凌利，鐘先華，李章勇

重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院，重慶 400065

前言

凝血功能疾病最典型的是A類血友病，在人群中的發(fā)病率為（5～10）/10萬人。本病發(fā)病癥狀為身體出現(xiàn)異常出血不止，重癥患者直接面臨生命危險［1］。所以，術(shù)前凝血功能異常的診斷尤為重要，能避免患者在術(shù)中、術(shù)后因出血不止，而出現(xiàn)危及生命的緊急狀況，為手術(shù)的順利完成保駕護(hù)航［2］。血凝過程中的凝血指數(shù)表征凝血功能是否正常，凝血指數(shù)過高或過低，患者將出現(xiàn)大面積血凝塊或出血不止等凝血功能異常的病況［3］。因此，對凝血功能疾病的診斷而言，血細(xì)胞凝集過程的監(jiān)測是一種良好的解決方案。血細(xì)胞凝集是一項復(fù)雜和動態(tài)變化的生理現(xiàn)象［4］。目前，對于血凝現(xiàn)象的檢測主要有血凝板法［5］、玻片法［6］、比色池法［7］等傳統(tǒng)實驗法，根據(jù)實驗最終凝集效果來鑒別血凝程度，對結(jié)果屬于定性分析，靈敏度較低，過程性研究不足。

針對血凝過程的監(jiān)測現(xiàn)狀，Xu 等［8］采用光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)，監(jiān)測血流狀態(tài)下的凝血過程，探究流速、血細(xì)胞壓積等血液性質(zhì)的變化情況，有一定的監(jiān)測效果。但結(jié)果準(zhǔn)確度容易受流速快慢、管徑大小、血液濃度等因素的影響。張譯之等［9］利用分子生物學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)肝臟凝血過程中凝血因子活性降低，天然抗凝劑減少。這種方法監(jiān)測成本高、時間周期長，且缺乏持續(xù)的監(jiān)測數(shù)據(jù)來提供有力的判別依據(jù)。

據(jù)已有研究證明，血液與植物凝集素在一定濃度下，能夠產(chǎn)生顯著的血細(xì)胞凝集現(xiàn)象［10］。凝集素參與的血凝與抗原-抗體作用產(chǎn)生的血凝雖然表觀效果一致，但本質(zhì)機理有所差異［11］。本研究選用的是植物凝集素中最具代表性的豆科類凝集素，即刀豆凝集素A（Concanavalin A, 簡稱Con A）［12］。以一定濃度的Con A溶液與家兔血細(xì)胞相互作用，產(chǎn)生血細(xì)胞凝集現(xiàn)象，構(gòu)建實驗組。

本研究對血凝過程的監(jiān)測是基于生物阻抗技術(shù)。因生物組織具有高導(dǎo)電性，使得生物阻抗技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，尤其是在血液學(xué)的研究方面。例如兔子血細(xì)胞的阻抗特性研究［13］、阻抗模型測評血液中葡萄糖量［14］和測量大鼠血液的電阻抗譜［15］等課題的研究；且對于復(fù)雜的生物組織而言，例如細(xì)胞懸浮液，生物阻抗技術(shù)可作為一項非損傷性和高效的監(jiān)測方法［16-19］。人體組織的阻抗特性由細(xì)胞內(nèi)液、細(xì)胞外液、細(xì)胞膜通透性以及環(huán)境等因素共同決定［20］，生物阻抗作為一項重要的生理參數(shù)，反映了豐富的醫(yī)學(xué)信息。因此，對血細(xì)胞凝集過程進(jìn)行持續(xù)的阻抗特性監(jiān)測，可獲取血凝過程中阻抗特征參數(shù)的變化規(guī)律，有助于為凝血功能異常等相關(guān)疾病的診斷提供判別依據(jù)。

1 實驗材料

2.0～2.5 kg 健康成年實驗兔，Con A 凍干粉，0.01 mol/L、pH 7.2～7.4 磷酸鹽緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline,簡稱PBS 溶液），0.55×19 mm 一次性靜脈采血針，一次性真空采血管，0.9%NaCl 溶液，96滅菌孔板，湘儀臺式高速離心機（TG16-WS），Agilent 4294A 精密阻抗分析儀，Agilent 16092 夾具，Agilent 42942A適配器。

試劑的配制：在兔子耳靜脈處采集全血4 mL，收集在枸櫞酸鈉（1：9）的抗凝管內(nèi)。將全血以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，共3 次；每次離心完后用0.9%的生理鹽水洗滌，最終取得下層壓積血細(xì)胞；最后用PBS溶液將Con A 凍干粉配制成濃度為10、20、30 mg/mL的Con A溶液。

2 方法

本研究對血液與刀豆凝集素作用過程的阻抗特性研究，整體技術(shù)方案如圖1所示。首先將各實驗組對應(yīng)的試劑，分別加入96孔板的單個反應(yīng)孔內(nèi)；然后經(jīng)阻抗監(jiān)測平臺，可采集和存儲多種形式的復(fù)阻抗數(shù)據(jù)，主要分為以頻率和反應(yīng)時間為橫軸的兩類；通過數(shù)據(jù)分析，可得出相應(yīng)的特征頻率和時序增量，從而實現(xiàn)血液與刀豆凝集素作用過程的阻抗監(jiān)測。

圖1 技術(shù)方案示意圖Figure 1 Schematic diagram of technical solution

2.1 實驗組

遵循等細(xì)胞比容原則，構(gòu)建如表1所示的實驗組。其中A 組為空白對照組，B、C、D 為血凝實驗組。因家兔血常規(guī)指標(biāo)中血細(xì)胞比容的正常值約為50%［21］，所以每組中血細(xì)胞比容設(shè)定為50%，每種試劑對應(yīng)用量為60 μL，各組試劑總體積為120 μL，每組總體積介于96 滅菌孔板單孔容積的1/3～2/3 范圍內(nèi)。

表1 實驗組試劑組成Table 1 Reagent composition of experimental group

2.2 阻抗監(jiān)測平臺

阻抗監(jiān)測平臺的組成：由Agilent 16092A 測試夾具、42942A 端口適配器、4294A 精密阻抗分析儀依次連接組成，復(fù)阻抗數(shù)據(jù)通過本地傳輸存儲到計算機內(nèi)。因銀的導(dǎo)電性能好，穩(wěn)定性僅次于金、鉑，在緩沖液內(nèi)不易被腐蝕，所以本方法采用規(guī)格為直徑0.5 mm，長度5 cm，純度99.99%的兩根等長的銀導(dǎo)線連接反應(yīng)孔與測試夾具。導(dǎo)線一端固定在夾具上，另一端平行緊貼于反應(yīng)孔內(nèi)壁，形成電容型電極。

阻抗監(jiān)測步驟：（1）前期準(zhǔn)備，預(yù)熱42942A 精密阻抗分析儀30 min 后，進(jìn)行儀器開路、短路校準(zhǔn)，依次選擇Cal-Fixture compen-open/short 功能鍵，對夾具進(jìn)行補償。（2）參數(shù)的設(shè)置：Meas 鍵選擇參數(shù)類型為幅模量-相位角；Format 鍵選擇曲線顯示類型為LIN線性；Scale Ref 鍵設(shè)置為Autoscale 自動曲線刻度，將曲線顯示最佳化；選擇Display-spilit on OFF，分開顯示曲線A、B；Seep 鍵設(shè)置掃描模式為Freq 頻率掃描；電場頻率范圍為0.55～110.00 MHz。（3）固定夾具，加入實驗試劑，記錄與存儲數(shù)據(jù)。

2.3 特征頻率

家兔血細(xì)胞具有兩個特征頻率，是血液細(xì)胞對交流電場響應(yīng)在阻抗譜的標(biāo)志性參數(shù)。一個特征頻率可在相-頻曲線中，相位峰值處，反映細(xì)胞膜相與細(xì)胞內(nèi)相的界面對交流電場產(chǎn)生的弛豫過程的頻率響應(yīng)特性，本研究稱為特征頻率f1；另一個征頻率可在虛部增量-實部增量曲線中，虛部增量峰值的頻率點處，反映的是細(xì)胞外相與細(xì)胞膜相的界面對交流電場產(chǎn)生的頻率響應(yīng)特性，本研究稱為特征頻率f2［22-23］。

3 結(jié)果與分析

3.1 頻率特性

圖2是A、B、C、D 4 個實驗組的頻率特性圖，展現(xiàn)了隨著交流電場頻率f從低頻變?yōu)楦哳l的過程中，復(fù)阻抗的幅模量 ||Z、相位角θ、實部R、虛部X這4 個特征參數(shù)的變化規(guī)律。在圖2a和圖2b中，隨著f的增加，幅模量 ||Z和實部R的曲線總體呈現(xiàn)下降趨勢。在f<10 MHz 范圍，| |Z和R的曲線下降比較陡，差值較大；在f>10 MHz范圍，| |Z和R值均緩慢減小，并逐漸趨于平緩。在圖2c 中隨著f的增加，相位角θ曲線呈現(xiàn)先增加至峰值后，再逐漸減小的變化規(guī)律。相位角峰值處的頻率值已在圖2c 中標(biāo)明，該頻率為兔血細(xì)胞的特征頻率f1。從圖2可發(fā)現(xiàn)，血凝實驗組B、C、D 組的f1均比空白對照組A 組的f1值大。在圖2d中隨著f的增加，虛部X 值曲線呈現(xiàn)先迅速增加至峰值后，逐漸平緩。

圖2 實驗組頻率特性圖Figure 2 Frequency characteristic diagram of experimental group

圖3中橫軸為實部增量△R的對數(shù)值，縱軸是虛部增量△X?！鱎=R-R0.55，R0.55代表在0.55 MHz 下的復(fù)阻抗實部值；△X=X-X110，X110代表在110 MHz下的復(fù)阻抗虛部值。圖3中，隨著實部增量的增加，虛部增量曲線剛開始處于平緩狀態(tài)，到達(dá)峰值后陡然下降。虛部增量的峰值處頻率值已在圖3中標(biāo)明，該頻率為兔血細(xì)胞的特征頻率f2，可發(fā)現(xiàn)血凝實驗組B、C、D組的f2點均在對照組A組的左側(cè)。

圖3 虛部增量-實部增量對數(shù)圖Figure 3 Graph of imaginary increment-logarithm of real increment

3.2 時序復(fù)阻抗數(shù)據(jù)

隨著實驗組反應(yīng)開始至30 min，每間隔0.5 min記錄一次復(fù)阻抗數(shù)據(jù)。圖4為時序復(fù)阻抗曲線圖，血凝實驗組與空白對照組的曲線走勢相反。其中圖4幅模量-時間圖為復(fù)阻抗幅模量 |Z|（'為區(qū)分與圖2中的幅模量|Z）|隨時間的變化曲線。隨反應(yīng)時間的增加，空白對照組A組的 |Z|'逐漸增加，而血凝實驗組B、C、D組的 |Z|'卻逐漸減?。磺译S著Con A濃度的增大，|Z|'越低。圖4相位角-時間圖為復(fù)阻抗相位角θ（'為區(qū)分與圖2中的相位角θ）隨時間的變化曲線。隨反應(yīng)時間的增加，空白對照組A組的逐漸降低，而血凝實驗組B、C、D組的θ'卻逐漸增加；且隨著Con A濃度的增大，θ'越低。

圖4 時序復(fù)阻抗曲線圖Figure 4 Graph of complex impedance over time

圖5為時序復(fù)阻抗增量圖。其中，圖5a的縱坐標(biāo)是指時序幅模量增量△|Z|'，△|Z|'= |Z|'- |Z|'0，|Z|'0代表在反應(yīng)時間為0 min處的時序幅模量值。隨反應(yīng)時間的增加，空白對照組A 組的△|Z|'明顯增加。而血凝實驗組B、C、D 組的△|Z|'卻逐漸減小且變化規(guī)律相似。圖5b的縱坐標(biāo)是指時序相位角增量△θ'，△θ'=θ'-θ'0，同理θ'0代表在反應(yīng)時間為0 min 處的時序相位角值。隨反應(yīng)時間的增加，空白對照組A組的△θ'明顯減小，而血凝實驗組B、C、D 組的△θ'卻逐漸增大。

圖5 時序復(fù)阻抗增量圖Figure 5 Incremental graph of complex impedance over time

3.3 阻抗特征參數(shù)

經(jīng)過兩次重復(fù)試驗，本研究采集的阻抗特征參數(shù)如表2所示。家兔血細(xì)胞與Con A 作用后，特征頻率從19.80 MHz 變?yōu)椋?7.31±2.19）MHz；且時序幅模量的增量均值從15.56 Ω 降低到（-18.27±1.29）Ω，時序相位角的增量均值從-2.56°提升到3.86°±0.38°，變化趨勢相異，發(fā)生了明顯的改變。此外，|Z|、θ、、等參數(shù)在Con A 的作用下與對照組也存在著一定的差異，但不明顯。

表2 阻抗特征參數(shù)Table 2 Impedance characteristic parameters

4 討論

4.1 阻抗監(jiān)測方法

通過本研究所設(shè)計的阻抗監(jiān)測方法，發(fā)現(xiàn)家兔血細(xì)胞懸浮液的頻率特性呈現(xiàn)一定規(guī)律：隨著頻率的增加，每個實驗組中，家兔血細(xì)胞懸浮液的幅模量和實部值都逐漸降低，而相位角和虛部值都逐漸升高，如圖2所示。本研究所得的上述頻率特性變化規(guī)律，與現(xiàn)有研究如翟琳等［18］和王力等［22］對家兔全血細(xì)胞的阻抗研究結(jié)果所呈現(xiàn)的規(guī)律總體一致。這說明本研究的阻抗監(jiān)測方法具有一定的可靠性。

但本研究空白對照組所得的家兔血細(xì)胞特征頻率為19.80 MHz，而翟琳等［18］和王力等［22］所得家兔全血特征頻率為2.58 和5.21 MHz，存在偏差。一方面是因為研究對象具有差異。翟琳等［18］和王力等［22］的研究對象為32.17%比容的家兔全血細(xì)胞，而本研究對象為50%比容家兔血細(xì)胞，且本研究中加入了刀豆凝集素，而非自然狀態(tài)的血液凝集或者血清-抗原抗體結(jié)合產(chǎn)生的血凝。另一方面，通過對本研究的阻抗監(jiān)測方法進(jìn)行系統(tǒng)性分析，可能是由阻抗電極的材質(zhì)不同所導(dǎo)致的。在阻抗特性研究中，翟琳等［18］和王力等［22］選用鉑片構(gòu)建的平行板電容器型電極；而本研究選用的是純銀材質(zhì)的電極，結(jié)合安捷倫16092A 夾具尺寸和穩(wěn)定性，最終選用直徑為0.5 mm的純銀電極。由于鉑的價格昂貴，而銀的價格相對適宜，且銀的穩(wěn)定性僅次于鉑，銀的導(dǎo)電性能比絕大多數(shù)金屬都穩(wěn)定，在保證良好的監(jiān)測效果下，銀電極的性價比更高?，F(xiàn)有研究的方法值得借鑒，但本研究也為家兔血液阻抗特性的研究提供一種新的且可靠的阻抗監(jiān)測方法。

4.2 阻抗特征參數(shù)的頻率特性

從空白對照組A 到實驗組B、C、D 組，刀豆凝集的濃度從無到有依次變大。由圖2可知，在頻域內(nèi)刀豆凝集素的濃度越高，家兔血細(xì)胞的復(fù)阻抗幅模量和實部值越低，呈負(fù)相關(guān)。這表征刀豆凝集素的濃度是影響家兔血液阻抗特性的重要因素之一。觀察圖2和圖3中曲線的峰值，可得家兔血細(xì)胞懸浮液的特征頻率規(guī)律，即含有刀豆凝集素的實驗組均比空白對照組的特征頻率更大。這說明在刀豆凝集素的作用下，家兔血細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)相和細(xì)胞外相的界面對交流電場所產(chǎn)生的頻率響應(yīng)發(fā)生了改變，使得家兔血細(xì)胞膜的阻抗特征頻率變大，且實驗組B、C、D組的特征頻率也存在細(xì)微差異，這表明在家兔血細(xì)胞比容和試劑用量相等的情況下，刀豆凝集素的濃度也會影響家兔血細(xì)胞的特征頻率。

4.3 阻抗特征參數(shù)的時序變化

阻抗監(jiān)測結(jié)果顯示，隨反應(yīng)時間的增加，含有刀豆凝集素的實驗組B、C、D 組，它們的復(fù)阻抗幅模量逐漸降低，相位角逐漸增大，而空白對照組A 則呈相反變化方向，如圖4所示。根據(jù)生物阻抗等效電路模型理論：若被測生物組織的容抗增加，其他變量視為不變的情況下，則復(fù)阻抗幅模量會隨之減小［24］。由此可知，刀豆凝集素逐漸改變了血細(xì)胞懸浮液原有的空間分布狀態(tài)，血細(xì)胞發(fā)生了凝集現(xiàn)象，出現(xiàn)血細(xì)胞“抱團(tuán)”，使得血細(xì)胞間距減小，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜電容性增強，整體的容抗增加，最終導(dǎo)致復(fù)阻抗幅模量降低；而沒有刀豆凝集素參與的空白對照A 組中，血細(xì)胞懸浮液因重力作用，血細(xì)胞逐漸下沉，變化過程與實驗組形成差異，在時域內(nèi)呈現(xiàn)阻抗特征參數(shù)不同的變化規(guī)律。此外，刀豆凝集素的加入使得血細(xì)胞的阻抗相位角增大，這表征血細(xì)胞的空間分布狀態(tài)改變后，交流電路的電壓超前電流的相位值也會有所影響，但具體改變機制需進(jìn)一步探究。

將時序復(fù)阻抗數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)初始值相比，得到了時序復(fù)阻抗的增量變化規(guī)律，如圖5所示。在實驗開始的0～10 min，實驗組的復(fù)阻抗幅模量增量曲和相位角增量的曲線斜率，明顯比10～30 min 更大，10 min后實驗組曲線趨于平緩。這表征刀豆凝集素與家兔血細(xì)胞的相互作用，在剛開始的前10 min 內(nèi)比較劇烈，血細(xì)胞在懸浮液中的空間分布狀態(tài)改變更加迅速且復(fù)雜；而10～30 min，實驗組特征參數(shù)的時序增量趨于衡定，血細(xì)胞的空間分布狀態(tài)逐漸穩(wěn)定，血液與刀豆凝集素作用基本結(jié)束。而空白對照組A 的幅模量增量還在逐漸上升，相位增量在逐漸下降，這說明血細(xì)胞懸浮液的自然沉降并聚集在底部的過程仍在繼續(xù)，速度較緩慢。因此，較血細(xì)胞自然沉降過程，刀豆凝集素可加速改變家兔血細(xì)胞懸浮液的空間分布狀態(tài)，減少血細(xì)胞凝集的時間，提升血凝速度。

與傳統(tǒng)血凝實驗法相比，本研究對刀豆凝集素參與的血凝過程進(jìn)行了持續(xù)性的阻抗監(jiān)測，不局限于對最終凝集狀態(tài)的判別，更加客觀地揭示了血凝動態(tài)作用過程中家兔血細(xì)胞特征參數(shù)的時序變化規(guī)律，這有助于為凝血功能疾病的檢測提供判別依據(jù)。

5 結(jié)論

本研究提出一種血液與刀豆凝集素作用過程的阻抗監(jiān)測方法，發(fā)現(xiàn)在50%比容的家兔血細(xì)胞懸浮液中，分別加入10、20、30 mg/mL 濃度的Con A 后，家兔血細(xì)胞的復(fù)阻抗特征參數(shù)具有明顯差異：（1）家兔血細(xì)胞的特征頻率從19.80 MHz 提升至（27.31±2.19）MHz；（2）在27.31 MHz 特征頻率下，血凝實驗組的時序復(fù)阻抗幅模量呈下降趨勢，時序相位角呈上升趨勢，增量均值分別為（-18.27±1.29）Ω、3.86°±0.38°，與對照組呈相反變化方向。本研究表明，在家兔血細(xì)胞與刀豆凝集素相互作用，產(chǎn)生血細(xì)胞凝集的過程中，復(fù)阻抗幅模量減小，相位角增大，凝集速度加快。這可作為一條有力的判別依據(jù)來區(qū)分血細(xì)胞是否為凝集狀態(tài)。在進(jìn)一步的研究中，將探究不同人群血細(xì)胞凝集過程的阻抗特性，為凝血功能健康檢測提供新的解決方案。