應(yīng)，隨著多酚含量減少，黃酮物質(zhì)增速放緩。

3 結(jié)論

綜上所述，通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，可被用來(lái)對(duì)沙棘果酒對(duì)應(yīng)酒精生成、酵母菌生長(zhǎng)及還原糖消耗情況進(jìn)行擬合的模型，現(xiàn)階段主要有Logistic、SGompertz、DoseResp 及Boltzmann，并且上述模型均可被用來(lái)對(duì)果酒發(fā)酵流程、相關(guān)反應(yīng)以及動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行描述。研究結(jié)果表明，在發(fā)酵期間，沙棘果酒所含還原糖、Vc、總多酚以及總黃酮含量，抗氧化能力與DPPH 清除率，均呈先增后減的趨勢(shì)，要想使沙棘果酒發(fā)揮出應(yīng)有功效，關(guān)鍵是根據(jù)非線性擬合所得結(jié)果，對(duì)適宜發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)加以確定。