賀明陽，喻最新，姚世響，王日葵，周煉，鄧涂靜，洪敏*

1(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶，400712)2(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶，400712)3(中國科學(xué)院華南植物園植物資源保護(hù) 與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510650)4(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院， 重慶，400715)

血橙(CitrussinensisL.Osbeck)屬甜橙類，果肉含有紅色血絲，肉質(zhì)細(xì)嫩化渣，具有獨(dú)特的玫瑰香氣[1]。常見的血橙品種有塔羅科(Tarocco)、桑吉耐洛(Sanguinello)和摩洛(Moro)[2-3]。血橙是富含花色苷的柑橘[4]，其較低的糖酸比使果實(shí)風(fēng)味減弱[3]?；ㄉ帐茄戎兄饕目寡趸钚猿煞?，能夠清除自由基[5]，還能預(yù)防肥胖癥、糖尿病、癌癥、抗炎癥等[3,6]，其含量是評(píng)價(jià)血橙商業(yè)價(jià)值的重要指標(biāo)[7]。研究證明血橙花色苷的積累是冷調(diào)控過程[8]，依賴較大晝夜溫差，熱帶/亞熱帶氣候下種植的血橙普遍著色不夠，限制了血橙商業(yè)生產(chǎn)的地理種植[6]。目前柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，消費(fèi)市場(chǎng)對(duì)果實(shí)品質(zhì)要求更高。因此，如何促進(jìn)血橙增糖著色、提升果實(shí)鮮食品質(zhì)，值得探究。

黃腐酸(fulvic acid, FA)是腐植酸中水、酸、堿都可溶的組分，含有羧基、酚羥基和醌基等活性基團(tuán)[9]，具有較強(qiáng)的絡(luò)合、螯合和表面吸附能力，與氮磷鉀等礦質(zhì)元素互溶，分子質(zhì)量小，滲透能力強(qiáng)，容易被植物吸收[10]。研究表明，F(xiàn)A能夠促進(jìn)植物生長[11]、提高作物抗逆性[12-13]、增加產(chǎn)量[9,11]、改善果實(shí)糖酸比和味感[12,14]。此外，F(xiàn)A對(duì)環(huán)境友好、人類健康安全[13]，且有研究表明FA具有抗炎癥、治療糖尿病的功效[15]。目前，F(xiàn)A處理對(duì)血橙成熟過程中花色苷和糖酸積累變化的研究還鮮有報(bào)道。

本研究選用我國主要栽培的塔羅科血橙為試材，于果實(shí)轉(zhuǎn)色期后(花后230 d)葉面噴施FA。運(yùn)用HPLC和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)探究血橙成熟過程中(花后230～324 d)果實(shí)花色苷和糖酸含量等品質(zhì)指標(biāo)變化及相關(guān)代謝基因的表達(dá)模式，為改善血橙品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗(yàn)于2016—2018年在重慶市璧山區(qū)綠躍血橙種植園進(jìn)行，供試材料為30年生塔羅科血橙，開花時(shí)間為4月23日。預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，花后230 d葉面噴施1 g/L FA(含F(xiàn)A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%，上海通微生物技術(shù)有限公司)能明顯改善血橙果實(shí)品質(zhì)，且效果最佳。因此本研究選取樹勢(shì)一致、常規(guī)管理的血橙植株，于果實(shí)轉(zhuǎn)色期后(花后230 d)葉面噴施1 g/L FA(為FA組)，噴施清水為CK組。至果實(shí)完全成熟(花后324 d)，期間每隔15 d左右取1次樣。選取大小適中、無病蟲害和機(jī)械損傷的果實(shí)，3棵樹為1次重復(fù)，每次重復(fù)15個(gè)果子，設(shè)3次重復(fù)。采后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，部分樣品取果肉用液氮速凍后于-80 ℃保存，部分樣品榨汁后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TU-1901紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國伯樂公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 光譜法測(cè)定血橙果汁總花色苷含量

血橙果汁總花色苷含量的測(cè)定選用光譜法[1]。血橙鮮果榨汁后10 000 r/min離心10 min。各取2 mL上清液，分別用緩沖液A(0.05 mol/L KCl、0.15 mol/L HCl，pH=1.0)和緩沖液B(0.4 mol/L CH3COONa、0.24 mol/L HCl，pH=4.5)稀釋至10 mL。最后于510 nm和700 nm處分別測(cè)定吸光度值。結(jié)果計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：ΔA=(A510 nm-A700 nm)pH 1.0-(A510 nm-A700 nm)pH4.5;DF是稀釋倍數(shù);484.82是矢車菊素-3-葡萄糖苷分子質(zhì)量;24 825是其摩爾吸光系數(shù)。

1.3.2 HPLC測(cè)定血橙果肉可溶性糖和有機(jī)酸含量

糖、酸的提取參考ZHANG等[16]和鄭惠文等[17]的方法。稱取3 g研磨成粉末的果肉樣品，加入5 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))冰乙醇。35 ℃水浴浸提20 min，室溫5 000 r/min離心5 min后取上清液，重復(fù)抽提3次，合并上清液后定容至20 mL。取5 mL提取液，室溫5 000 r/min離心5 min。然后取3 mL上清液在35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，最后用1.5 mL雙蒸水溶解，過0.22 μm 的濾膜。

色譜條件參考喻最新等[7]的方法?？扇苄蕴菧y(cè)定的色譜條件：色譜柱選用APS-2HYPERSIL柱(260 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=70∶30，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，示差折光檢測(cè)器(refractive index detector，RID)。抗壞血酸測(cè)定的色譜條件：色譜柱選用UMISILC18(2)柱(260 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫25 ℃，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(0.1%磷酸)=1∶99，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長為245 nm。檸檬酸、蘋果酸測(cè)定的色譜條件：色譜柱選用Venusil MP C18柱(260 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫40 ℃，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V[0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH 2.5)]=97∶3，流速1 mL/min，檢測(cè)波長為210 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

總糖、總酸含量為各組分含量之和。

1.3.3 血橙果肉總RNA提取及cDNA合成

果肉總RNA提取參考天根植物多糖多酚總RNA提取試劑盒(DP441型)的產(chǎn)品說明，然后經(jīng)Tiangen FastKing RT Kit (with gDNase)(KR116型)試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 qRT-PCR測(cè)定基因表達(dá)水平

血橙花色苷及糖酸代謝相關(guān)基因引物序列分別參考CARMONA等[6]和LIU等[18]，內(nèi)參基因選用EF-1α[8](Accession No.XM_015533332)。參照寶生物SYBR?PremixExTaqTMII的說明操作，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：10 μL SYBR Green I mix，0.8 μL正向引物，0.8 μL反向引物，1.5 μL cDNA模板，6.9 μL ddH2O。操作程序如下：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，58 ℃、30 s，經(jīng)40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。融解曲線繪制：95 ℃、10 s，降溫到65 ℃后開始以0.5 ℃每步升溫，并維持5 s采集熒光信號(hào)，反應(yīng)至95 ℃結(jié)束。每個(gè)樣品3次重復(fù)。采用2-ΔΔct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

選用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并執(zhí)行單因素方差分析(P<0.05)，選用Origin 9繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 FA處理對(duì)血橙果汁總花色苷含量及果實(shí)著色的影響

由圖1可知，血橙成熟過程中，F(xiàn)A處理組花色苷含量始終顯著高于CK組。花后324 d，F(xiàn)A組花色苷含量為48.92 mg/L，比CK組提高了153.7%。結(jié)果表明，花后230 d葉面噴施FA能顯著促進(jìn)血橙果實(shí)花色苷積累。花色苷屬黃酮類化合物[7]。XU等[13]發(fā)現(xiàn)FA處理對(duì)葡萄苯丙烷代謝相關(guān)酶活性以及終產(chǎn)物的積累具有誘導(dǎo)作用，能夠提高鮮食葡萄總黃酮含量。

由圖2可知，花后230～324 d，F(xiàn)A組和CK組果實(shí)的果肉以及果汁顏色均越來越深?；ê?30 d，F(xiàn)A組和CK組果肉均未著紅色。花后243 d，F(xiàn)A組開始出現(xiàn)紅血絲，CK組仍未著紅色?；ê?61～324 d，F(xiàn)A組和CK組果肉均含有紅血絲，果汁顏色越來越紅，且FA組血橙果肉和果汁顏色明顯比CK組紅?；ㄉ蘸孔兓c血橙果肉以及果汁顏色的變化進(jìn)程基本一致。

圖1 黃腐酸處理對(duì)血橙成熟過程中果汁花色苷含量的影響Fig.1 Effects of preharvest application of fulvic acid on anthocyanin content in maturing Tarocco blood oranges注：*表示同一時(shí)期2組果實(shí)在P<0.05水平上存在顯著差異(下同)

2.2 FA處理對(duì)血橙花色苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)水平的影響

血橙花色苷代謝途徑已闡明[6,19]。莽草酸途徑連接糖代謝與次生代謝，糖酵解途徑產(chǎn)生的磷酸烯醇式丙酮酸和戊糖磷酸途徑產(chǎn)生的赤蘚糖-4-磷酸進(jìn)入莽草酸途徑生成苯丙氨酸[20]。苯丙氨酸作為最直接的前體物質(zhì)，經(jīng)苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、肉桂酸4-羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase, C4H)、CoA連接酶(4-hydroxy-cynnamoyl CoA ligase, 4CL)、查爾酮合成酶(chalcone synthase, CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerize, CHI)、黃酮醇3-羥化酶(flavonone 3-hydroxylase, F3H)、類黃酮3-羥化酶(flavonoid 3′-hydroxylase, F3′H)、類黃酮3,5-羥化酶(flavonoid 3′5′-hydroxylase, F3′5′H)等催化生成二氫黃酮醇。二氫黃酮醇可經(jīng)黃酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)催化形成黃酮醇，或是在二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)催化下生成無色花青素。無色花青素經(jīng)花青素合成酶(anthocyanin synthase, ANS)及糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucose-flavonoid 3-O-glucosyltransferase, UFGT)作用生成穩(wěn)定的花色苷，最后經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferases, GST)轉(zhuǎn)至液泡儲(chǔ)存。

由圖3可知，血橙成熟過程中FA組和CK組的12個(gè)基因表達(dá)水平基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，該結(jié)果與喻最新等[7]研究一致。FA處理后，4CL表達(dá)量在花后261、276、293、324 d顯著上調(diào)，分別為CK組的1.84、1.49、1.74、3.65倍；CHS表達(dá)量在花后243、261、293、324 d顯著上調(diào)，分別為CK組的1.58、1.29、2.17、1.66倍；DFR表達(dá)量在花后243、276、309、324 d顯著上調(diào)，分別為CK組的1.59、1.55、1.46、2.30倍；ANS表達(dá)量在花后243、261 d顯著上調(diào)，分別為CK組的1.80、2.55倍；UFGT表達(dá)量在花后243、261、324 d顯著上調(diào)，分別為CK組的1.68、2.21、2.10倍；GST表達(dá)量在花后243、261、276、324 d顯著上調(diào)，分別為CK組的2.82、3.64、2.09、1.96倍；且這些基因在其他時(shí)期與CK組表達(dá)豐度基本一致。綜合分析認(rèn)為，花后230 d葉面噴施FA能夠激活4CL、CHS、DFR、ANS、UFGT、GST的表達(dá)，認(rèn)為這些基因是FA調(diào)控血橙花色苷合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因。另外，F(xiàn)A處理誘導(dǎo)F3′5′H、ANS、GST及UFGT的表達(dá)峰值提前了32 d，F(xiàn)3H的表達(dá)峰值提前了15 d。XU等[13]研究發(fā)現(xiàn)FA處理顯著誘導(dǎo)了葡萄果皮中PAL、C4H、4CL、CHS表達(dá)的上調(diào)，研究結(jié)果與本研究結(jié)果相互印證。

二氫黃酮醇的轉(zhuǎn)化是類黃酮代謝途徑中的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)血橙成熟過程中FA組DFR與FLS表達(dá)水平的比值始終高于CK組，表明FA處理使血橙類黃酮代謝途徑朝著無色花青素方向進(jìn)行，且隨著ANS、UFGT及GST表達(dá)水平顯著上調(diào)，促進(jìn)了無色花青素合成穩(wěn)定的花色苷。該結(jié)果與低溫對(duì)血橙花色苷的調(diào)控機(jī)制相似[6]。

A～L-基因分別為PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′5′H、FLS、DFR、ANS、UFGT、GST圖3 黃腐酸處理對(duì)血橙成熟過程中花色苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of preharvest application of fulvic acid on transcription levels of anthocyanins biosynthesis related structural genes in maturing Tarocco blood oranges

2.3 FA處理對(duì)血橙果肉可溶性糖含量的影響

糖是柑橘果實(shí)品質(zhì)最主要的指標(biāo)之一，柑橘果實(shí)主要積累蔗糖、果糖和葡萄糖等可溶性糖。由圖4可知，花后230 d，蔗糖、果糖和葡萄糖含量比例約為2∶1∶1，龔榮高等[21]在甜橙果實(shí)膨大后期也發(fā)現(xiàn)該結(jié)果?；ê?24 d，F(xiàn)A組總糖、果糖、葡萄糖、蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為75.33、20.87、20.22、33.84 mg/g，比CK組分別提高了10.2%、15.1%、14.5%、6.7%。花后261 d，F(xiàn)A組總糖、蔗糖、果糖、葡萄糖含量雖高于CK組，但無顯著差異?；ê?43、276、293、309、324 d，F(xiàn)A組總糖、蔗糖、果糖、葡萄糖含量均顯著高于CK組，表明FA處理顯著提高了血橙成熟過程中可溶性糖含量。彭玲等[9]和張玲[12]在蘋果果樹中施用FA后也發(fā)現(xiàn)果實(shí)中有相似結(jié)果。另外，整個(gè)血橙成熟過程中果糖、葡萄糖積累變化量明顯高于蔗糖，表明蔗糖在合成的同時(shí)也在分解[22]?？扇苄蕴鞘欠磻?yīng)甜度的適宜指標(biāo)，其含量增加可提升血橙甜度和口感[23]。

2.4 FA處理對(duì)血橙蔗糖代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

蔗糖代謝是柑橘糖積累的重要過程[21]，主要由蔗糖合成酶(sucrose synthase, SS)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)和酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase, AI)等關(guān)鍵酶催化[18]。蔗糖合成與分解受SS可逆調(diào)控[21]。蔗糖經(jīng)轉(zhuǎn)化酶催化水解生成果糖和葡萄糖的反應(yīng)不可逆[22]。由圖5可知，花后243、261、276、293、324 d，F(xiàn)A組AI表達(dá)量顯著高于CK組。FA處理對(duì)血橙成熟過程中SS、SPS的表達(dá)水平無明顯促進(jìn)作用，而蔗糖含量卻顯著增加。邱文偉等[24]發(fā)現(xiàn)除了糖代謝酶的成分與活力外，韌皮部后運(yùn)輸是葉源光合同化產(chǎn)物進(jìn)入汁囊的限速階段，跨膜運(yùn)輸是果實(shí)細(xì)胞糖分積累的控制點(diǎn)。綜合分析認(rèn)為，F(xiàn)A處理可能通過激活A(yù)I表達(dá)來加快蔗糖水解，產(chǎn)生的蔗糖濃度梯度為蔗糖跨膜運(yùn)輸提供了動(dòng)力[25]，加快了韌皮部后運(yùn)輸速率及跨膜運(yùn)輸能力，以此來增加果實(shí)細(xì)胞中可溶性糖總量的積累。

A-總糖；B-蔗糖；C-果糖；D-葡萄糖圖4 黃腐酸處理對(duì)血橙成熟過程中可溶性糖含量的影響Fig.4 Effects of preharvest application of fulvic acid on soluble sugar content in maturing Tarocco blood oranges

A～E-基因分別為AI、SS1、SS2、SPS1、SPS2圖5 黃腐酸處理對(duì)血橙成熟過程中蔗糖代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of preharvest application of fulvic acid on transcription levels of sucrose metabolism related genes in maturing Tarocco blood oranges

2.5 FA處理對(duì)血橙果肉有機(jī)酸含量的影響

由圖6可知，血橙成熟過程中，F(xiàn)A組和CK組果實(shí)總酸、檸檬酸、抗壞血酸、蘋果酸含量基本呈下調(diào)趨勢(shì)，且2組果實(shí)總酸、檸檬酸含量無顯著差異。YAO等[26]也發(fā)現(xiàn)果實(shí)成熟后期檸檬酸含量降低，可能與參與三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)為細(xì)胞供能、氨基酸代謝[26]以及γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)支路[27]等有關(guān)?；ê?76、324 d，F(xiàn)A組抗壞血酸含量顯著高于CK組，其他時(shí)期無顯著差異?；ê?24 d，F(xiàn)A組蘋果酸含量顯著高于CK組，其他時(shí)期無顯著差異。由于檸檬酸是柑橘中主要的有機(jī)酸，所以認(rèn)為FA處理對(duì)血橙成熟過程中有機(jī)酸含量的影響不顯著。

A-總酸；B-檸檬酸；C-蘋果酸；D-抗壞血酸圖6 黃腐酸處理對(duì)血橙成熟過程中有機(jī)酸含量的影響Fig.6 Effects of preharvest application of fulvic acid on organic acid content in maturing Tarocco blood oranges

2.6 FA處理對(duì)血橙檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

檸檬酸是柑橘中主要的有機(jī)酸，由乙酰輔酶A與草酰乙酸在線粒體檸檬酸合成酶(citrate synthase，CS)的催化下縮合合成，通過TCA循環(huán)催化，主要儲(chǔ)存在液泡中[28-29]。檸檬酸的降解主要由烏頭酸酶(aconitase，AC)、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)等催化[28]。由圖7可知，在花后243～261 d，F(xiàn)A處理抑制了CS、AC表達(dá)，在花后309 d，F(xiàn)A誘導(dǎo)CS、AC表達(dá)上調(diào)。FA組IDH表達(dá)量在花后243、261、293 d顯著低于CK組，在花后324 d，F(xiàn)A組IDH表達(dá)量顯著高于CK組?？偟膩碚f，F(xiàn)A處理后CS、AC、IDH調(diào)控檸檬酸積累的作用不大。

A～C-基因分別為CS、AC、IDH′圖7 黃腐酸處理對(duì)血橙成熟過程中檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.7 Effects of preharvest application of fulvic acid on transcription levels of citric acid metabolism related genes in maturing Tarocco blood oranges

3 結(jié)論

本研究通過轉(zhuǎn)色期后(花后230 d)葉面噴施FA，顯著提高了血橙成熟過程中總糖、果糖、葡萄糖、蔗糖的含量，可溶性糖積累與AI表達(dá)水平相關(guān)。FA處理對(duì)總酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸含量的影響不顯著，CS、AC、IDH調(diào)控檸檬酸積累的作用不大。糖是評(píng)價(jià)柑橘果實(shí)風(fēng)味和整體品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是合成花色苷的原料[19]，不僅通過糖酵解連接莽草酸途徑來影響花色苷代謝[20]，還作為信號(hào)分子調(diào)控花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)[7]。因此，F(xiàn)A可能通過提高血橙果實(shí)中的蔗糖、葡萄糖、果糖含量使總糖含量增大，進(jìn)而使果實(shí)中合成花色苷的底物增多，或是通過提高血橙中可溶性糖的含量激活了花色苷合成相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)4CL、CHS、DFR、ANS、UFGT、GST表達(dá)上調(diào)從而使血橙中花色苷含量增加。

總之，葉面噴施FA提高了血橙成熟過程中花色苷和糖的積累，促進(jìn)血橙增糖著色，對(duì)酸積累也無不利影響，其中AI、4CL、CHS、DFR、ANS、UFGT、GST是調(diào)控花色苷和糖積累的關(guān)鍵基因。本研究闡釋了FA對(duì)血橙成熟過程中花色苷和糖酸積累的影響及相關(guān)代謝基因的表達(dá)特征，為進(jìn)一步改善血橙品質(zhì)提供理論依據(jù)。