柯漁洲 王平松 段麗麗 莫澤君 何 軼 喻奇?zhèn)?熊 晶 劉仁祥,*

(1 貴州大學(xué)煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025； 2 貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州 畢節(jié) 551700)

胞質(zhì)雄性不育是由核基因組與細(xì)胞質(zhì)基因組共同控制的、表現(xiàn)出雄蕊不能產(chǎn)生有活力的花粉而雌蕊能正常授粉結(jié)實(shí)的母系遺傳現(xiàn)象，普遍存在于多種植物中[1-2]。目前，我國煙草雜交種和不育系種植越發(fā)廣泛，培育煙草不育系和雜交種品種能促進(jìn)雜種優(yōu)勢的利用，不僅可以省去人工去雄環(huán)節(jié)，而且能明顯提高雜交種純度和制種效率[3]。但花粉的形成和發(fā)育受多重因素的影響，雄性不育形成的分子機(jī)制極其復(fù)雜。大多數(shù)線粒體蛋白由核基因編碼，并在細(xì)胞質(zhì)的核糖體上合成前體蛋白，經(jīng)線粒體膜上的TOM復(fù)合體(translocase of the outer mitochondrial membrane)通道進(jìn)入線粒體內(nèi)部[4]，且線粒體作為主要供能單位提供細(xì)胞代謝活動所需的90%的能量。因此，通過線粒體蛋白組學(xué)探究煙草胞質(zhì)雄性不育的形成機(jī)制具有重要意義。

在煙草雄性不育性的成因研究中，前人主要從細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面比較小孢子發(fā)育的異同[5-7]，明確其敗育的方式和時(shí)期。目前已有研究利用線粒體基因組重測序技術(shù)挖掘胞質(zhì)雄性不育基因[8-10]，先后發(fā)現(xiàn)了orf768a[11]、atp6[12]、orf25[13]、atp9[14]、ms1[15]等多個(gè)不育候選基因，利用基因剪輯技術(shù)進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，表明胞質(zhì)雄性不育與線粒體存在密切關(guān)系[16-18]，但對煙草胞質(zhì)雄性不育形成的分子機(jī)制鮮見報(bào)道。因此，本研究選用煙草雄性不育系云煙87(MSYY87)及其保持系云煙87(YY87)為試驗(yàn)材料，利用石蠟切片結(jié)合線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)分析方法，探究煙草胞質(zhì)雄性不育形成的分子機(jī)制，明確線粒體蛋白的表達(dá)模式，以期為揭示煙草胞質(zhì)雄性不育的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以煙草雄性不育系云煙87及其同核異質(zhì)保持系為試驗(yàn)材料，材料由貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。于2021年在安順市西秀區(qū)貴州大學(xué)煙草科研基地種植，采用3次重復(fù)隨機(jī)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。在移栽后25、30、35、40、45 d的花芽分化時(shí)期選取長勢均勻的煙株6株，其中3株取頂端5 cm處的花芽在甲醛乙酸乙醇固定液(formaldehyde-acetic acid-ethanol，F(xiàn)AA)中固定，用于石蠟切片觀察，切片厚度8～10 μm，番紅固綠對染，加拿大樹脂封片，拍照觀察。另外3株立刻用液氮保存，后置于-80℃低溫冰箱，后續(xù)用于線粒體蛋白分析試驗(yàn)。

1.2 花芽線粒體蛋白的提取和質(zhì)檢

選擇分化過程中出現(xiàn)形態(tài)差異時(shí)期的煙草花芽作為提取線粒體蛋白的材料。采用GMS30034.4v.4線粒體蛋白提取試劑盒(GENMED SCIENTIFICS INC，美國)提取花芽總線粒體蛋白。使用Bradford法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品的蛋白濃度。采用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，凝膠使用eStain LG蛋白染色儀(金斯瑞生物科技有限公司，重慶)進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色后，應(yīng)用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)成像。

1.3 TMT標(biāo)記和液質(zhì)檢測

6個(gè)蛋白樣品經(jīng)胰蛋白酶Trypsin-TPCK酶切后，分別加入100 mmol·L-1的四乙基溴化銨(tetraethyl ammonium bromide, TEAB)緩沖液和含有不同同位素的串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tages,TMT)標(biāo)記的乙腈，渦流混勻，室溫反應(yīng)1 h，加入5%羥胺終止反應(yīng)15 min，然后凍干于-80℃保存。使用1100 HPLC高壓液相色譜系統(tǒng)(Agilent，美國)進(jìn)行組分分離和液相色譜檢測，依次每隔1 min收集洗脫液到1～15號離心管中，然后收樣60 min，收集好后真空冷凍干燥抽干。對樣品進(jìn)行液相二級質(zhì)譜(liquid chromatorgraphy-mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS)分析，質(zhì)譜上機(jī)條件：一級圖譜(MS)分辨率設(shè)為 70 000， 自動增益控制值設(shè)為1e6，最大注射時(shí)間為50 ms；質(zhì)譜掃描設(shè)定為全掃描荷質(zhì)比(m/z)范圍300～1 600， 并對其中10個(gè)最高峰進(jìn)行二級圖譜(MS-MS)掃描；所有圖譜采集使用數(shù)據(jù)依賴型的正離子模式下的高能碰撞裂解完成，碰撞能量設(shè)為32；MS/MS-MS的分辨率設(shè)為17 500，自動增益控制設(shè)為2e5，離子最大累積時(shí)間為80 ms；動態(tài)排除時(shí)間設(shè)為30 s，最終生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)。

1.4 線粒體蛋白鑒定

利用Proteome Discoverer 2.4軟件對檢索結(jié)果進(jìn)一步過濾，可信度在99%以上的譜肽為有效圖譜數(shù)(peptide spectrum matches，PSM)，至少包含一個(gè)肽段的蛋白為可信蛋白，保留可信的有效圖譜肽和蛋白，通過錯誤比例(false discovery rate，F(xiàn)DR)值驗(yàn)證，去除FDR大于0.01的肽段和蛋白。使用煙草基因組結(jié)合uniprot-proteome_UP000084051.fasta作為搜索數(shù)據(jù)庫對鑒定到的蛋白進(jìn)行功能注釋和代謝通路注釋。

1.5 蛋白定量分析和差異表達(dá)蛋白功能分析

根據(jù)原始下機(jī)的圖譜峰面積可以得到各個(gè)樣品中每個(gè)PSM的相對定量值，再根據(jù)鑒定出的unique肽段中所包含的PSM定量信息校正得到unique肽段的相對定量值，最后根據(jù)每個(gè)蛋白質(zhì)包含的所有unique肽段的定量信息校正得到每個(gè)蛋白的相對定量值。將每個(gè)蛋白在比較樣品中表達(dá)量與對照組表達(dá)量的比值作為差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)。將每個(gè)蛋白在樣品中的相對定量值進(jìn)行T檢驗(yàn)，P值為顯著性指標(biāo)。當(dāng)FC≥1.2，且P≤0.05時(shí)，蛋白表達(dá)量上調(diào)；當(dāng)FC≤0.83，且P≤0.05時(shí)，蛋白表達(dá)量下調(diào)。針對篩選出來的差異蛋白進(jìn)行基因注釋(gene ontology，GO)和代謝通路富集(kyoto encylopedia of genes and genomes，KEGG)分析，與所有鑒定到的蛋白背景相比，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)方法計(jì)算P值，以P≤0.05為閾值，滿足此條件的條目即為在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的條目。

2 結(jié)果與分析

2.1 不育系與保持系的花器官形態(tài)特征

由花器官形態(tài)特征觀察可以看出，MSYY87雄蕊花絲缺失或畸變、無花藥，柱頭變粗并出現(xiàn)部分彎曲，表現(xiàn)為完全雄性不育(圖1-A)。而YY87花絲發(fā)育正常，花藥飽滿，花藥略高于柱頭(圖1-B)，能正常進(jìn)行自花授粉。

注：A：不育系；B：保持系。Note: A: Sterile line. B: Fertile line.圖1 MSYY87和YY87煙草花器官形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of floral organs of tobacco MSYY87 and YY87

2.2 不育系與保持系的小孢子發(fā)育形態(tài)觀察

隨著葉片數(shù)的增加，煙株由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長，這段生理生化變化被稱為花芽分化過程。觀察煙草MSYY87及YY87的花芽石蠟切片發(fā)現(xiàn)，MSYY87在花芽分化起始階段(圖2-A)能正常分化出花序原基；但在雌雄蕊原基分化時(shí)期(圖2-B)，只有3個(gè)雄蕊原基且相互粘連，形態(tài)異常，不能正常產(chǎn)生孢原細(xì)胞；花粉母細(xì)胞時(shí)期(圖2-C)，絨氈層細(xì)胞提前發(fā)生程序性死亡，使孢原細(xì)胞不能正常分裂為花粉母細(xì)胞，最終花絲畸變或雄蕊缺失(圖2-D)，無花藥。

注：a～d: 不育系；e～h: 保持系。a、e：花序原基形成期；b、f：雌雄蕊原基分化時(shí)期花芽橫切面×200；c、g：花粉母細(xì)胞時(shí)期×200；d、h：花粉成熟期(d×50,h×200)。TP:花序原基；PP：雌蕊原基；SP：雄蕊原基；E:表皮層；En:內(nèi)皮層；ML:中間層；T：絨氈層；P:雌蕊；S:雄蕊；PG:花粉粒。Note: a～d: Sterile line. e-h: Maintainer line. a,e: Inflorescence primordium formation stage. b,f: Cross section of flower bud at the primordia differentiation stage×200. c,g: Pollen mother cell stage×200. d,h: Pollen maturity stage(d×50, h×200). TP: Inflorescence primordium. PP: Pistil primordium. SP: Stamen primordium. E: Epidermis. En: Endodermis. ML: Middle layer. T:Tapetum. P: Pistil. S: Stamens. PG: Pollen grains.圖2 煙草MSYY87與YY87小孢子發(fā)育形態(tài)差異Fig.2 Morphological differences of microspore development between MSYY87 and YY87 in tobacco

YY87在花序原基形成期(圖2-E)正常分化出花序原基，此時(shí)煙株出葉速度快，隨著發(fā)育進(jìn)行，逐步分化出1個(gè)雌蕊原基和5個(gè)雄蕊原基，隨著孢原細(xì)胞繼續(xù)平周分裂產(chǎn)生造胞細(xì)胞；造胞細(xì)胞(圖2-G)能分裂形成花粉母細(xì)胞，花粉母細(xì)胞繼續(xù)分裂產(chǎn)生小孢子，在藥室中有成熟花粉(圖2-H)。選擇在雌雄蕊原基分化時(shí)期的花芽來做線粒體蛋白組分析。

2.3 蛋白的質(zhì)檢與分析鑒定

線粒體蛋白的SDS-PAGE結(jié)果顯示，各樣品的條帶清晰，說明提取線粒體蛋白質(zhì)量較好，未受到污染(圖3)。利用可信蛋白的表達(dá)量進(jìn)行各樣本間的主成分分析(圖4)，從不同維度可發(fā)現(xiàn)MSYY87與YY87樣品間存在明顯差異，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。再通過數(shù)據(jù)庫搜索，鑒定到二級圖譜(MS-MS)總數(shù) 285 815 個(gè)，有效圖譜數(shù)(PSM)5 828個(gè)，肽段(peptides)數(shù) 3 580 個(gè)，蛋白數(shù)(protein groups)1 251個(gè)。

圖3 煙草花芽線粒體蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE map of mitochondrial protein from tobacco flower bud

圖4 煙草花芽線粒體蛋白質(zhì)樣品的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of mitochondrialprotein samples from tobacco flower buds

2.4 差異表達(dá)蛋白

根據(jù)限制條件篩選差異表達(dá)蛋白，在注釋到的 1 251 個(gè)蛋白中，對每個(gè)蛋白質(zhì)差異倍數(shù)以2為底取對數(shù)，將P值以10為底取對數(shù)的絕對值，繪制火山圖(圖5)以分析可信蛋白在不同樣品間的上調(diào)、下調(diào)情況。2組樣品無顯著差異的蛋白為735個(gè)，差異表達(dá)蛋白總數(shù)為113個(gè)，其中CMSYY87較YY87顯著上調(diào)的蛋白為48個(gè)，顯著下調(diào)的蛋白為65個(gè)。說明MSYY87與YY87線粒體蛋白的表達(dá)存在差異，上述差異蛋白可能是導(dǎo)致不育系產(chǎn)生的關(guān)鍵原因，進(jìn)一步推測其可能在不育系的線粒體中發(fā)生代謝紊亂。

圖5 MSYY87與YY87差異表達(dá)蛋白火山圖Fig.5 Volcano diagram of differentially expressed proteinsof MSYY87 and YY87

2.5 差異蛋白的GO功能富集分析

差異蛋白GO顯著性富集分析主要包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組分以及分子功能。經(jīng)GO功能富集分析，兩類煙草樣品中的113個(gè)蛋白去除僅包含1個(gè)差異蛋白的條目，剩余30個(gè)可靠的GO條目。其中，達(dá)到顯著富集(P<0.05)水平的GO條目為30個(gè)，屬于生物學(xué)過程10個(gè)、細(xì)胞組分10個(gè)、分子功能10個(gè)(圖6)。生物過程類別分別為糖酵解過程(glycolytic process)、脂質(zhì)運(yùn)輸過程(lipid transport)、未折疊蛋白細(xì)胞響應(yīng)(cellular response to unfolded protein)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對未折疊蛋白響應(yīng)(endoplasmic reticulum unfolded protein response)、重折疊蛋白過程(protein refolding)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)泛素依賴性降解途徑(ubiquitin-dependent ERAD pathway)、蛋白重折疊依賴性伴侶結(jié)合蛋白(chaperone cofactor-dependent protein refolding)、脂類代謝過程(lipid catabolic process)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急響應(yīng)(response to endoplasmic reticulum stress)。

注釋到細(xì)胞組分，分別包括細(xì)胞溶質(zhì)(cytosol)、細(xì)胞膜(membrance)、細(xì)胞核(nucleus)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜泡(endoplasmic reticulum lumen)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜互作復(fù)合體(endoplasmic reticulum lumen chaperone complex)、液泡(vacuole)、磷酸丙酮酸水合酶復(fù)合體(phosphopyruvate hydratase complex)及完整地膜組分(integral component of membrane)。

注釋到的分子功能，分別為營養(yǎng)庫活性(nutrient reservoir activity)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶活性(protein disulfide isomerase)、酰基甘油脂肪酶活性(acylglycerol lipase activity)、錯誤折疊結(jié)合蛋白(misfolded protein binding)、折疊蛋白伴侶(protein folding chaperone)，磷脂酶活性(phospholipase activity)、及熱休克蛋白結(jié)合物(heat shock protein binding)、磷酸丙酮酸水合酶活性(phosphopyruvate hydratase activity)、二磷酸果糖醛縮酶活性(fructose-bisphosphate aldolase)及葡萄糖醛酸脂脫羧酶活性(UDP-glucuronate decarboxylase activity)。

圖6 GO富集柱狀圖Fig.6 Histogram of GO enrichment

2.6 差異蛋白的KEGG代謝通路分析

通過對差異蛋白進(jìn)行KEGG代工謝通路分析(圖7)，主要分為有機(jī)物代謝途徑、遺傳物質(zhì)代謝及次生代謝物合成和抗氧化代謝三類。有機(jī)物代謝主要為細(xì)胞呼吸的系列反應(yīng)，主要包括糖酵解和糖原異生途徑(glycolysis/gluconeogenesis)、果糖和甘露糖代謝(fructose and mannose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)、光合固碳有機(jī)體(carbon fixation in photosynthetic organisms)、丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)、三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid, TCA)、甘油酯代謝(glycerolipid metabolism)；遺傳物質(zhì)代謝途徑主要包括RNA降解(RNA degradation)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工蛋白過程(protein processing in endoplasmic reticulum)、蛋白外運(yùn)(protein export)、蛋白酶體(proteasome)、色氨酸代謝(tryptophan metabolism)、組氨酸代謝(hisidine metabolism)；次生代謝產(chǎn)物合成和抗氧化代謝主要包括過氧化物酶體(peroxisome)、抗壞血酸和醛達(dá)酸代謝(ascorbate and aldarate metabolism)、谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism)、類黃酮生物合成(flavonoid biosynthsis)、苯丙素生物合成(phenylpropanoid biosynthsis)。

圖7 KEGG富集氣泡圖Fig.7 KEGG enrichment bubble diagram

3 討論

通過煙草花芽的石蠟切片結(jié)果可知，MSYY87在發(fā)芽分化早期(雌雄蕊原基分化期)開始出現(xiàn)小孢子發(fā)育異?，F(xiàn)象，這與前人的煙草雄性敗育發(fā)生在雄蕊原基分化后至孢原細(xì)胞形成前的觀點(diǎn)基本一致[5-6]。因此選用雌雄蕊分化時(shí)期的花芽進(jìn)行線粒體蛋白組學(xué)分析。TMT標(biāo)記是一種高分辨率高通量的蛋白定量檢測技術(shù)[19]。本試驗(yàn)通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)TMT標(biāo)記結(jié)合高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和生物信息學(xué)分析，共鑒定出1 251個(gè)蛋白，在MSYY87和YY87的花芽中表達(dá)差異顯著的線粒體蛋白113個(gè)，其中48個(gè)蛋白在MSYY87的花芽中高表達(dá)，65個(gè)蛋白在YY87的花芽高表達(dá)。兩類樣品中表達(dá)差異的蛋白富集到7個(gè)類別細(xì)胞組分，分別為細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜復(fù)合體及細(xì)胞液泡。這與線粒體蛋白要經(jīng)核基因在細(xì)胞質(zhì)核糖體上翻譯、加工成前體蛋白，再運(yùn)輸?shù)阶饔貌课痪€粒體的觀點(diǎn)[20]相一致，說明本研究采用的線粒體蛋白組研究方法可行，鑒定出的差異蛋白具有較高的可信度。

GO功能富集分析主要注釋到生物過程中糖酵解和脂的運(yùn)輸代謝，脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程通常在線粒體基質(zhì)中進(jìn)行[21-22]，對呼吸代謝有著重要的意義；由于線粒體相關(guān)呼吸代謝酶差異表達(dá)，致使線粒體代謝紊亂[23-24]，注釋到的分子功能中營養(yǎng)庫活性、磷酸丙酮酸水合酶及二磷酸果糖醛縮酶等呼吸酶，推測線粒體代謝紊亂與煙草雄性不育有關(guān)。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的修飾影響其功能和作用。已有研究報(bào)道二硫鍵異構(gòu)酶亞基[25-26]與熱休克蛋白[27]參與協(xié)同催化氧化蛋白折疊修飾過程，在擬南芥[27]中線粒體熱休克同源蛋白(mtHSC70-1)缺失突變體的花形態(tài)、花藥發(fā)育存在明顯缺陷，導(dǎo)致育性顯著減低，且經(jīng)蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在線粒體呼吸中電子傳遞和蛋白折疊的生物學(xué)過程發(fā)生改變。注釋到的生物過程有未折疊蛋白細(xì)胞反應(yīng)過程、未折疊蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)反應(yīng)、蛋白質(zhì)重折疊過程、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)泛素依賴性降解途徑、重折疊蛋白的伴侶蛋白復(fù)合體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急反應(yīng)過程，及注釋到分子功能中的蛋白二硫鍵異構(gòu)酶活性、錯誤折疊結(jié)合蛋白及熱休克蛋白，說明不育系中的線粒體蛋白的修飾受到影響。當(dāng)線粒體受到細(xì)胞內(nèi)外的脅迫刺激，會通過HDA-1調(diào)控線粒體未折疊蛋白反應(yīng)的途徑來維持線粒體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和功能，當(dāng)線粒體受損信號傳遞至細(xì)胞核，可促進(jìn)核編碼的應(yīng)激基因上調(diào)表達(dá)，從而保護(hù)和修復(fù)受損線粒體[28]。由此即推測，當(dāng)煙草不育系線粒體基因與核基因之間互作不協(xié)調(diào)的信號不能傳遞給細(xì)胞核，則不能促進(jìn)核編碼的應(yīng)激基因上調(diào)表達(dá)，修復(fù)線粒體功能紊亂中斷，從而影響小孢子的形成和發(fā)育。

注：圖中字符表示酶或者亞基。紅色表示上調(diào)蛋白，綠色表示下調(diào)蛋白。Note: The characters in the figure indicate enzymes or subunits. Red represents up-regulated proteins and green represents down-regulated proteins.圖8 MSYY87花芽線粒體代謝紊亂圖Fig.8 Mitochondrial metabolic disorders in sterile lines

植物呼吸代謝是在線粒體中將有機(jī)物逐步氧化并釋放能量供其利用的生物學(xué)過程[29]。通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，磷酸戊糖途徑的6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶G6PI(glucose-6-phosphate isomerase)、1,6-二磷酸果糖醛縮酶F16BA(fructose-bisphosphate aldolase)、轉(zhuǎn)醛酶T(transaldolase)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶G6PD(6-phosphogluconate dehydrogenase)都下調(diào)表達(dá)，推測磷酸戊糖途徑代謝受阻(圖8)。首先糖酵解途徑中磷酸己糖異構(gòu)酶(GPI)、果糖醛縮酶FA(fructose aldolase)、烯醇化酶E(enolase)、乙醇脫氫酶AD(alcohol dehydrogenase)都表現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，說明丙酮酸生成受到抑制，其次在三羧酸循環(huán)途徑中蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase，MD)和異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，ID)下調(diào)表達(dá)，然后在氧化磷酸化過程中焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase，IP)表達(dá)下調(diào)，ATP合酶的F1中α亞基(F-type H+-transporting ATPase subunit alpha)和δ亞基(ATPase subunit delta)蛋白表達(dá)上調(diào)，說明ATP合酶結(jié)構(gòu)異常，最終結(jié)果說明由于蛋白酶下調(diào)和亞基異常導(dǎo)致不育系線粒體呼吸代謝過程ATP合成受阻。這與Wang等[30]研究相似，即細(xì)胞缺失C9orf72線粒體蛋白后，在合成ATP的氧化磷酸化途徑活性下調(diào)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，其原因是C90r72蛋白通過招募抗增值蛋白(prohibitin,PHB)來阻斷氧化磷酸化中復(fù)合體I組裝因子TIMMDC1的降解，穩(wěn)定復(fù)合體I的有效組裝和維持正常產(chǎn)能反應(yīng)。

植物線粒體中RNA編輯調(diào)控線粒體PPR蛋白的形成[31]。RNA的穩(wěn)態(tài)由轉(zhuǎn)錄速率和降解速率之間的平衡決定，核糖體RNA的穩(wěn)定可能受核糖體蛋白裝配過程影響[32]。本研究發(fā)現(xiàn)核糖體RNA的大亞基L4e(large subunit ribosomal protein L4e)、L7(large subunit ribosomal protein L7)及小亞基中SAe(small subunit ribosomal protein SAe)的表達(dá)異常，調(diào)控RNA降解的烯醇酶EL(enolase)下調(diào)表達(dá)(圖8)，說明核糖體RNA失調(diào)會影響線粒體蛋白裝配。多數(shù)線粒體蛋白由核基因編碼[33]，經(jīng)核糖體翻譯成的前體蛋白由線粒體外膜TOM復(fù)合體通道進(jìn)入線粒體內(nèi)，當(dāng)線粒體蛋白導(dǎo)入受阻，通過改變蛋白酶體活性和伴侶蛋白水平調(diào)控線粒體蛋白表達(dá)[34-36]。研究發(fā)現(xiàn)，Ubx2與線粒體膜上TOM復(fù)合體結(jié)合并通過蛋白酶體去除未成功導(dǎo)入的前體蛋白，維持TOM通道的流暢[4]。本研究發(fā)現(xiàn)不育系中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工酶(endoplasmic reticulum chaperone BiP)、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide-isomerase，PDIs)和磷脂酶(phospholipase D，PLD)均下調(diào)表達(dá)，使線粒體蛋白的修飾和導(dǎo)入受阻，且蛋白酶復(fù)合體的PA700亞基Rpt3(proteasome regulatory subunit T3)和20S小亞基α5(proteasome subunit alpha 5)表達(dá)下調(diào)(圖8)，導(dǎo)致蛋白酶體功能失調(diào)，不能降解未導(dǎo)入線粒體的前體蛋白，使線粒體蛋白的導(dǎo)入受阻而功能紊亂，不能維持花粉形成時(shí)細(xì)胞快速分裂分化所需的能量而小孢子形成中斷。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，煙草胞質(zhì)雄性不育發(fā)生在發(fā)芽分化的雌雄蕊原基分化時(shí)期；不育系在線粒體蛋白修飾和導(dǎo)入過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工酶(BiP)、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDIs)和磷脂酶(PLD)等下調(diào)表達(dá)，說明線粒體蛋白導(dǎo)入受阻，引起線粒體功能紊亂。存在線粒體呼吸代謝中6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)、蘋果酸脫氫酶(MD)和焦磷酸酶(IP)等表達(dá)下調(diào)，說明呼吸代謝受阻。由此推測，煙草胞質(zhì)雄性不育由于線粒體蛋白的合成、修飾及導(dǎo)入受阻，致使線粒體功能紊亂，即在呼吸代謝途經(jīng)中蛋白酶下調(diào)表達(dá)，抑制了ATP的合成，從而不能為小孢子形成過程中的快速分裂分化提供充足的能量和營養(yǎng)物質(zhì)，抑制了小孢子的形成和發(fā)育，表現(xiàn)為雄性不育。