張光輝，王曉馳，楊笑愷

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 712046)

番瀉葉為豆科山扁豆屬植物狹葉番瀉或尖葉番瀉的小葉，又稱旃那葉、瀉葉、泡竹葉，原產(chǎn)于干熱地帶，在我國臺灣、廣西、云南均有引種栽培。番瀉葉味甘苦，具有瀉熱行滯、利水通便、止血、肌肉松弛與解痙等功效[1-2]。黃酮類化合物是番瀉葉的活性成分之一，具有促進血液循環(huán)、降低膽固醇、改善心腦血管疾病、治療腎病、降低血糖、抗疲勞、抗抑郁、抗骨質(zhì)疏松、抗胃潰瘍、預(yù)防癌癥、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用[3-9]。此外，黃酮類化合物還具有抗氧化活性，可以有效清除體內(nèi)的氧自由基，如花青素可以抑制油脂性過氧化物的全階段溢出，這種抗氧化作用可以阻止細胞退化、衰老[10-11]。番瀉葉中黃酮類化合物含量可觀，但國內(nèi)外對番瀉葉總黃酮的提取和抗氧化活性研究鮮有報道。鑒于此，作者在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化番瀉葉總黃酮的提取工藝，通過測定其對DPPH自由基的清除率來評價其體外抗氧化活性，并對抗氧化實驗進行方法學(xué)考察，擬為番瀉葉總黃酮的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

番瀉葉，市售，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室王紀(jì)濤高級實驗師鑒定為豆科山扁豆屬植物番瀉葉。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；DPPH自由基(2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基，純度>98%)；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，分析純。

DFY-500型搖擺式高速萬能粉碎機，溫嶺林大機械有限公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲波儀器有限公司；TP-A200型電子天平，華志電子科技有限公司；UV-1780型紫外可見分光光度計，島津儀器有限公司；HH-2A型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，加入乙醇溶解并定容至50 mL，得0.20 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL、4.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入0.30 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min；然后加入0.30 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min；最后加入4.00 mL 1.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液，用乙醇定容到刻度，搖勻，靜置15 min，顯色；以乙醇為參比，測定510 nm處吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程：A=10.802c+0.0113(R2=0.9995)。表明蘆丁濃度在20～80 μg·L-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

1.3 番瀉葉總黃酮提取率的測定

將番瀉葉置于80 ℃烘箱中干燥6 h，粉碎，過80目篩，裝入塑封袋，保存。稱取5.00 g番瀉葉粉末置于燒杯中，按一定料液比加入乙醇，在一定溫度下超聲提取一定時間，提取液過濾，洗滌，濾液用乙醇定容至100 mL容量瓶中。移取2.50 mL提取液稀釋液加入到50 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度；再移取4.00 mL稀釋液加入到10 mL容量瓶中，按1. 2方法顯色，以空白為參比，測定510 nm處吸光度(A)。按式(1)計算番瀉葉總黃酮提取率(%)：

(1)

1.4 番瀉葉總黃酮提取工藝優(yōu)化

采用單因素實驗分別考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g∶mL，下同)、超聲溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、超聲時間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)對番瀉葉總黃酮提取率的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以超聲時間、超聲溫度、料液比為考察因素，設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面實驗，優(yōu)化番瀉葉總黃酮提取工藝。

1.5 番瀉葉總黃酮體外抗氧化活性評價

精密稱取DPPH自由基 0.010 0 g，加入乙醇超聲溶解并定容至50 mL，得濃度為0.20 mg·mL-1的DPPH自由基溶液。在最佳條件下提取番瀉葉總黃酮，提取液過濾，洗滌，濾液用95%乙醇定容至100 mL；再移取2.50 mL提取液稀釋液，用95%乙醇定容至50 mL。移取4.00 mL上述樣品溶液，加入1.50 mL 0.20 mg·mL-1DPPH自由基溶液，用95%乙醇定容至10 mL，靜置一定時間后測定517 nm處[9-11]吸光度。按式(2)計算DPPH自由基清除率(%)：

(2)

式中：A1為4.00 mL樣品溶液+1.50 mL DPPH自由基溶液+95%乙醇的吸光度；A2為4.00 mL樣品溶液+95%乙醇的吸光度；A0為95%乙醇+1.50 mL DPPH自由基溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料液比對番瀉葉總黃酮提取率的影響(圖1)

圖1 料液比對番瀉葉總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

由圖1可知，隨著料液比的減小，即提取溶劑乙醇用量的增加，番瀉葉總黃酮提取率先逐漸升高后緩慢下降，當(dāng)料液比為1∶25時，總黃酮提取率最高。因此，選擇1∶25作為響應(yīng)面實驗料液比的中心點。

2.1.2 超聲溫度對番瀉葉總黃酮提取率的影響(圖2)

圖2 超聲溫度對番瀉葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

由圖2可知，隨著超聲溫度的升高，番瀉葉總黃酮提取率先逐漸升高后緩慢下降，當(dāng)超聲溫度為70 ℃時，總黃酮提取率最高。因此，選擇70 ℃作為響應(yīng)面實驗超聲溫度的中心點。

2.1.3 超聲時間對番瀉葉總黃酮提取率的影響(圖3)

圖3 超聲時間對番瀉葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，番瀉葉總黃酮提取率先逐漸升高后緩慢下降，當(dāng)超聲時間為50 min時，總黃酮提取率最高。因此，選擇50 min作為響應(yīng)面實驗超聲時間的中心點。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果(表1)

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對表1數(shù)據(jù)進行擬合，得到二次多項式回歸模型方程:Y=3.96-0.035A+8.955×10-3B+0.11C-0.10AB+0.092AC-0.19BC-0.35A2-0.22B2-0.15C2。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Tab.1 Design and results of response surface methodologies

回歸模型的方差分析見表2。

表2 方差分析Tab.2 Variance analysis

由表2可知，回歸模型高度顯著(P<0.001)，失擬項不顯著，殘差及純誤差的數(shù)值極小，說明回歸模型的擬合度非常高，誤差較小，未知因素的影響很小，該模型具有合理性。一次項A、C對番瀉葉總黃酮提取率的影響高度顯著，B的影響顯著；交互項AB、AC、BC以及二次項A2、B2、C2對番瀉葉總黃酮提取率的影響高度顯著。各因素對番瀉葉總黃酮提取率影響的大小順序為：超聲時間(A)>料液比(C)>超聲溫度(B)。

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對番瀉葉總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對番瀉葉總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot for effect of interaction between various factors on extraction rate of total flavonoids from Cassia angustifolia leaves

響應(yīng)面3D曲面越陡峭，則該因素對番瀉葉總黃酮提取率的影響越大。由圖4可知，超聲時間對番瀉葉總黃酮提取率的影響最大，其次是料液比，超聲溫度的影響最??；兩因素交互作用均對總黃酮提取率的影響很大。對最佳工藝擬合方程求解，得到最佳提取工藝為：超聲時間50.50 min、超聲溫度67.92 ℃、料液比1∶27.6，在此條件下，番瀉葉總黃酮提取率的理論值為3.99%。

2.3 最佳工藝的驗證

根據(jù)實際操作性，將最佳提取工藝調(diào)整為：超聲時間50 min、超聲溫度68 ℃、料液比1∶28。準(zhǔn)確稱量番瀉葉粉末5.00 g，在最佳提取條件下進行3次驗證實驗，得到番瀉葉總黃酮平均提取率為3.94%，RSD值為0.54%，與理論值相差0.05%。說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的番瀉葉總黃酮提取工藝準(zhǔn)確可靠。

2.4 體外抗氧化活性評價

2.4.1 反應(yīng)時間的確定

按1.5方法測定樣品溶液與DPPH自由基溶液反應(yīng)不同時間的吸光度，結(jié)果如圖5所示。

圖5 吸光度隨反應(yīng)時間的變化曲線Fig.5 Change curve of absorbance with reaction time

由圖5可知，隨著反應(yīng)時間的延長，吸光度逐漸減小，當(dāng)反應(yīng)時間超過40 min后，吸光度趨于穩(wěn)定，說明反應(yīng)基本完全。因此，確定最佳反應(yīng)時間為40 min。

2.4.2 對DPPH自由基的清除率

按1.5方法測定4.00 mL濃度為0.039 mg·mL-1樣品溶液對DPPH自由基的清除率為60.5%，RSD值為0.26%(n=3)。說明番瀉葉總黃酮提取液對DPPH自由基的清除能力較強。

2.4.3 樣品溶液濃度對DPPH自由基清除率的影響(圖6)

圖6 樣品溶液濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of sample solution concentration on scavenging rate of DPPH free radicals

由圖6可知，樣品溶液濃度越大，對DPPH自由基的清除率越高。

2.4.4 方法學(xué)考察

精密度：取4.00 mL濃度為0.039 mg·mL-1樣品溶液，加入1.50 mL DPPH自由基溶液，按1.5方法連續(xù)測定5次吸光度，分別為0.461 7、0.461 6、0.461 6、0.461 7、0.461 7，RSD值為0.01%。表明儀器精密度較好，誤差較小。

穩(wěn)定性：取同一份樣品溶液，顯色后，每間隔2 min測定一次吸光度，共測定5次，測得吸光度分別為0.461 7、0.461 1、0.460 7、0.460 2、0.459 8，RSD值為0.16%。表明樣品溶液在顯色反應(yīng)后有較高的穩(wěn)定性。

重復(fù)性：取5份4.00 mL濃度為0.039 mg·mL-1樣品溶液，分別加入1.50 mL DPPH自由基溶液，按1.5方法測得吸光度分別為0.461 7、0.463 4、0.460 4、0.461 1、0.462 4，RSD值為0.25%。表明該方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到番瀉葉總黃酮的最佳提取工藝為：超聲時間50 min、超聲溫度68 ℃、料液比1∶28(g∶mL)，在此條件下，番瀉葉總黃酮提取率為3.94%，RSD值為0.54%(n=3)，與理論值相差0.05%；番瀉葉總黃酮具有較強的抗氧化活性，當(dāng)番瀉葉總黃酮濃度為0.039 mg·mL-1時，其對DPPH自由基的清除率為60.5%。