智亮輝 劉偉 李偉 甄四虎 焦喜林

在我國(guó)，胃癌是第三大高發(fā)惡性腫瘤，早期診斷率低，超過(guò)70%的患者初診時(shí)已處于進(jìn)展期[1]，腫瘤發(fā)生局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其特有的生物學(xué)行為，也是導(dǎo)致患者死亡率升高的主要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，是腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制[2]。雖然目前包括手術(shù)、放療、化療和生物治療等胃癌的綜合治療手段有很大提高，但總體5年生存率仍低于20%[3-4]。因此探尋新的胃癌早期診治標(biāo)志物及新的治療靶點(diǎn)、阻斷其侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程，對(duì)于延長(zhǎng)胃癌患者的生存時(shí)間具有重大意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類(lèi)保守性差、組織特異性強(qiáng)，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA序列[5]。國(guó)內(nèi)外研究表明lncRNA在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6]。其中l(wèi)ncRNA-ATB在肝癌、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤中均存在異常表達(dá)，并可做為診斷的生物標(biāo)志物，及潛在的生物治療靶點(diǎn)[7]，但其在胃癌中的作用及具體調(diào)控機(jī)制尚待研究。微RNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可以作用于目的基因的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)，誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，阻止蛋白質(zhì)合成，從而在細(xì)胞生物活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[8]。近年來(lái)許多研究表明，miR-200家族參與調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，其中miR-200a的表達(dá)與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]，但其具體機(jī)制尚待研究。本研究預(yù)測(cè)了lncRNA-ATB的下游結(jié)合分子，并探索其可能的作用機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院2017年1月—2019年12月行胃癌根治性手術(shù)患者56例，其中女性36例，男性20例；年齡45～75歲，中位年齡58歲。納入研究標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未進(jìn)行過(guò)放化療的Ⅰ～Ⅳ期原發(fā)性胃癌患者，術(shù)前有胃鏡病理結(jié)果明確診斷。癌旁組織定義為距腫瘤邊緣5 cm以上的組織。所有臨床組織標(biāo)本及病歷資料的使用，均與患者簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(倫理批號(hào)：2019-KY-54)。

1.2 主要試劑和材料

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司、日本TaKaRa公司；熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒SYBRPremix Ex Taq TMⅡ購(gòu)自日本TaKaRa公司；Lipo 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；lncRNA-ATB或β-catenin-3′UTR si序列克隆購(gòu)自美國(guó)Creative Biogene公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；人胃癌BGC-823細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶、Penicillin-Streptomycin雙抗購(gòu)自美國(guó)Hyclon公司；RIPA高效蛋白裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；E-cadherin、β-catenin、vimentin和GAPDH抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 lncRNA靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 使用TargetSCan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)lncRNA-ATB的靶基因作用序列(http：//www.targetscan.org/vert_72/)，利用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證預(yù)測(cè)內(nèi)容。miR-200a-modified胃癌細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)過(guò)18h培養(yǎng)后，每孔加入1 μg熒光素酶轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶表達(dá)量。

1.3.2 qRT-PCR 收集離體半小時(shí)內(nèi)胃癌及癌旁組織于凍存管中，迅速置于液氮中凍存。RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明操作，最終得到cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩RT-PCR按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共重復(fù)3次。lncRNA-ATB引物序列：上游5-CTTCACCAGCACCCAGAGA-3；下游5-AAGACAGAAAAACAGTTCCGAGTC-3；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5-TTGGTATCGTGGAAGGACTC-3；下游5-TGTCATCATATTTGGCAGGTT-3；miR-200a特異性引物由德國(guó)凱杰公司合成，引物序列：上游5-ATCCAGTGCAGGGTCCCGAGG-3，下游引物為miScript SYBR Green PCR Kit 提供的通用引物，qRT-PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性45 s，75℃15 s，60℃30 s，35個(gè)循環(huán)，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。記錄各組反應(yīng)的CT值，以2-△△CT表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胃癌BGC-823細(xì)胞株及敲低lncRNA-ATB后的人胃癌BGC-823細(xì)胞株(課題組前期已構(gòu)建并驗(yàn)證)在含10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃。

1.3.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌BGC-823細(xì)胞及敲低lncRNA-ATB后的人胃癌BGC-823細(xì)胞株，用無(wú)菌的PBS清洗細(xì)胞2遍，用胰酶消化處理細(xì)胞，3 000 rpm離心5 min，棄去上清，在細(xì)胞沉淀中加入適量RIPA快速細(xì)胞裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，冰浴15 min，混合液在4℃離心15 min(13 000 r/min)后收取上清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定提取液濃度，再向提取裂解液中加入5×SDS上樣緩沖液以備電泳，95℃加熱5 min，并在SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行蛋白電泳，將目的條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后加一抗(兔抗E-cadherin、β-catenin、vimentin抗體，稀釋比分別為1∶200、1∶300、1∶200)4℃搖床過(guò)夜，第二天，去除一抗，PBS清洗2遍，每次10 min，再加入羊抗兔IgG HRP二抗(稀釋比為1∶1 0000)，常溫避光搖床孵育2 h，將熒光ECL檢測(cè)試劑中的A液和B液等體積混合配成顯影液，滴加到PVDF膜上，使用LAS4010儀器進(jìn)行曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。GADPH作為內(nèi)參對(duì)照。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)lncRNA-ATB與miR-200a及β-catenin的結(jié)合位點(diǎn)

lncRNA-ATB通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-200a調(diào)控β-catenin的表達(dá)(圖1)。利用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證在胃癌細(xì)胞BGC-823中敲低lncRNA-ATB，miR-200a熒光素酶活性較敲低前表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=75.262，P<0.001)(圖2)。敲低β-catenin后，miR-200a熒光素酶活性較敲低前表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=47.656，P<0.001)(圖3)。

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)lncRNA-ATB與miR-200a及β-catenin的結(jié)合位點(diǎn)Figure 1 Bioinformatics prediction of binding sites for lncRNA-ATB and miR-200a and β-catenin

圖2 在BGC-823細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-lncRNA-ATB序列后測(cè)定miR-200a熒光素酶活性Figure 2 Determination of miR-200a luciferase activity after transfection of sh-lncRNA-ATB in BGC-823 cellsNote：***P<0.001.

圖3 在BGC-823細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-β-catenin-3′UTR后測(cè)定miR-200a熒光素酶活性Figure 3 Determination of miR-200a luciferase activity after transfection of sh-β-catenin- 3′UTR in BGC-823 cellsNote：***P<0.001.

2.2 胃癌及癌旁組織中l(wèi)ncRNA-ATB和miR-200a表達(dá)水平比較

lncRNA-ATB在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-15.825，P<0.001)(圖4)。miR-200a在胃癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.629，P<0.001)(圖5)。

圖4 lncRNA-ATB在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)水平Figure 4 Expression of lncRNA-ATB in gastric cancer and para-cancer tissuesNote：***P<0.001.

圖5 miR-200a在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)水平Figure 5 Expression of miR-200a in gastric cancer and adjacent tissuesNote：***P<0.001.

2.3 胃癌組織中l(wèi)ncRNA-ATB與miR-200a的表達(dá)水平相關(guān)性分析

在胃癌組織中l(wèi)ncRNA-ATB與miR-200a表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.317，P=0.017)(圖6)。

圖6 胃癌組織中l(wèi)ncRNA-ATB和miR-200a表達(dá)相關(guān)性Figure 6 Correlation between lncRNA-ATB and miR-200a expression in gastric cancer

2.4 胃癌組織中l(wèi)ncRNA-ATB及miR-200a的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

胃癌組織中l(wèi)ncRNA-ATB及miR-200a表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期分化程度、脈管內(nèi)有無(wú)癌栓有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)(表1)。

2.5 敲降lncRNA-ATB后EMT相關(guān)指標(biāo)的變化

在胃癌細(xì)胞BGC-823中敲降lncRNA-ATB后，vimentin(t=9.032，P=0.011)及β-catenin表達(dá)量(t=25.117，P<0.001)降低，E-cadherin表達(dá)量(t=-14.697，P<0.001)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7)。

圖7 在胃癌細(xì)胞BGC-823中敲降lncRNA-ATB后vimentin、β-catenin、E-cadherin表達(dá)水平Figure 7 Expression levels of vimentin，β-catenin and E-cadherin after knockdown of lncRNA-ATB in gastric cancer cell BGC-823Note：*P<0.05，***P<0.001.

表1 胃癌組織中l(wèi)ncRNA-ATB和miR-200a表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between lncRNA-ATB and miR-200a expression levels and clinicopathological features in gastric cancer

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程一般是指惡性腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)松解脫離，經(jīng)過(guò)淋巴或血運(yùn)等途徑到達(dá)身體其它部位或器官并形成定植的過(guò)程。該過(guò)程是一個(gè)多階段、多步驟的過(guò)程，多個(gè)基因及其產(chǎn)物參與調(diào)控[10]。EMT以上皮細(xì)胞表型喪失，間質(zhì)特征獲得為主要特征，在組織纖維化及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在該過(guò)程中腫瘤細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連結(jié)，轉(zhuǎn)變成具有運(yùn)動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞，可通過(guò)局部浸潤(rùn)或脈管系統(tǒng)到達(dá)遠(yuǎn)隔組織[11]。E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，擔(dān)負(fù)上皮細(xì)胞間黏附和連接作用，維持上皮細(xì)胞的形態(tài)、極性及完整性。當(dāng)E-cadherin表達(dá)下調(diào)時(shí)，上皮細(xì)胞間黏附力減弱，促進(jìn)EMT的發(fā)生[12]。

近年研究發(fā)現(xiàn)miRNA在調(diào)控腫瘤生物學(xué)行為方面發(fā)揮重要作用[13]。miRNA是一種由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其特異性堿基序列可與目的基因3′-UTR特異性結(jié)合，導(dǎo)致目的基因降解或誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，從而發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)的作用，進(jìn)而影響細(xì)胞的分化及存活[14]。近年許多研究表明，miR-200家族參與調(diào)控了多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，對(duì)于miR-200的研究逐漸深入[15-16]。miR-200是一種與EMT密切相關(guān)的miRNA家族，其家族成員包括miR-141、miR-429、miR-200a、miR-200b和miR-200c，其中miR-200a可通過(guò)直接作用于E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子β-catenin而調(diào)控EMT的進(jìn)程[17-18]。

有研究表明lncRNA-ATB在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，廣泛參與了惡性腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展過(guò)程[19]，其在結(jié)直腸癌和肝癌的發(fā)展進(jìn)程中的作用已經(jīng)得到證實(shí)[20-21]。但lncRNA-ATB在胃癌中的具體作用機(jī)制尚無(wú)研究報(bào)道。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ATB與miR-200a、miR-200a與β-catenin有直接的結(jié)合位點(diǎn)。

本研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)lncRNA-ATB與miR-200a及β-catenin可以直接結(jié)合，在胃癌細(xì)胞BGC-823中，采用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲降β-catenin的3′-UTR后，miR-200a的表達(dá)水平顯著降低。敲降lncRNA-ATB后，miR-200a的表達(dá)水平顯著降低，這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述推斷。采用qRT-PCR方法檢測(cè)了胃癌及癌旁組織中l(wèi)ncRNA-ATB和miR-200a 的表達(dá)水平，lncRNA-ATB和miR-200a表達(dá)的相關(guān)性分析提示，lncRNA-ATB對(duì)miR-200a表達(dá)具有明確的負(fù)調(diào)控作用。分析了這兩種RNA與胃癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，lncRNA-ATB在胃癌組織中較癌旁組織呈高表達(dá)狀態(tài)，在Ⅲ、Ⅳ期胃癌較Ⅰ、Ⅱ期表達(dá)水平明顯升高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組較陰性組lncRNA-ATB表達(dá)水平明顯升高。miR-200a在胃癌組織中較癌旁組織呈低表達(dá)狀態(tài)，在Ⅲ、Ⅳ期胃癌較Ⅰ、Ⅱ期表達(dá)水平明顯降低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組較陰性組miR-200a表達(dá)水平明顯降低。在胃癌細(xì)胞中敲降lncRNA-ATB后，E-cadherin表達(dá)升高，β-catenin和vimentin表達(dá)下降，研究證實(shí)lncRNA-ATB通過(guò)與miR-200a結(jié)合促進(jìn)了胃癌細(xì)胞EMT進(jìn)程。在胃癌進(jìn)展階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究檢測(cè)了lncRNA-ATB和miR-200a在胃癌組織及癌旁組織中表達(dá)，并驗(yàn)證了二者呈負(fù)相關(guān)，探索了lncRNA-ATB可能通過(guò)與miR-200a結(jié)合，調(diào)控EMT過(guò)程從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展，為研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移潛在的分子機(jī)制提供了一定的前期研究基礎(chǔ)。