張 靜，王剛獅，劉瑞霞，時寶凌，廉梅霞

（山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030009）

1 材料與方法

1.1 材料

將采自山西省運城市平陸縣的野生葛根根部進行組織培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件為：MS+1.0 mg/L6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L KT+0.5 mg/L NAA；16 h 光照/8 h 黑暗。此時愈傷組織質(zhì)地疏松，顏色為奶白色，呈顆粒狀，易分散。只有質(zhì)地疏松、淡黃色的顆粒狀愈傷組織才能作為建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的材料[1-3]。

1.2 方法

1.2.1 配置不同種類培養(yǎng)基進行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)并測總黃酮含量

選擇4種培養(yǎng)基：分別為MS、B5、N6和WS 作為基本培養(yǎng)基，其中添加的外源激素種類和含量均相同，具體如下，2.0 mg/L 2.4-D+0.5 mg/L KT+3%蔗糖。在超凈工作臺中，用鑷子挑取1.0±0.1 g的新鮮愈傷組織，分別接種于4種液體培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接30瓶，將接種好的三角瓶置于搖床上，調(diào)整轉(zhuǎn)速為110 r/min，培養(yǎng)溫度為26℃，用黑布遮擋搖床，保證黑暗條件培養(yǎng)。26 d 后，取出細(xì)胞培養(yǎng)物，放入離心管，在5 000 rmp下離心15 min，取出后記錄細(xì)胞鮮質(zhì)量。烘干，烘箱溫度為55℃，精密稱取0.1 g粉末，放置于具塞錐形瓶中，加入70%的酒精10 mL，70℃超聲處理30 min，過濾后倒入10 mL容量瓶中，用70%的酒精定容置刻度線。利用分光光度計測定其在250 nm下的吸光度，計算得到總黃酮含量。

1.2.2 設(shè)計正交實驗測定不同植物激素對懸浮細(xì)胞生長量及總黃酮含量的影響

在MS 培養(yǎng)基中添加不同的植物生長素。激素種類與含量見表1。培養(yǎng)條件為：蔗糖3%、pH6、26℃暗培養(yǎng)，26 d后精密測量細(xì)胞鮮質(zhì)量及合成的總黃酮含量，試驗重復(fù)6次。

表1 植物激素對懸浮細(xì)胞影響的正交實驗Tab.1 The orthogonal experiment of effects of plant hormones on suspension cells

1.2.3 pH值對懸浮細(xì)胞生長及總黃酮合成的影響

分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 為4.8、5.3、5.8、6.3 和6.8。每種pH 培養(yǎng)基60瓶。培養(yǎng)條件為25℃，黑暗培養(yǎng)26 d，精密測定其細(xì)胞鮮質(zhì)量以及總黃酮含量。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基種類對懸浮細(xì)胞生長量及總黃酮合成的影響

由圖1 可知：不同基本培養(yǎng)基對野葛懸浮細(xì)胞生長有很大的影響，總黃酮含量也隨之變化。其中，B5 培養(yǎng)基細(xì)胞鮮質(zhì)量最大，高達(dá)10 g，高于MS、N6 和WS 其他3 種培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞呈褐黃色，分散性好。其次，MS 培養(yǎng)基中細(xì)胞鮮質(zhì)量為7.35 g，僅次于B5 培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞顏色為奶黃色。在N6和WS 培養(yǎng)基中，不僅細(xì)胞生長緩慢且聚集成大塊黑褐色的硬塊。總黃酮含量與懸浮細(xì)胞的生長量呈正相關(guān)，依次是B5培養(yǎng)基最高為13.12 %，MS 培養(yǎng)基為10.45%，N6 培養(yǎng)基為6.32%，WS培養(yǎng)基為6.22%。

圖1 培養(yǎng)基種類對懸浮細(xì)胞生長量及總黃酮合成的影響Fig.1 The effect of medium type on growth of suspension cells and synthesis of total flavonoids

2.2 植物激素對懸浮細(xì)胞生長量及總黃酮合成的影響

4種激素對野葛懸浮細(xì)胞生長及總黃酮含量的影響如表2。

表2 植物激素對懸浮細(xì)胞生長量及總黃酮合成的影響Tab.2 The effects of plant hormones on the growth of suspension cells and the synthesis of total flavonoids

由表3極差分析R可以看出，4種激素對細(xì)胞生長量影響大小依次是：2,4-D＞KT＞6-BA ＞NAA。通過比較k 值大小得出：最優(yōu)激素組合為A2B3C3D3，即1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+1.0 mg/L NAA。其中6-BA、2,4-D、KT 對野葛懸浮細(xì)胞生長的影響均達(dá)到極顯著水平，NAA對懸浮細(xì)胞生長的影響較小。

表3 植物激素對懸浮細(xì)胞生長量影響的極差分析Tab.3 The range analysis of the effect of plant hormones on the growth of suspension cells

由表4 極差分析可知，4 種激素對于總黃酮合成影響大小依次是：NAA＞2,4-D＞6-BA＞KT。 最 優(yōu)激素組合為A3B3C3D2，即2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。NAA 與2，4-D 對懸浮細(xì)胞總黃酮含量的影響達(dá)到極顯著水平，6-BA和KT的影響達(dá)到顯著水平。

表4 植物激素對懸浮細(xì)胞總黃酮合成影響的極差分析Tab.4 The range analysis of the effect of plant hormones on the synthesis of total flavonoids in suspension cells

2.3 培養(yǎng)基pH值對懸浮細(xì)胞生長及總黃酮合成的影響

由圖2可知：當(dāng)pH為5.8時，細(xì)胞合成的總黃酮含量最高為11.2%。當(dāng)培養(yǎng)基的pH為5.3時，細(xì)胞鮮質(zhì)量最大為8.7 g。因此，最適合懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的pH 與最適合提供代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基的pH有所不同。

3 討論與結(jié)論

3.1 B5培養(yǎng)基是最適合野葛懸浮細(xì)胞的生長的基本培養(yǎng)基

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是在液體中培養(yǎng)，相對于固體培養(yǎng)基而言，液體中的溶質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)更容易被細(xì)胞吸收利用，因而細(xì)胞對培養(yǎng)基的種類更加敏感，同時懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的目的是獲得較高的目的產(chǎn)物，而次級代謝產(chǎn)物是細(xì)胞分泌所產(chǎn)生的，因而高細(xì)胞生物量與高代謝產(chǎn)物含量理論上呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果保持一致。因此，在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時，選擇B5培養(yǎng)基可以獲得較高的細(xì)胞生長量和代謝產(chǎn)物總黃酮含量。

3.2 野葛懸浮細(xì)胞生長與代謝產(chǎn)物總黃酮合成所需最適激素不同

在藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，外源激素種類選擇不當(dāng)、激素濃度過高或過低、激素相互間的配比不合適均會抑制植物細(xì)胞生長與代謝產(chǎn)物積累[4]。正交試驗結(jié)果顯示，2，4-D、6-BA和KT這3種植物激素的添加可以顯著提高懸浮細(xì)胞的生物量，而要提高代謝產(chǎn)物總黃酮的含量則需要適當(dāng)添加NAA，說明NAA在調(diào)節(jié)某些次級代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶的表達(dá)中起作用[4]。因此，在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中可以采用2 步培養(yǎng)法，以獲得最高的次級代謝產(chǎn)物量。Van der plas 等[5]在Morinda citrifolia 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，NAA 是產(chǎn)生目標(biāo)代謝產(chǎn)物的必要條件。

3.3 野葛細(xì)胞生長與總黃酮合成所需最適培養(yǎng)基的pH值不同

pH 對懸浮細(xì)胞的影響主要體現(xiàn)在改變細(xì)胞膜的通透性以及引起有關(guān)蛋白質(zhì)變性等方面。植物細(xì)胞培養(yǎng)時，其pH一般需要控制在微酸性的范圍內(nèi)，即pH為5.3～6.0[6]。這與本研究結(jié)果一致，即微酸環(huán)境有利于細(xì)胞的增殖與次級代謝物的產(chǎn)生。