張 娜，陳 靜, 張培訓(xùn),張秋娜,楊彥超, 辛 雪

(1.保定冀中藥業(yè)有限公司，河北保定 071000； 2.河北省中獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071500；3.華譜科儀(大連)科技有限公司，遼寧大連 116000)

隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部減抗政策的實施，中獸藥制劑因其低毒副作用、不產(chǎn)生耐藥性更為廣大養(yǎng)殖戶所青睞，但同時伴隨著國家監(jiān)管力度的增加[1-5]，在市場抽檢過程中檢出多種非法添加、殘留藥物，涉及磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、酰胺醇類、呋喃類等，使得養(yǎng)殖集團不得不從源頭加強食品動物的用藥安全把控，要求獸藥生產(chǎn)企業(yè)按照動物源性產(chǎn)品中禁限用獸藥的檢測限來提供產(chǎn)品的檢測結(jié)果，這對獸藥生產(chǎn)企業(yè)來說是嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

但是從目前已頒布的多項中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告及國家標(biāo)準(zhǔn)來看，對中獸藥制劑中禁限用獸藥的檢測方法多為HPLC-PDA法，檢測限難以滿足養(yǎng)殖集團的用藥需求，同時我們也發(fā)現(xiàn)公告及文獻(xiàn)報道[6-10]中涉及的獸藥制劑多集中于中獸藥注射液、固體散劑、口服液劑型，前處理方法多為提取后直接稀釋進樣，這直接導(dǎo)致了檢測的靈敏度降低，同時易污染設(shè)備。為降低中獸藥中復(fù)雜的基質(zhì)干擾，提高檢測限，宋軍、馬東杰等[11-12]采用PRIME HLB對基質(zhì)進行凈化，檢測中獸藥中硝基咪唑類和硝基呋喃類藥物，使檢出限和定量限低至10～25 μg/kg，但對于養(yǎng)殖集團關(guān)切的多種禁限用獸藥的檢測未有提及。

因此，建立一種快速、簡便、靈敏、可靠、可同時檢測中獸藥中多類非法添加或藥物殘留的禁限用獸藥的檢測方法十分必要。本實驗室首次將親水親油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱用于麻杏石甘口服液的前處理，經(jīng)考察17種禁限用獸藥的回收率均符合要求。其中喹乙醇的檢出限為10 ng/mL、定量限為25 μg/mL，剩余16種藥物的檢出限均低至5 ng/mL、定量限為10 ng/mL，極大保障了中獸藥產(chǎn)品用藥安全，同時也為中獸藥制劑中常見非特定添加藥物及殘留的快速判定提供了可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 UPLC Acquity -XEVO TQD 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀， Masslynx色譜工作站(美國Waters 公司)、BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)、CPA225D電子分析天平(德國Sartorius公司)。

1.2 試藥與試劑 磺胺嘧啶對照品(批號：H0361504，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.5%)，磺胺甲基嘧啶對照品(批號：G982705，Dr.Ehrenstorfer，純度99.1%)，磺胺二甲嘧啶對照品(批號：H0371406，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,純度99.2%)，磺胺間甲氧嘧啶對照品(批號：C0031610，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.5%)，磺胺甲噁唑?qū)φ掌?批號：H0261106，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.8%)，磺胺二甲氧嘧啶對照品(批號：C0061807，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.6%)，磺胺喹噁啉對照品(批號：H0251407，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.6%)，氧氟沙星對照品(批號：H0091210，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.5%)，環(huán)丙沙星對照品(批號：130451-201904，中國食品藥品檢定研究院，純度83.1%)，恩諾沙星對照品(批號：H0081505，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.5%)，多西環(huán)素對照品(批號：K0131507，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度85.2%)，氟苯尼考對照品(批號：K0302010，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.6%)，喹乙醇對照品(批號：C1572400，Dr.Ehrenstorfer，純度97.8%)，甲氧芐啶對照品(批號：100031-201606，中國食品藥品檢定研究院，純度99.8%)，金剛烷胺對照品(批號：G5410125，ANPEL，純度97.5%)，氯霉素對照品(批號：130555-201704，中國食品藥品檢定研究院，純度99.8%)，地塞米松對照品(批號：100129-201508，中國食品藥品檢定研究院，純度99.8%)，親水親油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱(200 mg，6 mL，華譜科儀(大連)科技有限公司)

供試品：麻杏石甘口服液(保定冀中藥業(yè)有限公司，規(guī)格：100 mL/瓶，批號：202109029、202108028、202108027)，乙腈(Merck公司，色譜純)，甲酸(Fisher Scientific，色譜純，批號：106055A)。

1.3 液相色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脫流速：0.2 mL/min，柱溫：30 ℃,進樣量5 μL，梯度洗脫程序見表1，該液相色譜條件適用于1組的13種藥物。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of gradient elution

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脫流速：0.2 mL/min，柱溫：30 ℃,進樣量5 μL，梯度洗脫程序見表2，該液相色譜條件適用于2組的4種藥物。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Program of gradient elution

1.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子掃描和負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測模式；正離子模式毛細(xì)管電壓3.0 kV，負(fù)離子模式毛細(xì)管電壓2.0 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流速1000L/Hr；各化合物質(zhì)譜采集參數(shù)見表3。

表3 17種化合物質(zhì)譜參數(shù)Tab 3 Retention time and mainmass spectrametry parameters of 17 compounds

1.5 樣品制備

1.5.1 陰性樣品制備 麻杏石甘口服液，實驗室自制。

1.5.2 單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 分別準(zhǔn)確稱取適量的各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)共計17種化合物，分別用甲醇溶解并定容，配制成 500 μg/mL 的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于-20 ℃ 以 下避光冷凍保存。

1.5.3 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 分別精密量取50 μL 17種化合物單標(biāo)儲備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度， 配制成 2.5 μg/mL 的 17種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于-20 ℃ 以 下避光冷凍保存。

1.5.4 樣品溶液的制備 精密量取2 mL麻杏石甘口服液于50 mL離心管中，加10 mL甲醇，渦旋2 min，超聲提取5 min，5000 r/min離心5 min，取全部上清液通過HLB小柱，收集凈化液，氮吹(45 ℃)至近干，加甲醇：0.1%甲酸=10:90定容至2 mL，搖勻，過濾，即得。

1.5.5 空白基質(zhì)溶液的制備 精密量取陰性樣品3 份，按照 1.5.4項下方法處理后即得空白基質(zhì)溶液。

1.5.6 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的制備 精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液50 μL置10 mL 容量瓶中，加空白基質(zhì)溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得 2.5 μg/mL 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.5.7 陽性添加樣品溶液的制備 精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量加入到陰性空白麻杏石甘口服液中，混勻，制成每1L分別添加10、25、50 μg(喹乙醇添加25、50、100 μg)的陽性添加樣品，每個添加量制備3份平行樣，按1.5.4所述方法制備陽性添加樣品，進行測定，每份樣品至少進樣2次，取平均值。

1.5.8 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確吸取1 mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(2.5 μg/mL)，至10 mL量瓶中，用空白基質(zhì)溶液稀釋至刻度，搖勻，得0.25 μg/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取該基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用空白基質(zhì)溶液稀釋制成5、10、25、50、100、120 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)系列工作液。

1.5.9 檢出限和定量限 在空白基質(zhì)溶液中添加適量的17種化合物的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，按照1.5.4所述方法制備樣品，照1.4所述儀器條件進行測定，進行檢出限和定量限的測定。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性范圍 按 1.5.8方法配制的 17種化合物基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在選定的儀器條件下測定。17種化合物基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖見圖1～2，各化合物分離度良好，響應(yīng)靈敏。以各化合物定量離子色譜峰面積 A 為縱坐標(biāo)，各化合物質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，繪制線性回歸方程。結(jié)果表明：17種化合物在 10～100 ng/mL(喹乙醇25～120 ng/mL)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于 0.99，17種化合物的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表4。

圖1 第1組13種化合物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖Fig1 Total ion flow chromatograms of 13 compounds matrix standard solution in the first group

圖2 第2組4種化合物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖Fig2 Total ion flow chromatograms of 4 compounds matrix standard solution in the second group

表4 17種化合物線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)Tab 4 Mainmass spectrametry parameters of 17 compounds

3.2 精密度考察 精密吸取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液 (25 ng/mL)5 μL，連續(xù)進樣 6次。以峰面積計算，得出17種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的RSD為1.9%，表明儀器的精密度良好，符合要求。

3.3 檢出限和定量限 測定結(jié)果表明：在相應(yīng)的保留時間，空白樣品對 17 種目標(biāo)化合物無干擾，空白樣品溶液總離子流圖見圖3～圖4。依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為方法檢出限，其中僅喹乙醇的檢出限為10 ng/mL，剩余16種藥物的檢出限均為5 ng/mL，特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥10的濃度為方法定量限，其中僅喹乙醇的定量限為25 ng/mL，剩余16種藥物的定量限為10 ng/mL。

圖3 第1組空白樣品溶液總離子流圖Fig3 Total ion flow chromatograms of blank samples in the first group

圖4 第2組空白樣品溶液總離子流圖Fig4 Total ion flow chromatograms of blank samples in the second group

3.4 準(zhǔn)確度 分別制備10、25、50 ng/mL三個添加濃度(喹乙醇添加濃度為25、50、100 ng/mL)，經(jīng)測定，平均回收率在73.87%～116.43%之間，RSD為1.25～8.44%(表5)。

表5 回收率試驗結(jié)果Tab 5 Results of recoveries

續(xù)表5

4 討論與結(jié)論

4.1 篩查物質(zhì)種類確定 據(jù)文獻(xiàn)[13-14]報道，市售中獸藥注射液、口服液、散劑中非法添加藥物有氯霉素(酰胺醇類藥物)、氟喹諾酮類藥物、抗病毒藥物(金剛烷胺)、喹諾酮類藥物，在與各養(yǎng)殖集團合作過程中，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖企業(yè)對上述品類中17種藥物的關(guān)注度較高，因此，本文中就17種藥物的檢測開展研究。

4.2 凈化條件的選擇 在前期的試驗過程中，我們曾參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告289號采用稀釋法(甲醇、乙腈)進行供試品前處理的制備，具體操作方法為取供試品1 mL，加甲醇4 mL，渦旋混勻后，離心，取上清1 mL，加0.1%甲酸溶液1 mL，混勻，過0.22 μm濾膜，上機檢測。但是長時間運行后供試品溶液中未去除的復(fù)雜基質(zhì)會累積在錐孔處，有大量的黑褐色斑塊出現(xiàn)，需要經(jīng)常性拆卸錐孔進行清理維護，采用與本文相同的流動相體系，喹乙醇的檢出限為50 ng/mL，定量限為100 ng/mL，剩余16種藥物的檢出限為25 ng/mL，定量限為50 ng/mL，難以滿足養(yǎng)殖集團的要求。在此基礎(chǔ)上嘗試采用甲醇提取繼而采用透過法通過親水親油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱凈化，可使供試品溶液的顏色由紅棕色改為淺黃色，大大降低基質(zhì)干擾程度，滿足檢測需求。

4.3 改進計劃 經(jīng)過比對，對畜禽養(yǎng)殖過程中常用到的雙黃連口服液、清瘟解毒口服液、清解合劑和板青顆粒均進行了相關(guān)的研究，對于基質(zhì)的干擾排除分別采用了通過親水親油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱、QuEChers凈化管、GCB固相萃取小柱等前處理方法，不同產(chǎn)品中物質(zhì)的響應(yīng)受到不同程度的干擾，后期還需進行詳細(xì)的研究，以期能夠建立針對各產(chǎn)品的快速、高效、準(zhǔn)確的方法便于進行安全性的質(zhì)量控制。

4.4 結(jié)論 研究建立了一種系統(tǒng)篩查中獸藥口服液制劑中17種化合物的檢測方法，發(fā)揮了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜準(zhǔn)確靈敏的優(yōu)勢，首次建立了中獸藥液體制劑麻杏石甘口服液中多種非特定非法添加/殘留物質(zhì)的檢測方法，有效加強了獸藥生產(chǎn)企業(yè)對于產(chǎn)品質(zhì)量的控制，建立了中獸藥制劑中動物源性食品禁限用獸藥的檢測、判定的科學(xué)依據(jù)，增強了動物源性食品的安全屏障。該方法操作簡單，凈化效果好，準(zhǔn)確度、靈敏度高，檢測限低，適用于麻杏石甘口服液的安全性檢測。