吳亞楠，問思華，武 旭，趙重博，3，劉 航，孫 靜，3*

1.陜西中醫(yī)藥大學，咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，咸陽 712046；3.陜西省中藥飲片工程技術研究中心，咸陽 712046

五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效，用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內熱消渴、心悸失眠的治療［1］。傳統(tǒng)用法以果實入藥［2-4］，但隨著對五味子研究的深入，發(fā)現(xiàn)五味子葉與果實所含成分相似［5-7］，有良好的利用價值。為了探討五味子葉是否有藥用價值，如何使用、如何實現(xiàn)五味子資源的合理開發(fā)，本文對五味子葉進行研究，通過7種成分含量的測定并與五味子果實進行對比，為五味子葉的質量評價提供理論依據(jù)，同時為五味子的綜合開發(fā)、利用奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030 Plus型高效液相色譜儀（配置LC-2030 LC-2030 UV 檢測器，日本島津公司）；New Classic MS-S型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；XM-P102 H 型無極調功超聲波清洗機（昆山超聲儀器有限公司）；0.22μm 微孔濾膜（天津杉羽科技有限公司）；UPL-10L 型超純水機（四川卓越水處理有限公司）。

1.2 試藥

五味子、五味子葉由柞水縣世紀生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供，經(jīng)孫靜教授鑒定為木蘭科植物五味子的果實與葉。五味子甲素（批號PS000928，質量分數(shù)為99.02%），五味子乙素（批號PS010450，質量分數(shù)為99.62%），五味子丙素（批號PS020290，質量分數(shù)為99.62%），五味子醇甲（批號PS011670，質量分數(shù)為99.90%），五味子醇乙（批號PS010166，質量分數(shù)為99.83%），五味子酯甲（批號PS000936，質量分數(shù)為99.55%），五味子酯乙（批號PS010169，質量分數(shù)為99.16%），均購自成都普思生物科技股份有限公司；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動相：乙腈（A）-水（B）。梯度洗脫：0～20 min，45%～55% A；20～30 min，55%～60% A；30～40 min，60%～65% A；40～60 min，65% A；60～70 min，65%～75% A；70～80 min，75%～85%A；80～90 min，85%～95%A；90～100 min，95%～100%A）。流速：0.5 mL·min－1。檢測波長：254 nm。柱溫：40℃。進樣量：10μL。

2.2 供試品溶液的制備

取五味子果實、葉樣品粉末（過3號篩）約0.3 g，精密稱定，置于25 m L 量瓶中，加甲醇約20 m L，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率20 k Hz）20 min，取出，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得［1］。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，置于10 m L 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成五味子丙素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素質量濃度約為0.1 mg·m L－1的混合對照品溶液。

2.4 線性關系考察

分別精密稱定五味子甲素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素約10 mg，分別置于1 m L 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成高質量濃度對照品溶液。精密吸取各高質量濃度對照品溶液，置于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成各對照品質量濃度為1 mg·m L－1的混合對照品溶液。再逐級稀釋成質量濃度分別為0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.002 mg·mL－1的混合對照品溶液，以質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。取質量濃度為0.002 mg·mL－1的混合對照品溶液逐級稀釋，分別以信噪比（S／N）為3和10 時的對照品質量濃度為檢測限（limit of detection，LOD）和 定 量 限（limit of quantitatio，LOQ）。結果見表1。

表1 各成分的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限Tab.1 Regression equation，correlation coefficient，linear range，LOD and LOQ for each component

2.5 精密度實驗

取混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙峰面積 的RSD 值 分 別 為0.27%、0.25%、0.29%、3.00%、0.62%、0.29%、0.28%。

2.6 重復性實驗

分別精密稱取五味子果實、葉各6 份，每份約0.3 g，按照2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣分析。五味子果實中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙質量濃度的RSD 值分別為2.71%、0.92%、0.51%、0.38%、0.74%、0.55%、1.23%。五味子葉中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙質量濃度的RSD 值分別為0.64%、0.88%、0.8%、1.17%、0.86%、0.54%、0.47%。表明該方法的重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗

分別取五味子果實、葉供試品溶液，分別在、2、4、6、8、10、12、24、48 h進樣分析。五味子果實中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙質量濃度的RSD 值 分 別 為0.15%、0.43%、2.15%、1.34%、0.29%、0.33%、0.52%。五味子葉中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙質量分數(shù)的RSD 值分別 為0.98%、0.56%、2.86%、1.35%、2.13%、1.22%、0.32%。表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實驗

分別精密稱取已知成分含量的五味子果實、葉樣品粉末，各6份，每份約0.15 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入各對照品適量，按照2.1項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下色譜條件進樣分析。結果見表2、表3。

表2 五味子果實加樣回收率結果Tab.2 Results of recovery tests of Schisandra fruits

表3 五味子葉加樣回收率結果Tab.3 Results of recovery tests of Schisandra leaves

2.9 含量測定

取五味子果實、葉，按照2.2項下方法制樣，按照2.3項下色譜條件進樣分析，計算五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙的含量。結果見表4?；旌蠈φ掌?、五味子果實、葉色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms

表4 各成分含量Tab.4 Content of each composition

3 討論

實驗分別考察了將甲醇和乙腈作為流動相對分離效果的影響，結果顯示，乙腈-水分離系統(tǒng)的分離效果好，最終確定以乙腈-水分離系統(tǒng)作為流動相；考察不同梯度流動相對分離效果的影響，確定最佳流動相梯度，但有2個化合物分離效果不好。

通過對柱溫進行調整，結果顯示，在柱溫為40℃時，分離效果最好，確定以此條件進行后續(xù)的實驗。

五味子具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效，具有很好的保健開發(fā)潛力，其中五味子甲素、五味子酯甲具有保肝、抗炎的功效［8-10］，五味子乙素具有抗炎、抗氧化的作用［11-16］，五味子丙素、五味子酯甲具有調節(jié)肝臟藥物代謝的作用［17-19］，五味子醇乙具有保肝的作用［20-21］。通過對7種成分含量的測定可知五味子果實與葉的化學成分相似，但含量相差懸殊，可見五味子葉的藥用價值較低，僅可作為保健品開發(fā)使用。