李琛琛 徐君美 賀芊芊 李嘉嬴 李志恒 徐志卿 楊予濤

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京 100069)

抑郁癥是一種高發(fā)病率的情感類精神疾病，且具有很強(qiáng)的致殘性和復(fù)發(fā)性[1-2]，如果不予以及時干預(yù)可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致其自殺、自傷行為的產(chǎn)生[3-4]。

研究[5-6]顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的過度激活可釋放大量活性氧等氧化應(yīng)激產(chǎn)物，可引起神經(jīng)元的凋亡或壞死[7-8]。相關(guān)臨床和動物研究[9-10]顯示，腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活及相關(guān)氧化應(yīng)激產(chǎn)物的水平與焦慮、抑郁樣行為的發(fā)生密切相關(guān)，而予以抗氧化應(yīng)激治療則可在一定程度上改善其抑郁癥狀[11-12]。

核因子-E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化響應(yīng)元件(antioxidant reaction element，ARE)信號通路是調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞激活并抑制其產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物的重要信號通路。當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時即可引起Nrf2發(fā)生磷酸化，磷酸化的Nrf2向細(xì)胞核內(nèi)遷移與并和抗氧化基因啟動子的ARE順式作用元件結(jié)合，增高抗氧化基因的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而避免細(xì)胞的損傷凋亡[13-15]。已有研究[16-18]表明激活Nrf2/ARE信號通路，可明顯抑制抑郁動物情緒相關(guān)腦區(qū)氧化應(yīng)激產(chǎn)物釋放，減少神經(jīng)元的損傷和凋亡而發(fā)揮抗抑郁的作用。

目前抑郁癥在臨床上以主要通過選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)進(jìn)行治療。研究[19-21]表明當(dāng)前使用的抗抑郁藥物雖然能改善部分患者的抑郁癥狀，但仍有較多的不良反應(yīng)和禁忌證。因此，探索低不良反應(yīng)、高經(jīng)濟(jì)性和安全性的化合物對抑郁的治療具有重要的意義。

根皮素(phloretin, PHL)是一種來源于多汁水果果皮和根皮中的黃酮類化合物。目前，PHL已被美國食用香料與提取物制造者協(xié)會(Flavor and Extract Manufactures Association of the Unite States，F(xiàn)EMA)列為公認(rèn)安全物質(zhì)(generally recognized as safe，GRAS)。PHL易于提取，經(jīng)濟(jì)成本較低[22]。已有研究[23]表明PHL能夠通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮肝保護(hù)作用，但是PHL能否抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活后的氧化應(yīng)激反應(yīng)及相關(guān)的分子機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。因此，本研究通過脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型，探討PHL是否通過影響Nrf2/ARE信號通路從而抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的過度氧化應(yīng)激，相關(guān)研究為PHL的神經(jīng)保護(hù)作用提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PHL(北京洪湖聯(lián)合化工公司)；LPS(美國Sigma公司)；MTS檢測試劑盒(美國Promega公司)；一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)；NO、MDA、SOD、GSH檢測試劑盒(中國索萊寶公司)；脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；磷酸化Nrf2抗體(中國Bioss公司)；HO-1抗體、β-actin抗體(中國Proteintech公司)；IRDye 680RD 和RDye 800CW熒光二抗(中國Life公司)；抗氧化響應(yīng)元件熒光素酶報告基因質(zhì)粒(中國吉滿生物科技公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞為本實驗室凍存，復(fù)蘇后使用F12/DMEM培養(yǎng)基加入10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清在37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，每隔2 d傳代，顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組

待BV2小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，將其分為6個組分別為：①對照組(Control);②LPS處理組(LPS);③LPS+1 μmol/L PHL預(yù)保護(hù)組[PHL(1 μmol/L)+LPS];④LPS+10 μmol/L PHL預(yù)保護(hù)組[PHL(10 μmol/L)+LPS];⑤LPS+20 μmol/L PHL預(yù)保護(hù)組[PHL(20 μmol/L)+LPS];⑥20 μmol/L PHL處理組[PHL(20 μmol/L)]，對照組不作處理，模型組給予LPS(100 ng/mL)24 h，PHL預(yù)保護(hù)組給予低、中、高濃度PHL 12 h后，給予LPS 24 h，PHL(20 μmol/L)組給予PHL 36 h。Nrf2磷酸化是Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗氧化作用的關(guān)鍵步驟。將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分為如下4個組：對照組、LPS處理組、LPS+10 μmol/L PHL組，LPS+20 μmol/L PHL組。本研究選擇具有明顯保護(hù)效果的根皮素預(yù)處理濃度進(jìn)行后續(xù)的雙熒光素酶活性檢測和Western blotting實驗。

1.2.3 MTS 細(xì)胞活性檢測

上述6組細(xì)胞各處理結(jié)束后，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含20 μL 96孔細(xì)胞增生檢測試劑完全培養(yǎng)基，在37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的環(huán)境下孵育2 h后，酶標(biāo)儀于490 nm讀取吸光值。

1.2.4 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中NO、MDA、GSH和SOD活性檢測

上述各組細(xì)胞處理結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，收集各組細(xì)胞，按照試劑盒的操作說明按步驟加入試劑盒中所提供的試劑，結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與吸光度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線或說明書中提供的計算公式含量測定各組NO、MDA、GSH含量以及SOD活性。

1.2.5 雙熒光素酶活性檢測

各組細(xì)胞處理結(jié)束后每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液于搖床上裂解20 min，取30 μL細(xì)胞裂解液加入30 μL 熒光素酶檢測試劑，使用光度檢測儀測定讀數(shù)記為熒光值1，再加入30 μL反應(yīng)終止液測定讀數(shù)記為熒光值2，以熒光值1/熒光值2的比值作為相對熒光素酶活性。

1.2.6 Western blotting法檢測

各處理組細(xì)胞加入100 μL裂解液，裂解，離心，收集上清，檢測蛋白濃度。使用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PAGE膠進(jìn)行電泳，再以300 mA，90 min進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)后將PVDF膜用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉1 h，TBST緩沖液洗膜5 min×3次。4 ℃條件下，一抗(1∶1 000)孵育過夜，TBST緩沖液洗膜5 min×3次后，加入二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h后，掃膜。使用圖像處理軟件Image J對蛋白條帶的灰度值讀數(shù)，以β-actin作為內(nèi)參，與內(nèi)參灰度值讀數(shù)相比，計算各處理組比值占正常對照組比值的倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PHL預(yù)處理可改善LPS導(dǎo)致的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活力降低

與對照組相比，LPS處理組其BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活力比值為0.70±0.05，明顯降低(P<0.001)。PHL(1 μmol/L)+LPS組為0.80±0.06；PHL(10 μmol/L)+LPS組為0.85±0.04；PHL(20 μmol/L)+LPS組為0.94±0.06，PHL可在一定程度改善LPS導(dǎo)致的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活力下降(P<0.01)；隨著PHL濃度升高，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活力也隨之增加，PHL的保護(hù)作用具有一定的濃度依賴性。此外，PHL(20 μmol/L)組為0.95±0.04，與對照組相比, 單獨(dú)予以20 μmol/L PHL處理并未引起B(yǎng)V2小膠質(zhì)細(xì)胞活力出現(xiàn)明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，n=5，圖1)。

圖1 PHL預(yù)處理可改善LPS導(dǎo)致的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活力降低

2.2 PHL預(yù)處理可降低LPS導(dǎo)致的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO、MDA濃度升高

正常對照組細(xì)胞上清中NO濃度為(3.30±0.72)μmol/L，細(xì)胞內(nèi)MDA濃度為(0.42±0.03)nmol/mg，LPS處理組NO濃度為(8.15±0.39)μmol/L，MDA濃度為(0.95±0.07)nmol/mg，與對照組相比，NO、MDA濃度顯著增加(P<0.001)。PHL(1 μmol/L)+LPS組NO濃度為(3.42±0.33)μmol/L, MDA濃度為(0.54±0.08)nmol/mg；PHL(10 μmol/L)+LPS組NO濃度為(2.73±0.39)μmol/L，MDA濃度為(0.47±0.05)nmol/mg；PHL(20 μmol/L)+LPS組NO濃度為(2.60±0.81)μmol/L，MDA濃度為(0.46±0.05)nmol/mg，與LPS處理組相比，PHL可在一定程度抑制LPS導(dǎo)致的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞上清中NO的濃度、細(xì)胞內(nèi)MDA濃度升高(P<0.01)且PHL的抑制作用存在一定的濃度依賴性。此外，PHL(20 μmol/L)組上清中NO濃度為(2.57±0.44)μmol/L，MDA濃度為(0.42±0.02)nmol/mg，與對照組相比，單獨(dú)予以20 μmol/L PHL處理，并未引起細(xì)胞上清中NO濃度、細(xì)胞內(nèi)MDA濃度出現(xiàn)明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

圖2 PHL預(yù)保護(hù)可降低LPS導(dǎo)致的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO及MDA水平升高

2.3 PHL預(yù)處理可改善LPS導(dǎo)致的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GSH及SOD活性濃度降低

正常對照組細(xì)胞GSH濃度為(23.66±1.32)μg/mg，SOD活性為(18.03±1.52)U/mg，LPS處理組GSH濃度為(18.01±0.49)μg/mg，SOD活性為(9.33±0.37)U/mg，與對照組相比，LPS處理組GSH、SOD活性濃度明顯降低(P<0.001)。PHL(1 μmol/L)+LPS組GSH濃度為(21.76±0.40)g/mg，SOD活性為(12.41±0.63)U/mg；PHL(10 μmol/L)+LPS組細(xì)胞GSH濃度為(22.48±0.40)μg/mg，SOD活性為(14.74±1.07)U/mg；PHL(20 μmol/L)+LPS組細(xì)胞GSH濃度為(22.75±0.50)μg/mg，SOD活性為(18.70±1.17)U/mg；與LPS處理組相比，PHL可在一定程度改善LPS導(dǎo)致的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GSH、SOD活性濃度降低(P<0.01)，隨著PHL濃度升高，PHL的改善作用存在一定的濃度依賴性。此外，單獨(dú)予以20 μmol/L PHL處理，細(xì)胞內(nèi)GSH濃度為(21.92±1.50)μg/mg，SOD活性為(20.44±0.62)U/mg，與對照組相比，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GSH、SOD活性濃度未出現(xiàn)明顯改變(P>0.05，圖3)。

圖3 PHL預(yù)處理可改善LPS導(dǎo)致的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GSH及SOD活性濃度降低

2.4 PHL預(yù)處理可上調(diào)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Nrf2蛋白的磷酸化水平

與對照組比較，LPS處理組其Nrf2磷酸化水平相比于對照組為1.95±0.59，略有增加(P<0.05)。與LPS處理組比較，給予不同濃度PHL預(yù)保護(hù)12 h后，PHL(10 μmol/L)+LPS組為3.60±0.85，PHL(20 μmol/L)+LPS組為3.89±1.01，PHL可進(jìn)一步上調(diào)Nrf2的磷酸化水平(P<0.05, 圖4)。

圖4 PHL預(yù)處理可上調(diào)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Nrf2蛋白的磷酸化水平

2.5 PHL預(yù)處理可上調(diào)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞ARE-LUC報告基因的轉(zhuǎn)錄活性

雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，正常對照組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞相對熒光素酶活性為31.24±8.20，LPS處理組為54.19±5.31，相對熒光素酶活性略有上升(P<0.05)。與LPS處理組相比，PHL(10 μmol/L)+LPS組為89.44±6.12，PHL(20 μmol/L)+LPS組為107.20±19.42，PHL可在一定程度上進(jìn)一步上調(diào)相對熒光素酶活性，且上調(diào)作用存在一定的濃度依賴性(P<0.05，圖5)。

圖5 PHL預(yù)處理可上調(diào)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞ARE-LUC報告基因轉(zhuǎn)錄活性

2.6 PHL預(yù)處理可上調(diào)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1 蛋白水平

采用Western blotting法檢測了各組細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)水平。LPS處理組HO-1蛋白表達(dá)水平相比于對照組比值為1.80±0.32，LPS處理組HO-1蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05)。PHL(10 μmol/L)+LPS組比值為2.13±0.24，PHL(20 μmol/L)+LPS組比值為2.24±0.32，與LPS處理組相比，給與不同濃度PHL預(yù)保護(hù)12 h后可進(jìn)一步上調(diào)HO-1蛋白表達(dá)水平(P<0.05，圖6)。

圖6 PHL預(yù)處理可上調(diào)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1 蛋白水平

3 討論

本研究首先建立了LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。與既往報道[24]一致。相關(guān)實驗結(jié)果證明，LPS是導(dǎo)致BV2小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活后產(chǎn)生大量氧化應(yīng)激產(chǎn)物的重要介質(zhì)，該細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型適宜相關(guān)研究的展開。

本研究發(fā)現(xiàn)給與BV2小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型12 h的PHL預(yù)處理，可以明顯降低LPS導(dǎo)致的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)物的釋放，且PHL的保護(hù)作用還存在一定的濃度依賴性。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Zhang等[25]研究結(jié)果顯示，PHL同樣能夠抑制神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)從而改善MPTP誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的帕金森障礙。此外，還有研究[26]報道PHL能夠改善高糖介導(dǎo)H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)損傷。上述研究結(jié)果表明在細(xì)胞水平上PHL確實具有一定的抗炎抗氧化作用，具有治療抑郁癥的潛在應(yīng)用價值。

為了闡明PHL對LPS導(dǎo)致BV2小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用的分子機(jī)制，本研究探討了PHL對Nrf2/ARE信號通路的影響。LPS處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后，Nrf2蛋白磷酸化水平、HO-1蛋白的表達(dá)也有一定程度的增高，結(jié)果與既往研究[27-28]結(jié)果一致，推測上述現(xiàn)象可能是BV2小膠質(zhì)細(xì)胞對LPS處理的一種防御性代償反應(yīng)。當(dāng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞用PHL預(yù)處理后，可進(jìn)一步得升高Nrf2蛋白磷酸化水平，上調(diào)ARE轉(zhuǎn)錄活性，增加HO-1蛋白表達(dá)，且PHL的上述作用還存在一定程度的濃度依賴性。以往研究[29]表明當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時，穩(wěn)定狀態(tài)下的 Nrf2 發(fā)生磷酸化，解除與Keap1結(jié)合而由胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)移，進(jìn)入細(xì)胞核后識別并與ARE結(jié)合，啟動ARE調(diào)控的多種抗氧化應(yīng)激蛋白的基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。在本研究中，利用Western blotting 以及雙熒光素活性檢測證明PHL能夠增高Nrf2磷酸化水平，上調(diào)ARE轉(zhuǎn)錄活性，增加HO-1蛋白的表達(dá)，暗示Nrf2/ARE通路可能是根皮素在發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用中的途徑之一。