陳成 劉毅 許漢林

〔摘要〕 目的 篩選土田七醇提物抗肝癌活性部位，并研究其對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞侵襲遷移的影響。方法 采用大孔樹脂對(duì)土田七醇提物進(jìn)行洗脫，并采用CCK-8法檢測不同洗脫部位對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響;建立荷瘤小鼠模型，通過瘤體質(zhì)量變化評(píng)價(jià)不同洗脫部位的體內(nèi)抗腫瘤作用;采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力。結(jié)果 土田七醇提物的大孔樹脂不同洗脫部位均有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，并可抑制裸鼠腫瘤的生長，其中70%洗脫部位的效果最好。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，70%洗脫部位可抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移過程。結(jié)論 土田七醇提物的大孔樹脂70%洗脫部位抗肝癌活性最好，并可抑制肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力。

〔關(guān)鍵詞〕 土田七;肝癌;醇提物;活性部位;侵襲;遷移

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.010

Screening of active fractions from the alcohol extract of Stahlianthus involucratus and its

effect on invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells

CHEN Cheng， LIU Yi， XU Hanlin*

（Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430065， China）

〔Abstract〕 Objective To screen the anti-hepatocellular carcinoma active fractions from the alcohol extract of Stahlianthus involucratus， and investigate its effect on invasion and migration of SMMC-7721 and HepG2. Methods The alcohol extract of Stahlianthus involucratus was eluted by macroreticular adsorbents， followed by the CCK-8 to investigate the hepatocellular carcinoma cell proliferation treated by the different fractions. The tumor bearing mouse model was established and used to screen the antitumor effect in vivo with different fractions by the changes of the weight of tumor mass. The invasion and migration abilities of hepatocellular carcinoma cells were detected by Transwell chamber assay and scratch assay. Results Different fractions of macroreticular adsorbents from alcohol extract of Stahlianthus involucratus can inhibit the multiplication of hepatocellular carcinoma cells and inhibit the growth of tumor in nude mice. Among them， the fraction eluted with 70% ethanol has the best effect. Both Transwell chamber assay and scratch assay results showed that the fraction eluted with 70% ethanol can inhibit the migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Conclusion The 70% elution fraction of macroreticular adsorbents from alcohol extract of Stahlianthus involucratus has the best anti-liver cancer activity， which also could inhibit the invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells.

〔Keywords〕 ?Stahlianthus involucratus; hepatocellular carcinoma; alcohol extract; active fraction; invasion; migration

肝癌是我國臨床上常見的惡性腫瘤之一，由于其具有極強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致中晚期肝癌的死亡率仍然居高不下[1-5]。研究表明，約60%以上的患者在接受手術(shù)治療后的5年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[6-9]。因此，探索抑制肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力的方法是目前肝癌研究的熱點(diǎn)之一，而姜科藥用植物在抗腫瘤研究中的進(jìn)展給人們提供了新的思路和策略。81B6BDB6-19C0-43D4-894C-F1D425D6FF42

土田七是姜科土田七屬植物土田七[Stahlianthus involucratus （King ex Bak.） Craib]的干燥塊根和根莖，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有活血止血、消腫散瘀的功效[10-11]?，F(xiàn)代研究表明，土田七對(duì)多種類型的腫瘤細(xì)胞具有抑制和殺傷作用[12-14]。但目前土田七對(duì)肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞侵襲遷移的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過體內(nèi)外抗肝癌藥理試驗(yàn)，篩選出土田七醇提物抗肝癌活性最強(qiáng)的大孔樹脂洗脫部位，并觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲遷移的影響，為土田七抗癌作用的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ?肝癌細(xì)胞株SMMC-7721（上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20180412-

01）和HepG2（上海信裕生物科技有限公司，批號(hào)：XY0022）。昆明小鼠（雄性，4～6周;體質(zhì)量18～22 g），購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。

1.1.2 ?藥材與試劑 ?藥材購自云南省文山州，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)的陳科力教授鑒定為土田七[Stahlianthus involucratus （King ex Bak.） Craib]。姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，貨號(hào)：B20614）;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號(hào)：8118269）;胎牛血清（武漢四季青生物制品公司，批號(hào)：18040502）;胰蛋白酶消化液（美國Gibco公司，批號(hào)：2323527）;PBS （美國HyClone公司，批號(hào)：AG29574691）;Annexin V -FITC/PI檢測試劑盒（上海貝博生物技術(shù)公司， 批號(hào)：BB21061）;Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司，批號(hào)：7156009）。

1.1.3 ?主要儀器 ?SW-CJ-2G型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化工作臺(tái)設(shè)備有限公司）;INCO108型二氧化碳培養(yǎng)箱（德國Memmert公司）;xMark型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）;L530R型低溫離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)有限公司）;D2060R型流式細(xì)胞儀（艾森生物有限公司）;CKX53型倒置相差顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?土田七醇提物的制備 ?稱取洗凈的土田七1 kg，粉碎過篩，75%乙醇加熱回流提取3次，合并提取液，過濾濃縮，冷干成粉備用。

1.2.2 ?大孔樹脂柱各洗脫部位的制備 ?稱取D101大孔吸附樹脂適量，預(yù)處理后，濕法裝柱。將土田七醇提物用適量水溶解，上樣。依次用水溶液、30%乙醇溶液、70%乙醇溶液、95%乙醇溶液進(jìn)行洗脫。收集各洗脫液，并減壓濃縮至干粉狀。各乙醇洗脫部位以DMSO復(fù)溶后，制成0.1 g/mL（以提取物計(jì)）的原液，0.22 μm濾膜過濾，-20 ℃保存。

1.2.3 ?檢測土田七各洗脫部位對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響 ?取對(duì)數(shù)期生長的SMMC-7721細(xì)胞、HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，每孔100 μL加入96孔板中，置于培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分組，姜黃素組和30%、70%、95%乙醇洗脫組分別設(shè)置5個(gè)不同給藥濃度（20、40、60、80、100 μg/mL），同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（含細(xì)胞，加入等體積培養(yǎng)基）和空白對(duì)照組（不含細(xì)胞，只含培養(yǎng)基），每組復(fù)孔5個(gè)。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。藥物處理結(jié)束后，加入含10% CCK-8試劑的細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，在450 nm波長下檢測各培養(yǎng)孔的吸光度（A）值，并計(jì)算肝癌細(xì)胞的細(xì)胞活力[細(xì)胞活力=（A給藥組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%]。

1.2.4 ?肝癌細(xì)胞移植瘤小鼠模型的建立及分組給藥

取對(duì)數(shù)期生長的SMMC-7721細(xì)胞懸液和HepG2細(xì)胞懸液，分別調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，每只小鼠腹腔注射0.2 mL。培養(yǎng)5～7 d后，無菌條件下抽取小鼠腹水，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2×106/mL，每只小鼠0.2 mL接種至右腿皮下部位。接種完成后，按隨機(jī)原則將兩種肝癌細(xì)胞的已成模小鼠各分為5組，每組6只。分組情況如下：空白對(duì)照組、姜黃素組及30%、70%、95%乙醇洗脫組。空白對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，0.5 mL/d;姜黃素組和各乙醇洗脫組給藥劑量均為100 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃給藥14 d。給藥結(jié)束后，完整剝離小鼠的皮下移植瘤，并稱取腫瘤質(zhì)量。

1.2.5 ?Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 ?將基質(zhì)膠用不含血清的培養(yǎng)基稀釋，加入Transwell小室，于培養(yǎng)箱中靜置1 h使基質(zhì)膠凝固。取藥物預(yù)先處理24 h的肝癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，均勻接種至Transwell小室中。小室中加入600 μL的含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出小室，清洗2～3次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，將小室浸泡在結(jié)晶紫染液中染色10 min，再次清洗并擦去上室內(nèi)殘留的細(xì)胞。晾干后，倒置顯微鏡下拍照，200倍下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.6 ?劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 ?取對(duì)數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，并接種于6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)90%時(shí)，用10 μL 移液槍槍頭垂直于孔板畫線。用PBS清洗2～3次，洗掉懸浮的細(xì)胞。加入含有藥物的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于0 h和24 h時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。劃痕面積=（0 h空白對(duì)照組劃痕面積減號(hào)24 h 給藥組劃痕面積）/（0 h空白對(duì)照組劃痕面積）×100%。81B6BDB6-19C0-43D4-894C-F1D425D6FF42

1.2.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ?使用GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以“x±s”表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ?大孔樹脂柱各洗脫部位抑制肝癌細(xì)胞增殖

測定各給藥組的細(xì)胞活力，結(jié)果見圖1。各洗脫部位中，70%乙醇洗脫組抑制肝癌細(xì)胞增殖的效果最佳，且存在顯著的量效關(guān)系。70%乙醇洗脫組與姜黃素組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與30%、95%乙醇洗脫組相比較，存在顯著性差異（P<0.01）。

2.2 ?大孔樹脂柱各洗脫部位對(duì)小鼠移植瘤生長的影響

比較各給藥組的瘤重，結(jié)果見圖2。在SMMC-7721模型組中，70%乙醇洗脫組與空白對(duì)照組比較，平均瘤重有顯著性差異（P=0.023 8）;95%乙醇洗脫組與空白對(duì)照組比較，平均瘤重有顯著性差異（P=0.031 4）。在HepG2模型組中，70%乙醇洗脫組與空白對(duì)照組比較，平均瘤重有顯著性差異（P=0.0324）;95%乙醇洗脫組與空白對(duì)照組比較，平均瘤重有顯著性差異（P=0.038 8）。與空白對(duì)照組相比較，30%乙醇洗脫部位對(duì)小鼠的瘤重?zé)o明顯影響。

2.3 ?土田七抗肝癌活性部位對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用70%乙醇洗脫部位（20 μg/mL）處理肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞24 h后，與空白對(duì)照組相比，土田七能明顯降低肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞侵襲的能力。詳見圖3。

2.4 ?土田七抗肝癌活性部位對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，70%乙醇洗脫組（20 μg/mL）對(duì)肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的遷移能力具有明顯的抑制作用。在SMMC-7721模型組中，70%乙醇洗脫組與空白對(duì)照組比較，劃痕面積有顯著性差異（P=0.0385）。在HepG2模型組中，70%乙醇洗脫組與空白對(duì)照組比較，劃痕面積有顯著性差異（P=0.021 3）;詳見圖4。

3 討論

臨床上，手術(shù)治療依然是提高肝癌治療效果的主要手段，但除少數(shù)早期患者外，大部分患者因?yàn)楦伟┘?xì)胞的轉(zhuǎn)移而失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。即便接受了手術(shù)治療，在后期也有較大概率發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者的5年存活率尚不及30%[15-20]。鑒于此，對(duì)能夠抑制肝癌侵襲遷移的藥物進(jìn)行探索和研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究通過體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)對(duì)土田七醇提物的大孔樹脂洗脫部位進(jìn)行了活性篩選，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)70%乙醇洗脫部位的抗腫瘤活性最佳，其次是95%乙醇洗脫部位，30%乙醇洗脫部位則無明顯的抗腫瘤效果。因此，本實(shí)驗(yàn)以70%乙醇洗脫部位為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探究其是否具有抑制肝癌細(xì)胞侵襲遷移的能力。為了排除藥物通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)侵襲遷移的影響，此次采用了對(duì)肝癌細(xì)胞增殖率影響較小的藥物濃度（20 μg/mL）進(jìn)行了后續(xù)的Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，70%乙醇洗脫部位對(duì)兩種人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和HepG2的侵襲遷移能力均具有顯著的抑制作用。本研究為姜科植物土田七的開發(fā)利用和肝癌的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，隨著研究的深入，土田七在肝癌的臨床防治上將會(huì)有更廣泛的作用。

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