任美燕

山西工商學(xué)院 (太原 030006)

百香果俗稱“巴西果”和“雞蛋果”，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，其用途主要生產(chǎn)果汁，可發(fā)酵果酒，對(duì)果皮的利用率低[1-2]。目前對(duì)百香果果皮的研究集中在制成果皮粉及果膠、色素、多糖、多酚等活性物質(zhì)的提取利用[3-6]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其黃酮含量豐富，其活性成分具有控制血糖、抗氧化、降血脂等作用[7-8]。百香果果皮中的黃酮作為保健品，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及廣泛的應(yīng)用前景[9]。

通過(guò)比較不同的提取方法發(fā)現(xiàn)，其中以超聲提取總黃酮的提取率更高，該方法使原料與提取劑之間始終保持較大的有效成分濃度差，減少了濾渣中溶質(zhì)殘留，有效提高提取過(guò)程的效率[10-14]。因此本文采用超聲提取百香果果皮中黃酮，并且以黃酮得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法，確定最佳提取工藝條件，為百香果果皮黃酮的純化利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫百香果，廣西省玉林市；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，分析純，北京華威銳科化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F80型高速粉碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；755B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16GB型離心機(jī)，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1原料處理

百香果外表完好無(wú)破損，去瓤取果皮。切塊放入恒溫干燥箱80 ℃烘干至恒重，用粉碎機(jī)碾壓成粉末，60目過(guò)篩，密封收于冰箱冷藏保存。

1.3.2蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[15]

配制0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 至 10 mL 具塞比色管中，用50%乙醇定容至5 mL，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后，加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后，加入4%的NaOH溶液4.0 mL，用50%的乙醇定容至10 mL，搖勻后靜置15 min后，在510 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度Y對(duì)蘆丁濃度X(mg/mL)進(jìn)行線性回歸：

y=0.113 1x-0.000 8，R2=0.999 5

1.3.3單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

稱取1 g百香果果皮粉末，設(shè)定料液比(g/mL)為1∶20、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間30 min、提取功率250 W，設(shè)定乙醇濃度20%、40%、60%、80%、100%進(jìn)行超聲提取，測(cè)定黃酮得率。

1.3.3.2 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響

稱取1 g百香果果皮粉末，設(shè)定料液比(g/mL)1∶20、乙醇濃度60%、提取時(shí)間30 min 、提取功率250 w，提取溫度設(shè)定30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃進(jìn)行超聲提取，測(cè)定黃酮提取率。

1.3.3.3 料液比對(duì)黃酮得率的影響

稱取1 g百香果果皮粉末，設(shè)定乙醇濃度60%、提取時(shí)間30 min、提取溫度50 ℃、提取功率250 W、料液比(g/mL)設(shè)定1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70進(jìn)行超聲提取，測(cè)定黃酮得率。

1.3.3.4 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

稱取1 g百香果果皮粉末，設(shè)定乙醇濃度60%、料液比(g/mL)1∶20、提取溫度50 ℃、提取功率250 W、提取時(shí)間設(shè)定10 min、20 min、30 min、40 min、50 min進(jìn)行超聲提取，測(cè)定黃酮得率。

1.3.3.5 超聲功率對(duì)黃酮得率的影響

稱取1 g百香果果皮粉末，設(shè)定乙醇濃度60%、料液比(g/mL)1∶20、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間30 min，提取功率設(shè)定200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W進(jìn)行超聲提取，測(cè)定黃酮得率。

1.3.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)提取黃酮實(shí)驗(yàn)中乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)3個(gè)因素3個(gè)水平，運(yùn)用Design-Expert8實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，完成三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)因素編碼及水平如表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.4 黃酮得率的計(jì)算

黃酮含量的測(cè)定[20]：分別吸取不同工藝參數(shù)的提取液1 mL，依次加入4 mL 60%的乙醇，分別加入0.3 mL 5%的NaNO2，搖勻，靜置6 min；再依次加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3，搖勻，靜置6 min，再分別加入 4 mL 1 mol/L的NaOH，用60%乙醇定容至50mL，搖勻，靜置20 min，然后于510 nm測(cè)吸光度，計(jì)算黃酮得率：

黃酮得率(mg/g)=(0.113 1A-0.000 8)×v/m

式中：A為黃酮的吸光度；v為黃酮提取液總體積，mL；w為百香果果皮干粉質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響

圖1 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響

如圖1所示，黃酮得率隨著乙醇濃度的增加而增加，但乙醇濃度超過(guò)60%后提取率開(kāi)始下降，這是因?yàn)橐恍┐既苄噪s質(zhì)、色素、親脂性成分的溶出量增大，故乙醇的最適提取濃度為60%。

2.1.2提取溫度對(duì)黃酮得率的影響

圖2 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響

如圖2所示，百香果皮當(dāng)中的黃酮得率隨著提取溫度的升高而發(fā)生變化，并且在提取溫度為50 ℃的時(shí)候，提取率最高，之后黃酮得率下降。這是因?yàn)殡S著溫度升高，乙醇揮發(fā)，百香果果皮中果膠等一些物質(zhì)的溶出量也會(huì)相應(yīng)增加，不利于黃酮的提取。因此50 ℃是提取百香果果皮當(dāng)中黃酮的最適提取溫度。

2.1.3料液比對(duì)黃酮得率的影響

如圖3所示，黃酮得率隨著料液比的增加而增大，當(dāng)料液比(g/mL)達(dá)到1∶50時(shí)黃酮得率最高，之后料液比再增大，黃酮得率呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著提取溶劑用量的增加，使百香果果皮當(dāng)中，黃酮物質(zhì)提取率的濃度差大大增加，從而提高了傳質(zhì)速度，使百香果果皮當(dāng)中黃酮提取率上升。當(dāng)溶劑增加到一定程度后，黃酮已經(jīng)被大部分提取出來(lái)，此時(shí)料液比對(duì)黃酮得率的影響降低。百香果果皮中的黃酮提取的最適料液比(g/mL)為1∶50。

圖3 料液比對(duì)黃酮得率的影響

2.1.4提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

如圖4所示，百香果皮當(dāng)中黃酮得率隨著時(shí)間的增加而大幅度上升。但當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，黃酮得率最高，之后得率有所下降。因此，選用40 min是黃酮的最適提取時(shí)間。

2.1.5超聲功率對(duì)黃酮得率的影響

圖5 超聲功率對(duì)黃酮得率的影響

如圖5所示，在超聲功率較小時(shí)，黃酮得率隨著超聲功率的增加而響應(yīng)地提高，當(dāng)超聲功率為250 W時(shí)，達(dá)到黃酮得率的最高值。隨著超聲功率的不斷增大，百香果果皮中的其他物質(zhì)被提出，影響黃酮的溶出。因此，超聲功率250 W是最適提取條件。

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定料液比(g/mL)在1∶50、超聲功率250 W，考察乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素對(duì)百香果果皮黃酮提取率的影響，用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，以百香果黃酮得率作為響應(yīng)值。根據(jù)響應(yīng)面法中Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理運(yùn)用Design-Expert 8進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-Expert8軟件對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)逐步回歸擬合，得回歸模型方程為：Y=19.18+0.1125A+0.3375B+0.45C-0.725AB-0.7AC-0.6BC-2.2775A2-0.3275B2-1.2025C2

2.2.2模型的顯著性檢驗(yàn)

對(duì)確定回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，P<0.05，對(duì)百香果果皮黃酮提取建立的二次多項(xiàng)模型具有顯著性，失擬項(xiàng)不顯著。該模型擬合度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，能夠用來(lái)分析和與預(yù)測(cè)百香果果皮中總黃酮的提取。其中一次項(xiàng)B項(xiàng)、C項(xiàng)顯著，A項(xiàng)不顯著。交互項(xiàng)AC、AB、BC顯著，二次項(xiàng)B2不顯著，A2、C2項(xiàng)顯著。根據(jù)表3中F值的大小判斷各因素的影響程度次序?yàn)樘崛囟?提取時(shí)間>乙醇濃度，其中提取溫度和提取時(shí)間對(duì)百香果果皮的黃酮提取率的影響達(dá)到顯著水平。乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度的之間的相互作用見(jiàn)圖6～圖8。

通過(guò)模型預(yù)測(cè)百香果果皮黃酮提取的最適條件是：乙醇濃度59.30%、提取時(shí)間42.62 min、提取溫度50.38 ℃，黃酮得率理論值為19.281 6 mg/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化的提取條件進(jìn)行百香果果皮提取，考慮實(shí)際操作的方便性，將提取工藝參數(shù)修正為乙醇濃度60%、提取時(shí)間40 min、提取溫度50 ℃，測(cè)得黃酮得率為19.212 4 mg/g，與理論預(yù)測(cè)基本吻合，說(shuō)明基于響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，有實(shí)用價(jià)值。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析表

圖6 乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

圖7 乙醇濃度和提取溫度對(duì)黃酮得率的影響

圖8 提取時(shí)間和提取溫度對(duì)黃酮得率的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以黃酮的提取率為考查指標(biāo)，采用超聲提取法使百香果果皮與提取劑之間始終保持較大的有效成分濃度差，減少了濾渣中溶質(zhì)殘留，可有效提高提取過(guò)程的效率。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化百香果果皮中黃酮的提取工藝，結(jié)果表明最佳工藝條件為：乙醇濃度60%、提取時(shí)間40 min、提取溫度50 ℃，測(cè)得黃酮得率為19.212 4 mg/g。重復(fù)性試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波提取工藝重復(fù)性好、工藝方案穩(wěn)定可行。