常馨月，米曉，董明然，王同瑾，胡美賡，沈俊宇，路娟*，陳曦*（.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 0093；.FITOTERAPIA BIOTECH LTDA公司，巴西 0040-000）

多項研究強調(diào)了誘發(fā)精子質(zhì)量下降和睪丸功能損傷的因素，其中環(huán)境誘因和生活方式對男性生殖健康產(chǎn)生了較大影響[1-3]。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是應(yīng)用最廣泛的增塑劑之一，可通過飲水、飲食、皮膚接觸（化妝品）和呼吸進入人體，具有雌激素樣作用，影響生物體內(nèi)激素的正常分泌，對人體健康造成不同程度的危害[4-5]。

楝科植物巴西海木（Trichilia catiguaA.Juss.）是主產(chǎn)于南美洲的一種小型灌木，作為巴西傳統(tǒng)藥物常用于緩解疲勞、壓力和壯陽。以巴西海木為原料的保健品“Catuama”在巴西商業(yè)化應(yīng)用已有20余年的歷史[6]。現(xiàn)代藥理研究表明巴西海木具有顯著的抗炎、抗菌[7-9]及抗氧化作用[10-14]：巴西海木的乙酸乙酯組分可有效抑制魚藤酮引發(fā)的神經(jīng)細胞SH-SY5Y氧化損傷；抑制缺血再灌注引起的氧化損傷等，且在健康的人類志愿者中沒有出現(xiàn)毒副作用[15]。研究表明，巴西海木樹皮的醇提物中含有綠原酸、原花青素B2、花青素C1、表兒茶素、兒茶素、黃烷-3醇、β-谷甾醇、豆甾醇和莰烯醇等化合物[16-18]，其中黃酮類化合物和酚類也被認為是其抗氧化活性的基礎(chǔ)[19]。巴西海木在民間醫(yī)學(xué)中廣泛用于治療陽痿等生殖系統(tǒng)疾病，而目前現(xiàn)代藥理學(xué)研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)的抗氧化作用，生殖系統(tǒng)相關(guān)作用及機制報道較少，故本研究以生殖系統(tǒng)為切入點進行研究。本研究利用H2O2致TM4細胞氧化損傷模型初步篩選出巴西海木對于細胞氧化損傷具有保護作用的提取物；建立DEHP致雄性小鼠生殖系統(tǒng)氧化損傷模型，進一步對篩選出的提取物進行藥效評價；通過qRT-PCR研究相關(guān)基因的表達情況，初步探究其生殖系統(tǒng)保護作用機制，為巴西海木的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AB265-S 電子分析天平（瑞士 METTLER TOLEDO公司），Infinite M1000 多功能連續(xù)波長酶標(biāo)儀（瑞士 TECAN公司），B25-12DT 型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司），SC-3610 低速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱（三洋電機株式會社），IX51 型熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），NanoDrop 2000 分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司），LightCycler 480 實時系統(tǒng)（瑞士 Roche公司）。

1.2 試藥

巴西海木樹皮由FITOTERAPIA BIOTECH LTDA 公司于巴西東北巴伊亞州采集得到。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所李海濤研究員鑒定為楝科巴西海木（Trichilia catiguaA.Juss.）的樹皮。

30%過氧化氫溶液（北京化工廠），胎牛血清（FBS，德國 PAN Seratech公司），Cell counting kit-8（CCK-8，日本 DOJINDO/同仁化學(xué)），無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（分析純，天津北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司），水溶性維生素E（VE，Trolox）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、二甲基亞砜（DMSO）、馬血清（HS）（索萊寶生物科技有限公司），Trypsin-EDTA（0.25%）、DMEM/F12培養(yǎng)基（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司），總蛋白定量測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成科技有限公司），兔抗Nrf2（bs-1074R）、SOD2（bs-20667R）、SOD3抗體（bs-3895R）（Bioss），RNAiso Plus（9108-9109）、Prime Script RT Master Mix（RR036A）、TB Green Premix Ex Taq（RR82WR）（日本 TaKaRa BIO株式會社）。

1.3 細胞培養(yǎng)

TM4小鼠睪丸支持細胞（北京協(xié)和細胞資源中心），采用含5%HS＋2.5%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)基，在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日換液，細胞生長到對數(shù)生長期時，傳代（比例為1∶6）并開展實驗，實驗用細胞控制在10代以內(nèi)。

1.4 實驗動物

健康雄性SPF級ICR小鼠（18～22 g），由北京華阜康生物科學(xué)有限公司提供，實驗動物許可證號：SLXD-20210507012。動物實驗均經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究研究所動物倫理委員會批準，并按照美國國立衛(wèi)生研究院的指南進行。飼養(yǎng)條件：溫度（23±2）℃，相對濕度（55±5）%，光暗周期同晝夜周期，所有小鼠正式實驗前均適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

2 方法與結(jié)果

2.1 巴西海木提取物的制備[20-21]

2.1.1 巴西海木提取物制備方法 取巴西海木樹皮粉末100 g各4份，以料液比＝1∶10分別加入蒸餾水，50%、70%、95%乙醇溶液1000 mL，充分攪拌后冷浸兩次，每次24 h，過濾，合并兩次浸出液，旋蒸濃縮后60℃下烘干。取50%粗提物、70%粗提物以及95%粗提物干燥粉末各5 g，加300 mL蒸餾水震蕩使其均勻分散在水溶液中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，收集得到相應(yīng)萃取液組分后再次進行旋蒸烘干。巴西海木樹皮粉末13種提取物代號見表1。

表1 巴西海木樹皮13種提取物對應(yīng)代號 Tab 1 Corresponding codes of 13 extracts from bark of Trichilia catigua A.Juss.

2.1.2 巴西海木提取物制備結(jié)果 使用水及50%、70%及95%乙醇溶液粗提得到4種巴西海木粗提物（TCE-1～TCE-4）；不同濃度醇提物經(jīng)石油醚、乙酸乙酯及正丁醇依次萃取得到9種組分（TCE-5～TCE-13），共13種提取物。稱定干燥，以生藥量計算各提取物得率，結(jié)果見表2。

表2 巴西海木13種提取物得率 Tab 2 Yield of 13 extracts from Trichilia catigua A.Juss.

2.2 巴西海木提取物對TM4細胞增殖率的影響

2.2.1 方法 使用DMSO分別溶解13種提取物配制成160 μg·mL-1的含藥溶液，使用完全培養(yǎng)基逐級稀釋，分別得到質(zhì)量濃度為160、80、40、20、10、5 μg·mL-1的溶液。取對數(shù)生長期的TM4細胞懸液100 μL（1×105個·mL-1）接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，細胞生長至80%融合時吸去原有培養(yǎng)基，給藥組加入不同質(zhì)量濃度待測含藥溶液各100 μL，對照組加入完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)孵育24 h。24 h后吸去原有培養(yǎng)基，加入100 μL 10%CCK-8稀釋液，反應(yīng)1 h后，450 nm波長處測定OD值，計算細胞增殖率。

細胞增殖率（%）＝（測定組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）× 100%-1。

2.2.2 結(jié)果 由圖1可知，TCE-4、TCE-5、TCE-7、TCE-8、TCE-10、TCE-11、TCE-13可降低細胞增殖率，對TM4細胞有明顯殺傷作用，故不進行后續(xù)藥效評價。給予5～160 μg·mL-1TCE-1、TCE-2、TCE-3、TCE-6、TCE-9、TCE-12后TM4細胞增殖，可用于后續(xù)抗氧化損傷藥效實驗。

圖1 不同提取物對細胞增殖率的影響（±s，n＝6）Fig 1 Effect of different extracts on the cell proliferation rate（±s，n＝6）

2.3 過氧化氫損傷條件的確定[22]

2.3.1 方法 取30%H2O2溶液18 μL加至10 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中配制成18 000 μmol·L-1的H2O2母液，分別精密移取1000、833、667、500、333、167、56 μL H2O2溶液后加基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至10 mL，得到1800、1500、1200、900、600、300、100 μmol·L-1H2O2溶液。按照“2.2”項下方法將細胞接種培養(yǎng)24 h后棄去上清培養(yǎng)基，加入終濃度為100、300、600、900、1200、1500、1800 μmol·L-1H2O2各200 μL分別作用2 h、4 h后，測定OD值，計算細胞存活率。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、細胞數(shù)量的變化，確定細胞存活率降至50%～60%的H2O2濃度及作用時間。細胞存活率按下式計算：

細胞存活率（%）＝（測定組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

2.3.2 結(jié)果 由圖2可知，H2O2對于細胞的損傷程度隨著H2O2濃度的升高和損傷時間的延長而增強。在600 μmol·L-1的濃度下作用2 h和4 h后，TM4細胞存活率均為50%～60%，故確定H2O2損傷TM4條件為600 μmol·L-1H2O2損傷2 h。圖3顯示該損傷條件下TM4細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞板上黏著減少，細胞數(shù)量減少約33%。

圖2 不同濃度H2O2分別作用2 h、4 h后細胞存活情況（±s，n＝3）Fig 2 Cell viability after treatment with different concentrations of H2O2 for 2 h and 4 h（±s，n＝3）

圖3 600 μmol·L-1 H2O2損傷2 h后（A）及空白對照組（B）的細胞形態(tài)（×20）Fig 3 Cell morphology of the group after 600 μmol·L-1 H2O2 injury for 2 h（A）and blank control group（B）（×20）

2.4 巴西海木提取物對氧化損傷TM4細胞存活率的影響

2.4.1 方法 細胞分為空白對照組，模型組，陽性藥組（VE組），水提物組，給藥組（TCE-1、TCE-2、TCE-3、TCE-6、TCE-9、TCE-12），其中VE組給藥濃度為20 μg·mL-1[23]，各給藥組給藥濃度分別為20、40、80 μg·mL-1。按照“2.2.1”項下方法接種細胞培養(yǎng)24 h，除對照組外，其余各組吸去原有培養(yǎng)基并用PBS沖洗后加入200 μL 600 μmol·L-1的H2O2損傷2 h。2 h后棄去上清并用PBS沖洗殘余H2O2溶液，給藥組加入含藥培養(yǎng)基，陽性藥組加入VE溶液，模型組及對照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后按照“2.2.1”項下方法測定OD值，按“2.3.1”項下公式計算各組細胞存活率。

2.4.2 結(jié)果 如圖4所示，給予600 μmol·L-1H2O2損傷2 h后，與空白對照組相比，模型組細胞存活率降低約50%；與模型組相比，給藥組細胞存活率均有一定提高。TCE-1、TCE-2、TCE-3、TCE-6、TCE-9、TCE-12均有一定的抗氧化損傷作用，給予80 μg·mL-1TCE-2、TCE-6、TCE-9可顯著提高TM4細胞存活率（P＜0.01），明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的TM4細胞存活率降低的損傷情況。后續(xù)對這3個提取物進行研究。

圖4 不同組別TM4細胞存活率變化（±s，n＝3）Fig 4 Changes of the viability of TM4 cells in each group（± s，n＝3）

2.5 TM4細胞氧化指標(biāo)變化

2.5.1 方法 細胞分為對照組，模型組，VE組，給藥組（TCE-2、TCE-6、TCE-9）。其中VE組給藥濃度為20 μg·mL-1，給藥組給藥濃度為80 μg·mL-1，按照“2.4.1”項下方法損傷細胞并給藥。給藥24 h后去除含藥培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞后，收集細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，按照試劑盒檢測 SOD、MDA和GSH-Px的含量，計算公式如下：

SOD抑制率（%）＝[（OD對照組-OD對照空白組）- （OD測定組-OD測定空白組）]/（OD對照組-OD空白組）×100%。

SOD活力（U·mgprot-1）＝SOD抑制率/50%×反應(yīng)體系/稀釋倍數(shù)/待測樣本蛋白含量

MDA（nmol·mgprot-1）＝（OD測定組-OD空白組）/（OD標(biāo)準組-OD空白組）×標(biāo)準品濃度/樣本蛋白含量

GSH-Px酶活力（U·mgprot-1）＝（OD非酶管-OD酶管）/（OD標(biāo)準管-OD空白管）×標(biāo)準濃度×稀釋倍數(shù)/反應(yīng)時間/取樣量/蛋白含量

2.5.2 結(jié)果 如圖5所示，與空白對照組比，模型組SOD和GSH-Px的活力顯著降低，MDA含量升高（P＜0.01）；與模型組比，80 μg·mL-1TCE-9可顯著提高GSH-Px的活力（P＜0.01），80 μg·mL-1TCE-6可顯著提高SOD和GSH-Px的活力，降低MDA含量（P＜0.01）。表明TCE-6可顯著抑制H2O2造成TM4細胞氧化損傷，可進一步進行體內(nèi)藥效實驗。

圖5 各組SOD活力、MDA含量、GSH-Px活力的變化（±s，n＝6）Fig 5 Changes of SOD activity，MDA content and GSH-Px activity in each group（±s，n＝6）

2.6 小鼠睪丸組織氧化指標(biāo)變化

2.6.1 方法 小鼠隨機分為對照組，賦形劑組，模型組，左卡尼汀組，VE組及TCE-6低、中、高劑量給藥組（L-TCE-6、M-TCE-6和H-TCE-6），每組12只。除對照組及賦形劑組外，各組給予2.5 mg·kg-1DEHP灌胃7 d制備雄性小鼠氧化損傷模型。DEHP灌胃結(jié)束后，對照組給予蒸餾水，賦形劑組給予玉米油，左卡尼汀組給予500 mg·kg-1左卡尼汀，VE組給予100 mg·kg-1VE，TCE-6低、中、高劑量給藥組（L-TCE-6、M-TCE-6和H-TCE-6）分別給予300、600、900 mg·kg-1TCE-6，連續(xù)灌胃給藥28 d。末次給藥后，禁食過夜。第29日處死小鼠后完整地取出睪丸樣本，剝?nèi)ブ車闹竞徒Y(jié)締組織。按照檢測試劑盒說明書要求，分別檢測各組睪丸組織中 SOD、GSH-Px活力及MDA含量。

2.6.2 結(jié)果 如圖6所示，與對照組相比，DEHP睪丸組織勻漿中SOD、GSH-Px活力顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，給予M-TCE-6組SOD、GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05）；H-TCE-6組SOD、GSH-Px活力顯著升高，MDA含量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明TCE-6可通過降低MDA含量，提高SOD和GSH-Px活力起到抗氧化損傷作用。

圖6 各組SOD活力、MDA含量、GSH-Px活力變化（±s，n＝12）Fig 6 Changes of SOD activity，MDA content and GSH-Px activity in each group（±s，n＝12）

2.7 氧化相關(guān)基因相對表達量的測定

2.7.1 方法 于冰上取“2.6.1”項下收集的睪丸組織樣本，根據(jù)RNAiso Plus試劑盒說明提取總RNA，測定總RNA的濃度和純度，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。合成的cDNA進行qRT-PCR分析。采用LightCycler 480 實時系統(tǒng)進行聚合酶鏈反應(yīng)并測量mRNA的相對表達量。反應(yīng)條件 95℃ 30 s，隨即40個循環(huán)聚合酶鏈反應(yīng)，循環(huán)溫度方案：95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s。循環(huán)結(jié)束后，95℃溫育5 s，60℃溫育1 min，之后保持95℃。以Gapdh作為內(nèi)參基因、氧化相關(guān)基因Nrf2、SOD2、SOD3的引物序列見表3。

表3 qRT-PCR分析基因引物序列 Tab 3 Primers analyzed by qRT-PCR

2.7.2 結(jié)果 通過qRT-PCR檢測3個關(guān)鍵氧化相關(guān)基因表達水平（見圖7）。與對照組相比，DEHP誘導(dǎo)后Nrf2、SOD2及SOD3mRNA相對表達水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，給予600、900 mg·kg-1TCE-6可顯著上調(diào)Nrf2、SOD2及SOD3mRNA相對表達水平（P＜0.05）；300 mg·kg-1TCE-6可顯著上調(diào)Nrf2和SOD2mRNA相對表達水平（P＜0.05）。結(jié)果提示，TCE-6可能通過調(diào)節(jié)Nrf2、SOD2及SOD3mRNA的表達發(fā)揮抗生殖系統(tǒng)氧化損傷活性。

圖7 TCE-6對氧化相關(guān)基因的相對表達量的影響（±s，n＝12）Fig 7 Effect of TCE-6 on the relative expression of oxidation-related genes（±s，n＝12）

2.8 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 25.0版統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以均值±標(biāo)準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)作圖均由 GraphPad Prism 6.0 軟件生成。

3 討論

3.1 模型選擇依據(jù)

H2O2誘導(dǎo)是目前最為常用的細胞氧化損傷造模方式。H2O2易穿透細胞膜，可與細胞內(nèi)Fe2＋反應(yīng)產(chǎn)生高毒性的羥自由基，也可通過氧化蛋白質(zhì)、DNA等產(chǎn)生過量自由基或引發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷導(dǎo)致組織損傷和細胞死亡[24-25]。TM4細胞是位于生精小管內(nèi)的一種細胞，為生殖細胞提供生存和減數(shù)分裂過程中所需的營養(yǎng)，維持TM4細胞的穩(wěn)態(tài)對于精子的發(fā)生及正常功能有著至關(guān)重要的作用。因此藥物對TM4細胞所產(chǎn)生的作用，可直接反映該藥作用于生殖系統(tǒng)的效果，TM4細胞存活率變化對于巴西海木藥效部分的篩選具有重要意義。故本實驗采用H2O2誘導(dǎo)TM4細胞氧化損傷模型篩選巴西海木提取物。經(jīng)研究表明，TCE-6可以顯著提高H2O2損傷后的細胞存活率以及SOD、GSH-Px活力；顯著降低MDA含量，故篩選出TCE-6進行后續(xù)動物模型藥效評價。

多項研究表明，鄰苯二甲酸鹽可以誘導(dǎo)睪丸組織氧化應(yīng)激，導(dǎo)致生殖細胞DNA損傷和線粒體功能受損，降低與睪酮合成相關(guān)的基因活性，導(dǎo)致睪丸組織功能和精子發(fā)育受損[26-28]。DEHP對男性生殖健康具有較強的毒性作用，通過干擾生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，降低精子活力，減少精子數(shù)量，導(dǎo)致睪丸等實質(zhì)器官萎縮和形態(tài)異常[4-5，29]，引發(fā)氧化應(yīng)激是其產(chǎn)生生殖系統(tǒng)毒性的主要機制。基于DEHP的危害及機制，本實驗采用DEHP誘導(dǎo)的雄性小鼠生殖損傷模型驗證TCE-6的藥效活性。

3.2 抗氧化活性研究結(jié)果

隨著對氧化應(yīng)激的深入研究，已確定其與許多疾病密切相關(guān)，例如各種炎癥損傷、中風(fēng)[30]以及男性不育癥[31-32]等。當(dāng)機體發(fā)生氧化應(yīng)激時，會驅(qū)動一系列病理反應(yīng)，所產(chǎn)生的活性氧類與抗氧化系統(tǒng)失衡。對于生殖系統(tǒng)而言，這種失衡會導(dǎo)致生殖細胞損傷，睪丸能量供應(yīng)受阻，從而對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生實質(zhì)傷害[33-35]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量的大小可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細胞和組織損傷的程度[36]。SOD和GSH-Px是抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，能夠清除機體內(nèi)過多的MDA，具有保護細胞和組織的作用，其活力的高低間接反映了組織抗氧化應(yīng)激能力[37]。DEHP誘導(dǎo)后睪丸組織中MDA含量顯著提高，GSH-Px和SOD活力顯著降低，說明睪丸組織產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，且不能有效清除活性氧自由基，睪丸組織發(fā)生氧化損傷。

目前藥理學(xué)研究證實巴西海木提取物在神經(jīng)系統(tǒng)上具有較好的抗氧化損傷活性，對于氧化標(biāo)志物SOD、MDA以及谷胱甘肽（GSH）、氧化谷胱甘肽（GSSG）、過氧化氫酶（CAT）和蛋白質(zhì)羰基（PCGs）水平均有改善作用[5-9]。本研究以生殖系統(tǒng)為切入點探究其抗氧化活性，檢測了氧化與抗氧化反應(yīng)的標(biāo)志物。結(jié)果表明900 mg·kg-1TCE-6可通過降低睪丸組織MDA含量，提高SOD和GSH-Px活力，調(diào)節(jié)睪丸組織抗氧化酶水平，抑制睪丸組織脂質(zhì)過氧化損傷。

qRT-PCR研究相關(guān)基因的活性發(fā)現(xiàn)給藥后Nrf2、SOD2和SOD3mRNA表達水平顯著提高。激活SOD酶活性途徑可促進SOD的抗氧化酶的生成，調(diào)控氧化物質(zhì)水平，減少ROS的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)O2-水平[38]，從而減少氧化應(yīng)激損傷，維持組織的正常功能。Nrf2是抗氧化防御過程中主要的調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)下游抗氧化酶的表達，維持生物體內(nèi)氧化/抗氧化水平的平衡，其含量受到上游KELCH樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Keap1）等信號分子介導(dǎo)的泛素化或者蛋白酶體途徑的調(diào)節(jié)。靜息狀態(tài)下，Nrf2與胞質(zhì)中的Keap1相結(jié)合，處于非活性狀態(tài)；當(dāng)機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)后轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，激活下游抗氧化蛋白基因的表達，以減少氧化損傷[39-42]。TCE-6可能通過促進睪丸組織內(nèi)Keap1-Nrf2偶聯(lián)體解離，增加Nrf2核轉(zhuǎn)位及表達，進而激活下游SOD、GSH-Px等抗氧化酶轉(zhuǎn)錄，增強抗氧化損傷能力。

3.3 總結(jié)與不足

本研究表明TCE-6具有較好的抗生殖系統(tǒng)氧化損傷活性。通過H2O2損傷TM4細胞模型篩選出TCE-6作為其抗生殖系統(tǒng)氧化損傷的活性部位，通過DEHP損傷雄性小鼠模型驗證了該部分體內(nèi)抗生殖系統(tǒng)損傷活性，并發(fā)現(xiàn)該活性可能是通過上調(diào)SOD酶家族表達和調(diào)節(jié)Nrf2信號通路實現(xiàn)的。但由于睪丸組織行使功能的機制復(fù)雜多變，由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡和線粒體能力代謝失衡有可能協(xié)同氧化應(yīng)激共同損傷睪丸組織[43]，本研究結(jié)果不能完全推論出巴西海木的作用機制。因此，下一步將深入探究巴西海木抗凋亡以及維護線粒體功能等的作用，綜合評價其生殖系統(tǒng)的保護作用機制。