劉旭陽，張 慧，王仕寶，魏曉琴，向 儀

1.漢中市南鄭區(qū)食品藥品檢驗檢測中心，漢中 723000；2.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，漢中 723000；3.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院秦巴山區(qū)藥（食）用植物研究所，漢中 723000

青牛膽［Tinospora sagittata（Oliv.）Gagnep.］來源于防己科青牛膽屬植物，分布于湖北西部和西南部、陜西南部、四川東部至西南部等地區(qū)［1］。青牛膽以塊根入藥，中藥名金果欖，收載于2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》），具有清熱解毒、利咽止痛的功效［2］。青牛膽屬植物的化學(xué)成分主要有生物堿類、甾酮類、萜類、苯丙素等化合物［3-5］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，青牛膽屬植物具有多種藥理活性，心葉青牛膽具有抗氧化、抗菌、抗毒、抗應(yīng)激、降血脂、降血糖、抗癌等作用［3］，海南青牛膽具有抗骨質(zhì)疏松、抗炎、抗菌、止痛、肌肉松弛和促進血液循環(huán)的作用［6］，波葉青牛膽在安全劑量范圍內(nèi)，可降低糖尿病腎病小鼠的血糖及總膽固醇，并改善其腎功能狀態(tài)［7］，寬筋藤具有抗炎［8］及抗輻射的作用［9］。臨床常用于咽喉腫痛、癰疽疔毒、泄瀉、痢疾、脘腹疼痛等癥的治療［10］；并且其在毒蛇咬傷［11］、糖尿病和卵巢癌治療等方面也表現(xiàn)出一定的療效［4］。藥根堿和巴馬汀為小檗堿類生物堿，是青牛膽塊根中的重要成分。小檗堿類生物堿生物活性多樣，具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗炎以及調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的作用，在抗菌消炎、止瀉止痢方面有獨特的作用［12］。本文基于高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），用響應(yīng)面法優(yōu)選青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的最佳提取工藝，可為青牛膽中小檗堿類生物堿的檢測及開發(fā)、利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260B型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；UV-1900PC型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；XFB-200型高速中藥粉碎機（吉首市中誠制藥機械廠）；DS-8510DTH 型超聲清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）；ESJ50-5型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

對照品：藥根堿（編號Z05D10X104878，質(zhì)量分數(shù)為98%），鹽酸巴馬?。ň幪朲16J10X79792，質(zhì)量分數(shù)為98%），均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，天津光復(fù)精細化工研究所）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

青牛膽塊根于2020年4月15日采于陜西省漢中市寧強縣，經(jīng)王仕寶副教授鑒定為防己科青牛膽［Tinospora sagittata（Oliv.）Gagnep.］的塊根；在采集到的青牛膽塊根樣品中，選取大小適中者，常溫干燥后保存；實驗前粉碎，過3號篩，密封備用。

2 方法

2.1 色譜條件

Agilent Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；以乙腈為流動相A、3 m L·L－1的磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫程序見表1；檢測波長：225 nm；流速：1.0 m L·min－1；柱溫：25℃。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Mobile phase gradient program

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取鹽酸巴馬汀、藥根堿對照品適量，置于量瓶中，用甲醇定容，配制成鹽酸巴馬汀、藥根堿的終質(zhì)量濃度分別為165.6、115.6μg·m L－1的混合對照品溶液，置于4℃保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取青牛膽塊根粉末約1.0 g，精密稱定質(zhì)量，置于錐形瓶中，精密量取20 m L 體積分數(shù)為70%的乙醇加入錐形瓶中，精密稱定質(zhì)量，回流提取40 min，冷卻，放冷后用體積分數(shù)為70%的乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液過0.22μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

依次精密量取混合對照品溶液0.4、2.0、4.0、6.0、8.0m L，置于10 m L 量瓶中，加甲醇定容，用0.22μm 微孔濾膜過濾，依次進樣10μL，按照2.1項下色譜條件測定峰面積，見圖1。以藥根堿峰面積為縱坐標(biāo)（y）、對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，回 歸 方 程 為y1＝43.803x1＋26.66，R2＝0.999 6。結(jié)果表明，藥根堿質(zhì)量濃度在4.624～92.48μg·m L－1范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。以鹽酸巴馬汀峰面積為縱坐標(biāo)（y）、對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y2＝39.914x2－25.557，R2＝0.999 9。結(jié)果表明，鹽酸巴馬汀質(zhì)量濃度在6.624～132.48μg·m L－1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.5 精密度實驗

按照2.1項下色譜條件，取對照品溶液重復(fù)進樣6次，測得藥根堿和鹽酸巴馬汀峰面積的RSD 值分別為0.78%、0.72%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取供試品溶液，按照2.1項下色譜條件，于2、4、8、10、12、24 h分別測定藥根堿和鹽酸巴馬汀的峰面積，計算得峰面積的RSD 值分別為1.18%、0.74%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實驗

精密稱取同一樣品5份，按照2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件測定藥根堿和鹽酸巴馬汀的峰面積。計算得峰面積的RSD 分別為1.9%、1.8%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收實驗

取青牛膽樣品粉末0.5 g，共6份，精密稱定，精密加入藥根堿和鹽酸巴馬汀對照品適量，按照2.3項下方法制備供試品溶液，進樣10μL，按照2.1項下色譜條件測定，分別計算藥根堿和鹽酸巴馬汀的平均加樣回收率和RSD 值。結(jié)果見表2。由表2 可知，藥根堿和鹽酸巴馬汀的平均加樣回收率分別為101.6%、102.6%，RSD 值分別為1.51%、1.11%。

表2 藥根堿、鹽酸巴馬汀加樣回收率實驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery test of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride

2.9 單因素實驗

考察了浸漬法、回流提取、超聲提取對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響。結(jié)果顯示，回流提取的效果較好，故本實驗選擇回流提取進行操作。以藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量之和為考察指標(biāo)，采用單因素法分別對提取溶劑、液料比、提取時間3個因素進行考察。

2.9.1 提取溶劑 在參照文獻中方法的基礎(chǔ)上，分別以不同體積分數(shù)的甲醇、乙醇為提取溶劑，固定液料比20∶1，加熱回流提取40 min，制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行藥根堿和鹽酸巴馬汀含量的測定。結(jié)果表明，將體積分數(shù)為70%的乙醇、體積分數(shù)為70%的甲醇作為提取溶劑時提取量較高，考慮到乙醇較為安全、經(jīng)濟、環(huán)保，故選擇將體積分數(shù)為70%的乙醇作為提取溶劑。見表3。

表3 提取溶劑對藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響（n＝3）Tab.3 Effect of extraction solvent on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride（n＝3）

2.9.2 液料比

以體積分數(shù)為70%的乙醇作為提取溶劑，加熱回流提取30min，考察液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1對青牛膽藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)液料比為20∶1時，提取量達到最大值。

2.9.3 提取時間 以體積分數(shù)為70%的乙醇作為提取溶劑，料液比為20∶1，加熱回流提取20、40、60、90、120 min，考察不同提取時間對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響。結(jié)果表明，提取時間為40 min時，青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量達到最大值。

2.10 響應(yīng)面法設(shè)計

2.10.1 響應(yīng)面法設(shè)計與結(jié)果分析 根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，用響應(yīng)面軟件Design Expert 11.0設(shè)計方法，以影響青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取工藝的4個顯著因素（溶劑體積分數(shù)、液料比、提取時間和次數(shù)）為自變量、青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量之和（y）為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析［13-15］。因素與水平設(shè)計見表4，結(jié)果見表5。

表4 因素與水平Tab.4 Factors and levels

表5 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Tab.5 Response surface analysis scheme and results

將表5中的數(shù)據(jù)輸入Design Expert 11軟件進行多元回歸擬合，得到青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量與各因素變量的關(guān)系方程：y＝1.4－0.233 3A＋0.022 0B＋0.014 0C＋0.020 2D－0.008 7AB＋0.021 0AC－0.036 2AD－0.025 2BC＋0.040 5BD－0.013 3CD－0.227 3A2－0.047 3B2－0.057 8C2－0.157 3D2。方差分析結(jié)果見表6。

在實驗設(shè)計范圍內(nèi)，一次項的偏回歸系數(shù)的絕對值A(chǔ)明顯大于B、C、D，說明提取溶劑對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量影響最大。

由表6可知，該模型（F＝79.29，P＜0.000 1）極為顯著，表明響應(yīng)回歸模型差異有統(tǒng)計學(xué)意義；模型中失擬項（F＝2.60，P＝0.184 8＞0.05）不顯著，表明差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明該模型設(shè)計合理。該模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0.987 5，表明該回歸模型擬合性好、回歸方程代表性良好，實驗結(jié)果與預(yù)測值一致性良好。模型校正系數(shù)＝0.975 1，表明青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量97.51%的實驗結(jié)果分布在響應(yīng)面方程中，僅有2.49%實驗結(jié)果不能解釋其響應(yīng)值的變化。復(fù)相關(guān)系數(shù)和校正系數(shù)R2值均接近1，表明該模型能夠有效預(yù)測響應(yīng)面值；y的變異系數(shù)為2.65%，變異系數(shù)較小，表明該模型方法的精確度和可靠性相對較高。方差分析結(jié)果表明，方程中的A、B、D、AD、BD、A2、B2、C2、D2對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義，故可用此模型對提取工藝進行分析和預(yù)測。

表6 回歸模型的方差分析結(jié)果Tab.6 Results of analysis of variance of regression model

2.10.2 因素間的交互影響 結(jié)果顯示，交互項AD、BD有較高的顯著性，表明提取溶劑、液料比和提取次數(shù)的交互作用對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量有較顯著影響。經(jīng)Design Expert 11.0軟件處理，得到了提取溶劑體積分數(shù)（A）、液料比（B）和提取次數(shù)（D）交互作用的響應(yīng)面三維圖和等高線圖，見圖2～圖7。其中AD、BD在等高線圖中呈橢圓形，說明2個因素間交互作用較強，對提取量的影響顯著。

由圖2～圖7可知，溶劑體積分數(shù)與提取次數(shù)、液料比與提取次數(shù)的交互作用均顯著，溶劑體積分數(shù)與液料比、溶劑體積分數(shù)與提取時間、液料比與提取時間、提取時間與提取次數(shù)的交互作用均不顯著。由圖4可知，響應(yīng)曲面的坡度相對較為陡峭，表明青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量對溶劑體積分數(shù)和提取次數(shù)的改變較為敏感。提取溶劑為體積分數(shù)為60%的乙醇，提取次數(shù)為2次，青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量達到最大值。由圖4可知，提取溶劑體積分數(shù)的變化對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響，相比提取次數(shù)變化對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響大。由圖6可知，響應(yīng)曲面的坡度相對較為陡峭，表明青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量對液料比和提取次數(shù)的改變較為敏感。

圖2 溶劑體積分數(shù)與液料比交互作用對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.2 Effect of interaction between solvent concentration and liquid-material ratio on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

圖4 溶劑體積分數(shù)與提取次數(shù)交互作用對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.4 Effect of interaction between solvent concentration and extraction times on the extraction jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

圖7 提取時間與提取次數(shù)交互作用對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.7 Effect of interaction between extraction time and extraction times on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

結(jié)果顯示，液料比為16∶1，提取次數(shù)為2次，青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量達到最大值。由圖6可知，提取次數(shù)的變化對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響，相比于液料比變化對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響大。

圖6 液料比與提取次數(shù)交互作用對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.6 Effect of interaction between liquid-material ratio and extraction times on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

圖3 溶劑體積分數(shù)與提取時間交互作用對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.3 Effect of interaction between solvent concentration and extraction time on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

圖5 液料比與提取時間交互作用對青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.5 Effect of interaction between liquid-material ratio and extraction time on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

2.10.3 最佳工藝驗證 用Design Expert 11.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示，以體積分數(shù)60%的乙醇為提取溶劑、液料比為16∶1、提取時間為40 min、連續(xù)提取2 次為青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的最佳提取條件。在此條件下進行3 次平行驗證實驗，青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量分別為1.439、1.448、1.443 mg·g－1，與預(yù)測值（1.464 mg·g－1）幾乎一致，表明用響應(yīng)面分析法優(yōu)化青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取工藝是可行的。

3 討論

生物堿類成分是許多藥用植物的重要有效成分，具有一定的生物活性。青牛膽塊根富含生物堿、二萜類和黃酮類化合物［4］，其中小檗堿類生物堿巴馬汀和藥根堿是主要的成分，藥理活性較好，具有抗幽門螺桿菌、抗癌、抗炎鎮(zhèn)痛等作用［16-18］，故選擇藥根堿和巴馬汀的提取量作為考察指標(biāo)。將藥根堿和鹽酸巴馬汀的對照品溶液分別在190～400 nm 紫外波長下掃描，結(jié)果顯示，在225、265、345 nm 處均有吸收峰，但在345 nm 波長處的基線較225、265 nm 處平穩(wěn)，這可能是由于部分官能團和共軛結(jié)構(gòu)在225、265 nm附近有吸收，而在345 nm 附近無吸收［19］，故考慮將225、265 nm 作為檢測波長。根據(jù)實際液相檢測效果，發(fā)現(xiàn)以225 nm 作為檢測波長，既可對目標(biāo)成分進行準(zhǔn)確分析，又可將相關(guān)物質(zhì)有效檢出，從而較為全面地反映樣品的信息，故將225 nm 作為檢測波長較為適宜。此外，本研究通過對流動相的考察，分別以水-甲醇、水-乙腈、3 m L·L－1磷酸溶液-甲醇、3 m L·L－1磷酸溶液-乙腈作為流動相進行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)以3 m L·L－1磷酸溶液-乙腈作為流動相時，色譜峰分離較好，拖尾現(xiàn)象較少，故以3 mL·L－1磷酸溶液-乙腈作為流動相。在選擇色譜柱時，發(fā)現(xiàn)Agilent Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）的分析效果較InertSustaun C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）好，故選用Agilent Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。

由于產(chǎn)區(qū)、采收季節(jié)、提取和檢測方法不同，生物堿成分的類別和含量存在一定差異。陳旭冰等［20］研究發(fā)現(xiàn)，不同生長年限青牛膽塊根中巴馬汀和藥根堿的含量有明顯變化，在第一年時含量均較高，隨著生長年限的增加，含量逐漸降低，生長到第四年時（塊根長到3.0 g以上）含量達到最大值（巴馬汀0.14%，藥根堿0.10%），之后含量略有下降。也有文獻報道［21］，用HPLC-ESI-MS／MS 同時 測定金果 欖 中5種成分含量，通過對產(chǎn)自廣西的3 批金果欖進行測定，其中鹽酸巴馬汀（掌葉防己堿）、藥根堿的含量分別在40.89～45.14、3.56～4.21 mg·g－1范圍內(nèi)，而本課題研究中鹽酸巴馬汀、藥根堿的含量檢測最大值分別為1.049、0.413 mg·g－1。本研究在初步考察青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取工藝時，比較了浸漬法、回流提取、超聲提取對青牛膽中小檗堿類生物堿提取量的影響，結(jié)果顯示，回流提取生物堿量相對較多，故本實驗選擇回流提取法進行操作。除此之外，提取溶劑、液料比、提取時間和提取次數(shù)均會影響提取效果?；陧憫?yīng)面法設(shè)計，以藥根堿和巴馬汀的提取量之和作為考察指標(biāo)，在單因素考察的基礎(chǔ)上，探究青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的最佳提取工藝，即提取溶劑為體積分數(shù)為60%的乙醇、液料比為16∶1、提取時間為40 min、提取次數(shù)為2次。按照最佳提取工藝進行驗證，青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的實際測定值與預(yù)測值基本一致。