季雅菲

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100089）

1 引言

1.1 背景介紹

銀杏（Ginkgo bilobaL.）俗稱“白果”，為我國(guó)特有珍貴樹種，在植物界享有“活化石”之稱，集生態(tài)防護(hù)、觀賞、經(jīng)濟(jì)等價(jià)值為一體，具有良好開發(fā)前景和研究?jī)r(jià)值[1]。

類黃酮是大多數(shù)植物中含量較多的一類次生代謝物，原花青素是類黃酮中的主要成分之一，主要由花青素還原酶（ANR）調(diào)控合成[2]。由于原花青素等黃酮類化合物能為農(nóng)作物提供良好性狀，提高食品的保健作用，還可以為轉(zhuǎn)基因材料著色[3]，故而該類化合物的合成途徑的相關(guān)研究逐漸受到人們的關(guān)注。

1.2 研究目的及意義

近年來，研究者已經(jīng)相繼從一些植物中，如杉木、擬南芥中克隆了ANR 基因，并進(jìn)行了相關(guān)的遺傳和生化研究，但是銀杏GbANR2基因的克隆與表達(dá)分析的分子機(jī)制鮮有報(bào)道[4-5]。本研究以類黃酮合成途徑為切入點(diǎn)，通過基因共表達(dá)分析鑒定出合成途徑中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，對(duì)關(guān)鍵基因GbANR2進(jìn)行了基因克隆，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)分析。本研究將為明確GbANR2對(duì)銀杏類黃酮的合成的作用提供理論基礎(chǔ)，為定向培育高類黃酮含量的優(yōu)質(zhì)銀杏植株提供理論基礎(chǔ)。

2 材料方法

2.1 銀杏黃酮類化合物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的共表達(dá)分析

從NCBI Sequence Read Archive（SRA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://github.com/ncbi/sra-tools）中下載126 個(gè)銀杏樣本的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)，對(duì)其進(jìn)行數(shù)據(jù)處理獲得126 個(gè)樣品中所有基因的表達(dá)數(shù)據(jù)[7-8]。將通過KEGG 鑒定出的銀杏類黃酮合成途徑中的48個(gè)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行基因共表達(dá)分析，計(jì)算所有基因之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)（PCC），篩選PCC＞0.75 的基因，并利用Cytoscape軟件實(shí)現(xiàn)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的可視化。

2.2 GbANR2基因克隆

2.2.1 試驗(yàn)試劑

本試驗(yàn)所用的主要試劑有：RNA 試劑盒（Omega，R6827-01，廣州）、反轉(zhuǎn)錄MonScript?RTIII All-in-One Mix with dsDNase 試劑盒、Phanta?Max Super-Fidelity DNA 高保真酶試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（Tsingke，TSC01，北京）、DL5000DNA Marker（Tsingke，TSJ012-500，北京）、pClone007 Blunt Simple Vector Kit載體試劑盒、TAE溶液、ddH2O無菌水。

2.2.2 基因克隆

（1）RNA 提取及純度測(cè)定。試驗(yàn)過程中的RNA 提取步驟按照試劑盒（Omega，R6827-01，廣州）說明進(jìn)行。摘取銀杏幼葉，磨樣、渦旋、孵育、離心、渦旋，直至所有樣品轉(zhuǎn)移到色譜柱中。加入RWF洗滌緩沖液，丟棄濾液和收集管。

（2）引物設(shè)計(jì)。提取DNA 甲基化相關(guān)基因CDS 序列，使用Primer Primier 程序設(shè)計(jì)引物，采用直接擴(kuò)增的方式進(jìn)行克隆。正向引物（5’-3’）為ATGGCACCGCAGGCTTATCC，反向引物（5’-3’）為TTAGCAGGTAAGCAAGCCCTTGG。

（3）目的片段凝膠回收。切下含目的DNA 片段凝膠，加入等倍體積的Buffer GDP，水浴，短暫離心，將FastPure DNA Mini Columns-G 吸附柱置于Colletion Tubes 2 mL 收集管中，將≤700 μL的溶膠液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，將濾液棄除，吸附柱置于收集管中。靜置，濾液棄除，重復(fù)前一步驟，將吸附柱置于在離心管中，加入Elution Buffer 至吸附柱中央，靜置，棄去吸附柱，離心管存于-20°C。

（4）目的片段連接與轉(zhuǎn)化。取100 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入連接產(chǎn)物，靜置。將其放入水浴中激活45 s，靜置。加入無抗性SOC/LB 培養(yǎng)液，搖1 h。將復(fù)蘇液涂抹至含氨芐青霉素（Amp）的培養(yǎng)基上，倒置過夜12～16 h。

2.3 GbANR2生物信息學(xué)分析

2.3.1GbANR2基因結(jié)構(gòu)分析及染色體定位

基于銀杏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中基因的位置信息，運(yùn)用TBtools軟件實(shí)現(xiàn)目的基因的基因結(jié)構(gòu)的可視化。

2.3.2GbANR2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SWISS-MODEL 在線軟件分析銀杏ANR 蛋白三維結(jié)構(gòu)模型，并與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2.4 GbANR2在銀杏不同組織中的表達(dá)

選取銀杏成年根（R）、成年莖（S）、未成熟葉片（IL）、成熟葉片（ML）、雌球果（OS）、大孢子葉球（M）、未成熟果實(shí)（IF）與成熟果實(shí)（MF），利用GraphPad 進(jìn)行作圖，分析GbANR2 在銀杏不同組織中的表達(dá)量。

3 結(jié)果分析

3.1 基因共表達(dá)分析鑒定銀杏類黃酮合成途徑的核心結(jié)構(gòu)基因

利用處理后的126 個(gè)銀杏公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[6]，對(duì)48 個(gè)類黃酮合成結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行共表達(dá)分析（PCC＞0.75），篩選出12個(gè)高度相關(guān)的核心基因[7]，這些基因在類黃酮合成中發(fā)揮重要作用，現(xiàn)將其定義為參與類黃酮合成的核心基因。分別為CHS5、4CL2、DFR2、F3’H1、ANR3、PAL4、CHS1、ANS1、ANR2、CHI、CHS4、F3H1。

3.2 GbANR2基因克隆

3.2.1 目的基因的擴(kuò)增與純化

以cDNA 為模板，利用Phanta? Max Super-Fidelity DNA Polymerase 進(jìn)行GbANR2（Gb_10028）基因克隆，如圖1，將所有的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)并且進(jìn)行切膠回收、轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆鑒定。

圖1 類黃酮通路相關(guān)核心結(jié)構(gòu)基因的共表達(dá)分析Fig.1 The analysis on coexpression of core structure genes relatedto flavonoid pathway

3.2.2 克隆序列比對(duì)

將擎科公司測(cè)序結(jié)果使用NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行分析，將測(cè)序結(jié)果與原DNA 序列輸入進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)多序列比對(duì)結(jié)果可知，克隆序列與目的基因的序列完全相同，大小為1029bp，編碼341個(gè)氨基酸。

3.3 GbANR2的生物信息學(xué)分析

3.3.1GbANR2的基因結(jié)構(gòu)和染色體定位

運(yùn)用TBtools 進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)可視化分析，得出GbANR2基因分布在3號(hào)染色體上，具有4個(gè)內(nèi)含子、5個(gè)外顯子，長(zhǎng)度為1029bp。通過DANMAN 軟件對(duì)GbANR2堿基序列進(jìn)行翻譯，得到由341個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

3.3.2GbANR2同源性分析

使用Blast 將GbANR 序列與其它植物的ANR 基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示GbANR 基因的核苷酸序列與其它植物的ANR基因的核苷酸序列同源性非常高，尤其是裸子植物的白云杉和北美云杉，相似性分別為74.44%和74.24%，說明GbANR 與來自裸子植物的ANR 具有較近的親緣性。此外，GbANR 與日本柳杉、野茶樹、蘋果的相似性依次為72.59%，65.32% 和64.99%。因此，從蛋白質(zhì)序列比較結(jié)果推測(cè)GbANR正是銀杏ANR基因家族成員之一。

3.3.3GbANR2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過SOPMA 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，GbANR2蛋白結(jié)構(gòu)中α 螺旋有141 個(gè)氨基酸，所占比例為41.23%；β 轉(zhuǎn)角有27 個(gè)氨基酸，所占比例為7.89%，延伸鏈（Extended strand）有50 個(gè)氨基酸，所占比例為14.62%，無規(guī)則卷曲（Random coil）有124 個(gè)氨基酸，所占比例為36.26%。使用Swiss-model 對(duì)GbANR2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，GbANR2以花青素還原酶為模板構(gòu)建，兩者蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性為59.16%，模型主要包括12 個(gè)α 螺旋與10個(gè)β 轉(zhuǎn)角。

3.4 GbANR2在銀杏不同組織中的表達(dá)

銀杏發(fā)育過程中，GbANR2基因在根、莖中表達(dá)量較低，而生長(zhǎng)初期相反，表達(dá)量較高，而后又迅速下調(diào)，使花青素得以積累。在不同的銀杏組織中，ANR 基因的表達(dá)量均有所不同，依次是IF＞OS＞IL＞MF＞R＞S＞ML＞M ,表達(dá)量結(jié)果差異顯著。

4 結(jié)語

本研究從銀杏公共數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)126個(gè)，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和均一化，以皮爾森相關(guān)系數(shù)PCC＞0.75 為標(biāo)準(zhǔn)，鑒定出12 個(gè)關(guān)鍵核心基因。其中GbANR2基因與其它基因的相互調(diào)控關(guān)系較為緊密，對(duì)該基因進(jìn)行了克隆，并對(duì)其在染色上位置、基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)，以及在不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行了分析。研究表明ANR基因在在根、莖中的表達(dá)量較低，在葉、果實(shí)中的表達(dá)量較高，ANR基因在植物特定器官表達(dá)中起重要作用。

類黃酮在銀杏葉中具有重要作用，因此研究銀杏類黃酮代謝途徑，并利用相關(guān)基因進(jìn)行有效的調(diào)控是獲得高產(chǎn)類黃酮的基礎(chǔ)。本研究鑒定了銀杏類黃酮合成關(guān)鍵基因，克隆了銀杏GbANR2基因。為了更好得進(jìn)行后續(xù)研究，可以從銀杏幼葉中選取表達(dá)量較高的其它核心基因進(jìn)行克隆，為研究銀杏類黃酮合成途徑提供豐富的理論依據(jù)。