丁曉妍，崔明全，李 霆，朱馨樂(lè)，張純萍，程 敏，趙 琪，王鶴佳

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

我國(guó)是畜牧業(yè)大國(guó)，涉及動(dòng)物種類繁多，養(yǎng)殖基數(shù)大，需要獸用抗菌藥物為動(dòng)物健康和食品安全保駕護(hù)航?？墒请S著抗菌藥物的廣泛使用，“細(xì)菌耐藥性出現(xiàn)→過(guò)量使用或?yàn)E用抗菌藥物→耐藥譜或耐藥水平加重”的惡性循環(huán)仍在繼續(xù)[1]。為了遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性，2018年，我國(guó)開始開展獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)試點(diǎn)，其中，相關(guān)養(yǎng)殖場(chǎng)細(xì)菌流行和耐藥情況備受關(guān)注[2]。大腸桿菌和腸球菌分別被認(rèn)定為革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性耐藥水平指示菌[3]，耐藥性水平指示菌在一定程度上代表了該養(yǎng)殖場(chǎng)的細(xì)菌耐藥水平，是細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)中關(guān)注的重要對(duì)象。目前，我國(guó)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)中細(xì)菌分離鑒定多采用生化和PCR鑒定方法[4]。針對(duì)不同養(yǎng)殖場(chǎng)不同類型的細(xì)菌分別鑒定，程序不一，工作量大，迫切需求高效的細(xì)菌鑒定技術(shù)手段?；诩?xì)菌特異性蛋白圖譜的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)單、高通量、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，可以滿足細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)中細(xì)菌鑒定的需求，而且MALDI-TOF鑒定微生物的方法已經(jīng)成為全球臨床微生物實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離株常規(guī)鑒定的參考方法[5]。MALDI-TOF技術(shù)基本原理為：將微生物樣品與基質(zhì)分別點(diǎn)加在鋼靶上，晾干后形成共結(jié)晶，發(fā)射激光，基質(zhì)吸收激光能量幫助樣品分子電離，經(jīng)過(guò)飛行時(shí)間檢測(cè)器進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，生成質(zhì)譜圖，縱坐標(biāo)為離子峰，橫坐標(biāo)為離子質(zhì)荷比(m/z)[6]。通過(guò)采集2000～20000 kD區(qū)間的微生物蛋白指紋圖譜，掃描每個(gè)物種的特征峰值，與大型數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行匹配，能夠鑒定細(xì)菌種屬[7-8]。本研究通過(guò)選擇MALDI-TOF方法，快速有效地鑒定雞、牛和羊來(lái)源的大腸桿菌和腸球菌臨床分離菌株，開展細(xì)菌耐藥表型檢測(cè)，以期待為臨床細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)工作提供技術(shù)支撐和參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品 分別從五家獸用抗菌藥使用減量化試點(diǎn)(兩家雞場(chǎng)來(lái)自寧夏某養(yǎng)殖場(chǎng)和湖南某養(yǎng)殖場(chǎng)，一家羊場(chǎng)來(lái)自浙江某養(yǎng)殖場(chǎng)，兩家牛場(chǎng)分別來(lái)自寧夏某養(yǎng)牛場(chǎng)和河南某養(yǎng)牛場(chǎng))進(jìn)行抽樣，每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)15份樣品，總共75份樣品。標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸桿菌ATCC25922和糞腸球菌ATCC29212。

1.2 試劑與儀器 運(yùn)送培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、腸球菌顯色培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂(青島海博生物有限公司)；甲酸；乙腈；無(wú)水乙醇；CHCA基質(zhì)溶液；臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：島津公司；VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定儀、濁度儀、革蘭氏陰性鑒定卡(GN)和革蘭氏陽(yáng)性鑒定卡(GP)：梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集與細(xì)菌分離 采集不同養(yǎng)殖場(chǎng)動(dòng)物(雞、牛和羊)糞便、設(shè)施表面和工人鼻腔拭子樣品，立即放入無(wú)菌運(yùn)輸培養(yǎng)基中保存，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

分離純化：將保存在運(yùn)送培養(yǎng)基中的樣品分別在大腸桿菌顯色培養(yǎng)基和腸球菌顯色培養(yǎng)基上劃線，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上的藍(lán)綠色單菌落(疑似大腸桿菌)和腸球菌顯色培養(yǎng)基上的紅色或紫色的單菌落(疑似腸球菌)再次在顯色培養(yǎng)基上劃線進(jìn)行二次純化。

將質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922和腸球菌ATCC29212復(fù)蘇，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上劃線，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.3.2 MALDI-TOF MS 鑒定 樣品前期處理：挑取純化后的疑似單菌落在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。用無(wú)菌接種環(huán)挑取適量樣品于1.5 mL離心管中，加入300 μL純水和900 μL無(wú)水乙醇，混勻，12000 rpm/min，離心2 min，棄去上清；向沉淀中加入50 μL70%甲酸，混勻，再加入50 μL乙腈，混勻，12000 rpm/min，離心2 min，留上清。質(zhì)控菌株ATCC25922的處理同上。

點(diǎn)樣：先在干凈的鋼靶上點(diǎn)1 μL上清，放干后再點(diǎn)2 μL CHCA基質(zhì)溶液，晾干后送入上樣系統(tǒng)。

MALDI-TOF 鑒定：選擇儀器運(yùn)行模式Linear_saramis，設(shè)置掃描范圍2000～20000，激光頻率20；激光能量66，采集譜圖數(shù)Profiles 100，shot 2，Blank 1500，PμLsed Extraction 8330；利用Auto quality自動(dòng)獲得譜圖。設(shè)置好參數(shù)后開始采集質(zhì)控菌株ATCC25922的數(shù)據(jù)，進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)完成后開始進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)采集。

數(shù)據(jù)處理：將導(dǎo)出txt格式的數(shù)據(jù)拷貝到數(shù)據(jù)庫(kù)電腦的鑒定軟件中自動(dòng)讀取數(shù)據(jù)并鑒定。鑒定結(jié)果給出科、屬、種三個(gè)水平。

1.3.3 VITEK 2 生化鑒定 挑取適量的分離純培養(yǎng)的菌株于3 mL的0.45%無(wú)菌鹽水中混勻，用VITEK 2 比濁儀配置相當(dāng)于0.5～0.63麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?。將懸浮液管及GN、GP卡置于載卡臺(tái)上，連接菌液管和鑒定卡，放入儀器中，按照VITEK全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)操作流程進(jìn)行樣品鑒定。

1.3.4 細(xì)菌耐藥表型檢測(cè) 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定大腸桿菌和腸球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性，測(cè)定大腸桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、四環(huán)素、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、頭孢他啶、氧氟沙星、美羅培南、黏菌素的耐藥表型，腸球菌對(duì)青霉素、紅霉素、萬(wàn)古霉素、苯唑西林、多西環(huán)素、利奈唑胺的耐藥表型。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行結(jié)果判定。大腸桿菌和腸球菌分別用ATCC25922和ATCC29212進(jìn)行質(zhì)控。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌鑒定結(jié)果 針對(duì)湖南、寧夏、河南和浙江地區(qū)進(jìn)行樣品采集的75份樣品(雞養(yǎng)殖場(chǎng)采集30份，牛養(yǎng)殖場(chǎng)30份，羊養(yǎng)殖場(chǎng)15份樣品)，將棉簽拭子樣本分別在大腸桿菌顯色平板和腸球菌顯色平板劃線過(guò)夜培養(yǎng)。大腸桿菌典型菌落為藍(lán)色，邊緣整齊，表面濕潤(rùn)的圓形菌落，腸球菌典型菌落為紅色至紫色，邊緣整齊，表面濕潤(rùn)的針尖樣菌落。針對(duì)上述疑似大腸桿菌或腸球菌進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定，大腸桿菌分離率為41.33%(31/75)，腸球菌分離率為45.33%(34/75)(糞腸球菌14株，屎腸球菌18株、海氏腸球菌2株)(圖1和表1)。

圖1 樣品的MALDI-TOF MS譜圖Fig 1 MALDI-TOF MS spectrum of the samples

表1 不同動(dòng)物來(lái)源的細(xì)菌分離情況Tab 1 Isolation of bacteria from different animal sources

VITEK生化鑒定結(jié)果中，31株被鑒定為大腸桿菌，34株被鑒定為腸球菌，結(jié)果與MALDI-TOF MS結(jié)果一致。

2.2 細(xì)菌耐藥性結(jié)果

2.2.1 大腸桿菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，三種動(dòng)物來(lái)源分離獲得的大腸桿菌均對(duì)四環(huán)素高度耐藥(100%)；雞、牛和羊源大腸桿菌對(duì)氨芐西林(91.67%、27.27%、75%)、阿莫西林/克拉維酸(58%、0、37.5%)、磺胺異惡唑(83.33%、18.18%、75%)表現(xiàn)出不同程度耐藥性，而且雞源大腸桿菌的10種抗菌藥物中的5種藥物(阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、四環(huán)素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明)的MIC50比?；蜓蛟吹拇竽c桿菌高。雞源、牛源和羊源大腸桿菌多重耐藥率分別為90.9%、36.36%和87.5%，雞和羊源大腸桿菌表現(xiàn)五重耐藥性(β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類抗、喹諾酮類)，牛源大腸桿菌表現(xiàn)四重耐藥性(β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類抗、喹諾酮類)。由此可見，雞源大腸桿菌耐藥情況最為嚴(yán)重。

圖2 大腸桿菌的生化反應(yīng)結(jié)果Fig 2 The resμLt of the biochemical reaction of E. coli

圖3 腸球菌的生化反應(yīng)結(jié)果(a:糞腸球菌；b:屎腸球菌；c:海氏腸球菌)Fig 3 The resμLt of the biochemical reaction of Enterococcus

圖4 不同動(dòng)物來(lái)源的大腸桿菌耐藥情況Fig 4 Resistance of E. coli from different animal sources

2.2.2 腸球菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果 從藥敏試驗(yàn)結(jié)果得出，雞源、牛源和羊源腸球菌對(duì)青霉素(3.45%、0、0)、紅霉素(55.17%、22.73%、28.57%)、多西環(huán)素(51.72%、4.55%、9.09%)、苯唑西林(62.07%、36.36%、9.09%)和利奈唑胺(27.59%、0、21.43%)表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，雞源腸球菌對(duì)上述5種抗菌藥物的耐藥率普遍高于牛和羊源腸球菌的耐藥率。而且雞源腸球菌的6種藥物中的3種抗菌藥物(紅霉素、多西環(huán)素、利奈唑胺)的MIC50比?；蜓蛟吹哪c球菌高。三種動(dòng)物來(lái)源均表現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。其中，雞源腸球菌多重耐藥率為100%，對(duì)β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯和四環(huán)素三類抗菌藥物耐藥，牛源和羊源腸球菌多重耐藥率分別為77.78%和66.67%，均對(duì)大環(huán)內(nèi)酯、四環(huán)素和β-內(nèi)酰胺類三類抗菌藥物耐藥。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示雞源腸球菌耐藥性最為嚴(yán)重。

圖5 不同動(dòng)物來(lái)源的腸球菌耐藥情況Fig 5 Resistance of Enterococcus from different animal sources

3 討 論

本研究采用MALDI-TOF MS鑒定細(xì)菌的方法，減少了不同細(xì)菌不同的檢測(cè)程序和步驟，高效地實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同動(dòng)物源的大腸桿菌和腸球菌的臨床鑒定。目前，MALDI-TOF MS作為快速鑒定的熱點(diǎn)應(yīng)用技術(shù)被廣泛采納應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外臨床微生物臨床檢測(cè)研究。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委發(fā)布了《GB/T 33682-2017基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則》，美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)發(fā)布《Methods for the Identification of CμLtured Microorganisms Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry》，表明MALDI-TOF MS已經(jīng)成為微生物菌種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法。利用已知菌種建立數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)獲得蛋白指紋圖譜，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考圖譜對(duì)比后得到鑒定結(jié)果，這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用到臨床上微生物的物種水平鑒定。Rychert等[10]對(duì)1146份革蘭氏陽(yáng)性菌的樣品進(jìn)行處理，經(jīng)MALDI-TOF鑒定出1063份樣品，種水平準(zhǔn)確率為92.8%，屬水平準(zhǔn)確率達(dá)95.5%；Faron等[11]采集2263份革蘭氏陰性菌進(jìn)行MALDI-TOF鑒定，結(jié)果表明種屬水平分別為98.2%、99.8%。這說(shuō)明MALDI-TOF MS在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌中都具有很高的準(zhǔn)確性和可信性。Koziel等[12]結(jié)合MALDI-TOF和16S rRNA鑒定出獼猴糞便中存在CIT 045(T)解脲彎曲桿菌。MALDI-TOF MS 也可以作為溯源分析手段，Jadhav等[13]將MALDI-TOF MS作為檢測(cè)食品和食品加工環(huán)境中的單核細(xì)胞增生性李斯特菌的鑒定和溯源手段，溯源結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)脈沖電場(chǎng)技術(shù)具有良好的一致性。除此之外，MALDI-TOF MS也可以直接被應(yīng)用于臨床耐藥菌株相關(guān)的特征峰鑒定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)耐藥菌株的直接檢測(cè)。Wang等[14]利用耐藥相關(guān)特征峰值的不同來(lái)檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，通過(guò)直接尋找MRSA與MSSA對(duì)比的特征峰(m/z891、1140、1165、1229、2127)，確定其為MRSA。Lau等[15]利用MALDI-TOF MS分析耐藥性相關(guān)質(zhì)粒(攜帶碳青霉烯酶基因blaKPC的pKpQIL質(zhì)粒)，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定表征了與pKpQIL質(zhì)粒的基因產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的m/z11109 Da峰，實(shí)現(xiàn)耐藥菌的快速鑒定。

值得注意的是，本研究中雞源大腸桿菌和腸球菌對(duì)多數(shù)藥物耐藥程度明顯高于牛和羊場(chǎng)分離的大腸桿菌和腸球菌相應(yīng)藥物的耐藥程度，提示不同動(dòng)物來(lái)源的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性有所不同。其他相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中也有類似的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。唐標(biāo)等[16]對(duì)雞、鴨、豬源大腸桿菌耐藥性調(diào)查結(jié)果顯示，雞源大腸桿菌的耐藥率高于鴨和豬源；Ibekwe等[17]對(duì)不同動(dòng)物源產(chǎn)ESBL的大腸桿菌調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBL的大腸桿菌在不同動(dòng)物源中分布廣泛，但豬和奶牛糞便中檢測(cè)到的ESBL菌數(shù)量明顯高于其他動(dòng)物；王熙楚等[18]對(duì)不同動(dòng)物來(lái)源的腸球菌進(jìn)行耐藥性分析，研究表明雞源腸球菌耐藥性較其他動(dòng)物來(lái)源更為嚴(yán)重。其中，雞源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素和氨芐西林高耐藥率現(xiàn)象與我國(guó)不同區(qū)域雞源大腸桿菌耐藥表型結(jié)果相一致[19]。同時(shí)也相似于韓國(guó)地區(qū)大腸桿菌對(duì)四環(huán)素和氨芐西林的高耐藥性率[20]。雞源腸球菌對(duì)多西環(huán)素和紅霉素的高耐藥率現(xiàn)象與我國(guó)其他地區(qū)腸球菌的高耐藥率也相一致[21-22]。

綜上所述，為了有效地控制細(xì)菌耐藥性，持續(xù)地針對(duì)不同地區(qū)不同動(dòng)物來(lái)源的大批量細(xì)菌鑒定工作將是常態(tài)化技術(shù)工作，高效的細(xì)菌鑒定技術(shù)MALDI-TOF MS可以提高監(jiān)測(cè)效率，值得在動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)領(lǐng)域推廣應(yīng)用。與此同時(shí)，應(yīng)該密切關(guān)注不同動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性不同的現(xiàn)象，利用高效檢測(cè)技術(shù)，探索不同動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性不同的問(wèn)題原因。