譚小寧 李勇敏 馬榮麗 羅吉 呂元

〔摘要〕 目的 比較HK-2外泌體分離方法對(duì)粒徑分布的影響，探索體外細(xì)胞攝取外泌體模式對(duì)外泌體細(xì)胞靶向性的參考價(jià)值。方法 采用超速離心法和3種試劑盒分離HK-2外泌體，測(cè)定其粒徑分布;用PKH67標(biāo)記HK-2外泌體，體外觀察HFL1、hFOB1.19、Kupffer、HCT116 4種細(xì)胞吸收HK-2外泌體，以及HCT116吸收HCT116、HK-2、HFL1、Kupffer 4種細(xì)胞的外泌體情況。結(jié)果 不同的分離方法得到外泌體的粒徑分析結(jié)果顯示，超速離心法得到外膜囊泡的粒徑比較均一，集中在100 nm左右。體外細(xì)胞吸收外泌體試驗(yàn)結(jié)果顯示：（1）在體外，HK-2外泌體均能被HFL1、hFOB1.19、 Kupffer、HCT116細(xì)胞吸收;（2）HCT116能吸收HCT116、HK-2、HFL1、Kupffer細(xì)胞的外泌體。結(jié)論 超速離心法和試劑盒都能分離得到HK-2外泌體，超速離心法得到外泌體粒徑大小分布較均一;試劑盒操作比較便捷，但是大囊泡和雜蛋白居多。在體外，同種外泌體能被多種細(xì)胞攝取吸收，同種細(xì)胞能吸收不同種細(xì)胞外泌體，表明外泌體在體外沒有特別好的靶向性。

〔關(guān)鍵詞〕 外泌體;超速離心法;粒徑分布;體外細(xì)胞;靶向吸收

〔中圖分類號(hào)〕R2 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.009

Extraction of HK-2 exosomes and cell targeting in vitro

TAN Xiaoning1， LI Yongmin1*， MA Rongli2， LUO Ji1， LV Yuan1

（1. Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital， Changsha， Hunan 410006， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To compare the effect of HK-2 exosomes separation method on particle size distribution， and to explore the reference value of model of exosome uptake by cells in vitro for exosome targeting. Methods HK-2 exosomes were separated by supercentrifugation and three kits， and its particle size distribution was determined. HK-2 exosomes were labeled with PKH67 to observe the absorption by HFL1， hFOB1.19， Kupffer and HCT116 cells， and exosomes of HCT116， HK-2， HFL1 and Kupffer cells were absorbed by HCT116. Results The particle size analysis of exosomes obtained by different separation methods showed that the particle size of outer membrane vesicles obtained by supercentrifugation was relatively uniform， concentrated at about 100 nm. The results of in vitro cell absorption of exosomes showed that： （1） HFL1， hFOB1.19， Kupffer and HCT116 cells could absorb HK-2 exosomes in vitro. （2） HCT116 can absorb exosomes of HCT116， HK-2， HFL1 and Kupffer cells. Conclusion HK-2 exosomes can be isolated by supercentrifugation and kit. The particle size distribution of the exosomes obtained by supercentrifugation method is relatively uniform. The kit is relatively easy to operate， but large vesicles and miscellaneous proteins are in the majority. In vitro， the same exosomes can be absorbed by multiple cells， and the same cells can absorb different kinds of exosomes， indicating that there is no particularly good targeting.

〔Keywords〕 exosome; supercentrifugation; size distribution; in vitro cells; targeted absorptionF80849DF-0E0D-4572-BCF0-165EECEBDB69

外泌體（exosome， Exo）是一類直徑30～120 nm的有被囊性小泡，成杯狀或球形結(jié)構(gòu)，表面富含膽固醇、神經(jīng)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺等脂類物質(zhì)[1-2]。外泌體在形成過程中選擇性地包裹細(xì)胞質(zhì)中的一些蛋白質(zhì)、核酸等信息物質(zhì)，參與細(xì)胞通信、細(xì)胞遷移、血管新生和腫瘤細(xì)胞生長等過程，在生物信息交流中起關(guān)鍵作用[3-5]。本課題組一直關(guān)注外泌體與臟腑相關(guān)理論之聯(lián)系，以細(xì)胞外泌體的特性來探索腎與骨之間的通信交流[6-7]。外泌體的研究越來越多，但是外泌體的分離純化方法以及靶向細(xì)胞的尋找，一直困擾著研究者。本文比較超速離心法和3種常用的商業(yè)化試劑盒分離對(duì)人腎近曲小管上皮細(xì)胞HK-2外泌體的粒徑分布的影響，并通過比較同種外泌體被多種細(xì)胞攝取吸收，同種細(xì)胞吸收不同種細(xì)胞外泌體的情況，獲得體外細(xì)胞攝取外泌體方式對(duì)外泌體尋找靶向細(xì)胞的評(píng)估價(jià)值，望能促進(jìn)外泌體的研究。

1 材料

1.1 ?細(xì)胞

人腎近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2）（目錄號(hào)SCSP-511）、人SV40轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞（hFOB1.19）（目錄號(hào)GNHu14）、人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）（目錄號(hào)TCHu 99），均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;肝臟巨噬細(xì)胞（Kupffer）（武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)：CP-R132）;人肺成纖維細(xì)胞（HFL1）由中南大學(xué)生命科學(xué)院贈(zèng)送。

1.2 ?主要試劑

DMEM/F-12粉末（批號(hào)：1881051）、ES級(jí)胎牛血清（批號(hào)：1809582）均購自美國Gibco公司;無外泌體胎牛血清（上海素爾生物有限公司，批號(hào)：SUER050QY）;exoEasy Maxi外泌體分離純化試劑盒（德國QIAGEN公司，貨號(hào)：76064）;ExoQuick-TCTM外泌體快速抽提試劑盒（美國SBI公司，貨號(hào)：EXOTC10A-1）;GETTM外泌體分離純化試劑盒（北京捷騰生物科技有限公司，貨號(hào)：GET300-2）;一抗稀釋液（貨號(hào)：P0023A）、封閉液（貨號(hào)：P0252）、超敏發(fā)光液（貨號(hào)：P0018）、DAPI染色液（貨號(hào)：C1002）均購自上海碧云天公司;PKH67熒光試劑盒（美國Sigma公司，批號(hào)：MKBZ0604V）;F-Actin染色試劑盒（美國Abnova公司，批號(hào)：1631293）。

1.3 ?主要儀器

超速離心機(jī)（美國Bechman公司，型號(hào)：L-100XP）;納米顆粒跟蹤分析儀（德國Particle Metrix公司，型號(hào)：ZetaView）;電泳儀（美國Hoefer公司，型號(hào)：SE300）;正置熒光顯微鏡（型號(hào)：DM4000型）、激光共聚焦顯微鏡（型號(hào)：TCS-SPS）均購自德國Leica公司;超高分辨率成像系統(tǒng)（美國Applied Precision公司，型號(hào)：DeltaVision OMX Blaze）。

2 方法

2.1 ?細(xì)胞培養(yǎng)及上清液收集

人腎近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2）培養(yǎng)于10% FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。匯合率達(dá)80%左右時(shí)，0.25%胰酶消化細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞懸液，1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。于提取外泌體之前更換成含10%無外泌體的FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。48 h后，收集上清液，300×g離心10 min去除殘留的細(xì)胞，2000×g離心10 min去除死細(xì)胞，10 000×g離心30 min去除大的囊泡和凋亡小體，得到比較純的HK-2上清液。用超濾管對(duì)HK-2上清液進(jìn)行濃縮，4000×g離心25 min，大約濃縮10倍。

2.2 ?分離純化HK-2外泌體

2.2.1 ?超速離心法提取HK-2外泌體 ?超速離心管滅菌，每支裝約20 mL的預(yù)處理濃縮后的HK-2上清液，于超高速離心機(jī)100 000×g離心70 min，小心吸出上清液，留1 mL液體;再加19 mL PBS洗外泌體，100 000×g離心70 min去掉雜蛋白，吸出上清液，用適量的PBS重懸。

2.2.2 ?exoEasy Maxi外泌體分離純化試劑盒提取HK-2外泌體 ?預(yù)處理濃縮后的HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液8 mL，加入與上清液等體積的緩沖液Buffer XBP，混勻加到離心柱里，500×g離心1 min，去掉膜下面的液體，把膜親和離心柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中。用10 mL緩沖液Buffer XWP清洗離心柱上結(jié)合的外泌體，5000×g離心5 min去除殘留的緩沖液。將離心柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中，加入400 μL的緩沖液Buffer XE和膜孵育1 min，500×g離心5 min進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再把洗脫液加到離心柱的膜上，孵育1 min，5000×g離心5 min，收集洗脫液。

2.2.3 ?ExoQuick-TCTM外泌體快速抽提試劑盒分離純化HK-2外泌體 ?沉淀溶液和樣品的比例為1∶5，在5 mL預(yù)處理濃縮后的HK-2上清液中加入1 mL沉淀溶液混勻，4 ℃冰箱內(nèi)放置過夜，1500×g離心30 min，吸出上清液，加入100～500 μL PBS重懸即可。

2.2.4 ?GETTM外泌體分離純化試劑盒分離純化HK-2外泌體 ?濾器預(yù)處理：把GETTM過濾器安裝在50 mL的離心管上，在膜上均勻加500 μL的預(yù)處理液，抽真空使液體完全通過濾器。再均勻地加200 μL平衡液至濾膜上，抽真空使完全通過濾器。上樣：加50 mL HK-2上清液（未濃縮），抽真空使上清液完全通過濾膜，可一次性處理250 mL。洗滌：均勻地加100 μL 洗滌液至濾膜上，抽真空使液體完全通過濾器。收集外泌體：把GETTM過濾器轉(zhuǎn)移到新的50 mL的離心管上，在濾膜上加400 μL收集液，與濾膜孵育2 min，使液體完全通過濾膜，收集管中的外泌體懸液。F80849DF-0E0D-4572-BCF0-165EECEBDB69

2.3 ?粒徑分析

將4種方法分離得到的外泌體每個(gè)取10 μL稀釋500倍，用納米顆粒跟蹤分析儀測(cè)定外泌體的粒徑分布及濃度。

2.4 ?HK-2外泌體體外靶向成骨細(xì)胞（hFOB1.19）檢測(cè)

通過HK-2外泌體提取方法的比較，4種方法中選擇超速離心法制備外泌體進(jìn)行后續(xù)靶向?qū)嶒?yàn)研究。PKH67標(biāo)記外泌體后加入hFOB1.19中：取外泌體懸液200 μL，加入1 mL 稀釋液;另取離心管，加入1 mL稀釋液，再加入4 μL PKH67染料溶液混合均勻;把外泌體懸液加到染料中，室溫孵育2 min;加入2 mL無外泌體血清孵育1 min終止染色;100 000×g離心70 min收集外泌體，用PBS洗滌，再超速離心，用200 μL PBS懸浮避光保存。hFOB1.19匯合率達(dá)到80%時(shí)，用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)。在6孔板里預(yù)先加入蓋玻片，將hFOB1.19以每孔2×105/mL的濃度接種在玻片上，置于33.5 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，加入PKH67標(biāo)記的外泌體，每孔加50 μL，培養(yǎng)3 h。

2.4.1 ?激光共聚焦顯微鏡觀察 ?將加入外泌體孵育3 h的6孔板移出培養(yǎng)箱，吸除上清液，用PBS洗一遍，加入1 mL 4%多聚甲醛固定20 min，吸出固定液，用PBS洗3遍。加入1 μg/mL的DAPI染色液1 mL，避光孵育20 min，吸出染色液，用PBS洗去多余的染料。在載玻片上滴一滴甘油，把蓋玻片從6孔板里拿出放在載玻片上，放4 ℃冰箱內(nèi)避光保存，采用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

2.4.2 ?超高分辨率成像系統(tǒng)觀察 ?按照“2.4.1”操作，制備DAPI染色細(xì)胞爬片，用肌動(dòng)蛋白染色試劑盒標(biāo)記細(xì)胞骨架。取1 μL染料加到1 mL的緩沖液Labeling Buffer中稀釋，取500 μL加入激光共聚焦小皿中，室溫避光孵育30 min，用PBS洗去多余的染料，用超高分辨率成像系統(tǒng)觀察并拍照。

2.5 ?HK-2外泌體體外攝取情況觀察

選擇HFL1、Kupffer、HCT116、hFOB1.19細(xì)胞（這些細(xì)胞來源于肺、肝、腸、骨等不同組織，且為本實(shí)驗(yàn)室保存）為觀察對(duì)象。同“2.4”操作，培養(yǎng)細(xì)胞，制備好細(xì)胞爬片，分四象限排放于培養(yǎng)皿中，加入PKH67標(biāo)記的HK-2外泌體200 μL，室溫避光孵育3 h，用PBS洗去多余的染料，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.6 ?HCT116體外攝取多種細(xì)胞外泌體觀察

按照“2.4”操作，分別制備HCT116、HK-2、HFL1、Kupffer細(xì)胞外泌體并用PKH67標(biāo)記，分別加入HCT116細(xì)胞中，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

3 結(jié)果

3.1 ?HK-2外泌體不同提取方法對(duì)粒徑分布的影響

超速離心HK-2上清液得到外泌體，粒徑集中在100 nm左右，表明外泌體粒徑均一，純度較高，1 mL HK-2上清液可以分離得到1.2×108個(gè)外囊泡（圖1）;exoEasy Maxi外泌體分離純化試劑盒、ExoQuick-TCTM外泌體快速抽提試劑盒、GETTM外泌體分離純化試劑盒提取HK-2上清液的外泌體大部分粒徑集中在100～500 nm，大囊泡居多。exoEasy Maxi外泌體分離純化試劑盒、ExoQuick-TCTM外泌體快速抽提試劑盒、GETTM外泌體分離純化試劑盒提取的外泌體濃度分別為9.4×106/mL（圖2）、6.6×107/mL（圖3）、8.7×107/mL（圖4）。

3.2 ?激光共聚焦顯微鏡觀察HK-2外泌體體外靶向成骨細(xì)胞（hFOB1.19）

激光共聚焦顯微鏡觀察如圖5，可見HK-2 外泌體被hFOB1.19攝取并分布在核周圍。

3.3 ?超高分辨率成像系統(tǒng)觀察HK-2外泌體體外靶向hFOB1.19

圖6A為超高分辨率成像系統(tǒng)下F-Actin紅色熒光標(biāo)記細(xì)胞骨架、DAPI藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核的hFOB1.19細(xì)胞。圖6B可以清晰地觀察到PKH67標(biāo)記的HK-2外泌體已進(jìn)入hFOB1.19細(xì)胞，分布在細(xì)胞核周圍。將圖6B視野旋轉(zhuǎn)90°后為圖6C所示，旋轉(zhuǎn)180°為圖6D所示，從不同角度可見，在hFOB1.19細(xì)胞核中間可見綠色的HK-2外泌體顆粒，確定HK-2外泌體已被hFOB1.19攝入細(xì)胞中。

3.4 ?熒光顯微鏡觀察HK-2外泌體體外被多種細(xì)胞攝取情況

HK-2外泌體加入HFL1、hFOB1.19、Kupffer、HCT116細(xì)胞中檢測(cè)，如圖7所示，可見細(xì)胞內(nèi)有PKH67標(biāo)記的綠色外泌體，說明HK-2外泌體能被HFL1、hFOB1.19、Kupffer、HCT116細(xì)胞攝取。本研究中PKH67標(biāo)記的HK-2外泌體的熒光信號(hào)容易淬滅，且細(xì)胞周圍的HK-2外泌體熒光信號(hào)聚集過多，難以區(qū)別細(xì)胞對(duì)外泌體攝取量的差異。

3.5 ?熒光顯微鏡下觀察HCT116體外攝取多種細(xì)胞外泌體情況

HFL1、HK-2、Kupffer、HCT116的外泌體加入HCT116細(xì)胞中，熒光顯微鏡下能看到HCT116細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)PKH67標(biāo)記的外泌體，如圖8，說明HFL1、HK-2、Kupffer、HCT116的外泌體在體外均能被HCT116所攝取。

4 討論

外泌體具有源細(xì)胞特征、器官靶向性與生物功能性三大特性，從外泌體角度對(duì)臟腑相關(guān)理論進(jìn)行闡釋，視外泌體為臟腑之間的一個(gè)靶向信使，由各臟腑細(xì)胞分泌，沿著臟腑相關(guān)的路線，靶向目標(biāo)，調(diào)控靶器官功能，且運(yùn)用臟腑相關(guān)理論有可能預(yù)測(cè)外泌體的靶向運(yùn)動(dòng)和生物功能。這對(duì)于中醫(yī)基礎(chǔ)理論的研究具有重要意義。F80849DF-0E0D-4572-BCF0-165EECEBDB69

細(xì)胞在胞外環(huán)境的刺激下會(huì)發(fā)生內(nèi)吞、出芽，形成內(nèi)囊泡，同時(shí)選擇性地包裹細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)、核酸等，與細(xì)胞膜融合后形成外泌體被釋放到胞外[8]。外泌體提取分離的常用方法是超速離心法，但其耗時(shí)比較長，極高的轉(zhuǎn)速可能破壞囊泡的結(jié)構(gòu)。試劑盒操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，但聚合物沉淀引入過多雜蛋白，導(dǎo)致外泌體蛋白定量不準(zhǔn)確。另外，在提取外泌體的過程中，一些化學(xué)試劑的加入破壞了囊泡的生物功能，導(dǎo)致外泌體功能研究難以進(jìn)行[9-10]。本研究用超速離心法和3種常用的試劑盒分別提取HK-2外泌體，發(fā)現(xiàn)超速離心法提取外泌體粒徑分布集中在100 nm左右，均一性好，質(zhì)量好。試劑盒提取外泌體的共性是100 nm以上的囊泡居多，exoEasy Maxi外泌體分離提取試劑盒提取的外泌體濃度低，粒徑分布集中，質(zhì)量較好，ExoQuick-TCTM、GETTM提取的外泌體粒徑分布有2個(gè)峰，均一性較差。

研究中還有一些其他的提取外泌體的方法，凝膠尺寸排阻色譜是依靠細(xì)胞外囊泡的直徑與其他成分進(jìn)行區(qū)分，但是在一些樣品（如血漿）中存在大量與囊泡尺寸相似的粒子（如脂蛋白）等，因此分離效果不是很理想;免疫親和純化是僅選擇一種外泌體亞型通過外泌體表面蛋白的親和方式來捕獲外泌體，該方法受限于抗體的特異性等問題，樣品也會(huì)存在很多雜質(zhì)。在研究中可以用兩種方法同時(shí)用于外泌體的分離，SHARMA等[11]使用離心、浮力密度和超濾方法組合的手段從細(xì)胞條件培養(yǎng)基和生物流體中分離外泌體。近年來已經(jīng)開發(fā)出一些用于快速分離和分析外泌體的裝置，如微流控芯片、交流電動(dòng)力學(xué)微陣列芯片裝置主要用于血液中外泌體的分析，不需要預(yù)處理或稀釋樣品，也不需要使用捕獲抗體或其他親和技術(shù)，可以在30 min內(nèi)對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行特異性鑒定和定量，實(shí)現(xiàn)無縫的“樣本到答案”的液體活檢篩查[12]。

細(xì)胞外泌體分離純化至關(guān)重要，最新的研究發(fā)現(xiàn)不同尺寸的外泌體的發(fā)生機(jī)制和功能作用不同[13]，ZHANG等[14]用不對(duì)稱流場(chǎng)分離技術(shù)對(duì)細(xì)胞釋放的納米級(jí)顆粒進(jìn)行分類，證實(shí)了外泌體亞類的存在，把直徑為90～120 nm的外泌體囊泡稱為大外泌體囊泡，60～80 nm的稱為小外泌體囊泡，把直徑大約35 nm的稱為“外泌顆?！保钊敕治鲋蟀l(fā)現(xiàn)這3種納米顆粒顯示出不同的蛋白質(zhì)組、脂質(zhì)、RNA和DNA分布以及N-糖基化模式，表明它們可能來源于不同的生物發(fā)生機(jī)制。因此，對(duì)外泌體的分離方法的優(yōu)化仍是需要繼續(xù)研究的課題。

細(xì)胞外泌體屬納米級(jí)，無色透明，即使超高分辨率顯微鏡（目前的STED技術(shù)分辨率可達(dá)30 nm）[15]也難以清楚分辨。因囊泡膜標(biāo)記較方便，綠色熒光染料PKH67及橙紅色熒光染料PKH26、Di1等標(biāo)記技術(shù)成熟[16-17]，因此，觀察細(xì)胞外泌體以熒光標(biāo)記囊泡膜為主。然而這種膜標(biāo)記熒光信號(hào)弱，難以在活體動(dòng)物上清晰捕捉。近期，RIDDER等[18]用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠腫瘤細(xì)胞TU2449，使其表達(dá)Cre重組酶，該腫瘤細(xì)胞的外泌體攜帶Cre-mRNA，將腫瘤細(xì)胞或其外囊泡注入含有Rosa26-stop-Rep報(bào)告基因的克隆小鼠中，當(dāng)外泌體被靶細(xì)胞吸收，釋放Cre- mRNA，剪斷stop編碼，Rep基因顯性呈紅色，表明外泌體到達(dá)該細(xì)胞組織，形成良好的外泌體體內(nèi)運(yùn)行可視系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上，BITTEL等[19]利用Cre-LoxP系統(tǒng)報(bào)告，在Rosa26-tdTomato-reporter背景下，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌外膜囊泡在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移路線，cre-OMV轉(zhuǎn)移到腸上皮細(xì)胞，包括腸干細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，此外，心臟、肝臟、腎臟、脾臟和大腦也有出現(xiàn)。細(xì)胞和細(xì)菌外囊泡體內(nèi)轉(zhuǎn)移信息可視化系統(tǒng)的研制，大大促進(jìn)了囊泡生物信息科學(xué)的研究進(jìn)程。

細(xì)胞外泌體靶向性或選擇性是囊泡研究的另一焦點(diǎn)。本課題組發(fā)現(xiàn)，在體外，HK-2外泌體能被不同細(xì)胞攝取，同時(shí)，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116可吸收不同細(xì)胞的外泌體，用熒光顯微鏡甚至激光共聚焦觀察難以判斷其靶向性或選擇性。TENG等[20]用PKH26標(biāo)記植物來源的外泌體，與多種細(xì)胞體外共培養(yǎng)，再用流式細(xì)胞儀測(cè)定紅色熒光強(qiáng)弱，以此判斷外泌體對(duì)細(xì)胞的選擇性;然后采用Dil標(biāo)記外泌體，觀察其在體內(nèi)的分布，結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)判斷植物來源的外泌體對(duì)體內(nèi)細(xì)胞的選擇性，既簡(jiǎn)單又有很好的準(zhǔn)確性，值得借鑒。

本研究探討了外泌體被體外細(xì)胞攝取的情況，對(duì)于外泌體在體內(nèi)的實(shí)際分布與靶向性情況如何，有待進(jìn)一步研究。

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