張芳紅 朱公建 王曉敏 張永東 李海寧 朱小康 蘇海翔 郭紅云

1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院/甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州市西固區(qū)人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730060

肺癌的死亡率在中國居于惡性腫瘤之首，占惡性腫瘤死亡病例的24.41%，并且還在呈逐年上升的趨勢［1］。許多藥用植物中都含有黃酮類化合物。由于黃酮類化合物具有多種藥效學(xué)功能，對人體的正常細(xì)胞毒性小，但在殺傷腫瘤細(xì)胞方面顯示出較強(qiáng)的作用，因此其抗癌活性研究已成為熱點(diǎn)，是頗具應(yīng)用前景的新抗腫瘤藥或抗腫瘤輔助藥［2-3］。甘草查爾酮B（licochalcone B，LCB）是從甘草中提取出來的重要黃酮類化合物，具有較好的抑菌消炎作用，在食品和化妝品領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。既往研究發(fā)現(xiàn)，甘草查爾酮B 對多種腫瘤具有抑制作用，但甘草查爾酮B 對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的抑制作用還鮮有報道。本研究通過探討甘草查爾酮B 對人肺癌細(xì)胞株A549 增殖和凋亡的影響及其可能的機(jī)制，為肺癌的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑 LCB（上海麗臣生物技術(shù)有限公司），純度98%，C16H14O5=286.28。人肺癌細(xì)胞株A549 由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點(diǎn)實驗室惠贈。DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），胎牛血清（美國CLARK Bioscience 公司），Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（均為北京Solarbio 公司），AnnexinV-FITC/PI 雙染凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司），鼠抗人GAPDH、Bcl-2 單克隆抗體（美國Proteintech 公司），兔抗人Bax 多克隆抗體（Immunoway，美國）、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（Proteintech，美國），Western 特異發(fā)光檢測試劑盒（HRP）（美國MilliPore 公司）。

1.2 儀器 BDFACSVerse TM 流式細(xì)胞儀（美國BD公司），ChemiDocTM XRSS+成像系統(tǒng)儀、XMarkTM MicroPlate 酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司），MCO-20AIC-PC細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Panasoni 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)液，放入飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，溫度37℃、5%CO2。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時可用于實驗。

1.3.2 CCK-8 法檢測增殖。用0.25%胰酶消化貼壁生長的細(xì)胞，輕輕吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL。取100μL 細(xì)胞懸液加置96 孔板中。常規(guī)培養(yǎng)過夜使其貼壁后，棄上清，加入含有LCB（終濃度分別為0、10、20、40、80、120μmol/L）的DMEM高糖完全培養(yǎng)基200μL，作用24、48、72h 后，避光每孔加入10μLCCK-8 液，37℃孵育1h，波長450nm 處測定吸光度值。每個濃度設(shè)4 個平行孔，1 個空白調(diào)零孔，重復(fù)3 次。計算增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.3 平板克隆形成。按1.3.2 方法將細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至250 個/mL，接種2mL 于直徑35mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中過夜，加入LCB（終濃度0、10、20、40μmol/L）。置于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h 后，換無藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10～14d。期間每3d 換液1 次，結(jié)束培養(yǎng)，甲醇固定15min，結(jié)晶紫染液染色15～25min，流水沖洗并室溫放置干燥。計數(shù)克隆數(shù)，計算克隆形成率。

1.3.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期。按1.3.2 方法制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于直徑60mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中（6.0×105個/皿），培養(yǎng)過夜使其貼壁后，棄去培養(yǎng)液，加入含有LCB（終濃度0、10、20、40μmol/L）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72h 后，消化細(xì)胞，收集至離心管中，用預(yù)冷PBS 洗滌2 次，滴加預(yù)冷75%乙醇，冰箱冷藏固定過夜。重新1500rpm 離心5min，棄上清，PBS 清洗兩遍，棄上清，每管分別加入180μL EDTA（0.1mmol/L）、20μL RNase A（10mg/mL）、35μL 2% TritonX-100、96.5μL PBS 和17.5μL PI（1mg/mL），4℃避光孵育10min。過濾，補(bǔ)加200μL PBS 混勻，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。實驗重復(fù)3 次。

1.3.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。按1.3.4 方法分組和給藥，培養(yǎng)72h 后，消化收集細(xì)胞至離心管中，4℃PBS清洗2 遍。加入1×Binding Buffer 300μL 懸浮細(xì)胞后，先后加入AnnexinV-FITC 5μL，避光室溫孵育15min，再加入結(jié)合液400μL 和PI 5μL，避光孵育3min，1h 內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 Western Blot 檢測蛋白。分組給藥方法同1.3.4加藥培養(yǎng)48h 后按試劑盒提取蛋白并進(jìn)行定量。加入上樣緩沖液，并煮沸進(jìn)行蛋白變性，SDS-PAGE 電泳，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDE 膜上，封閉2h，加一抗（GAPDH 抗體1 ∶8000，Bax、Bcl2、Caspase 抗體）于4℃均1 ∶1000）4℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜5 次后，再用二抗（1 ∶8000）室溫孵育1.5h，繼續(xù)洗5 次，ECL 顯色液顯色后于凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，并以GAPDH 為內(nèi)參，分析各目的蛋白的相對含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s 表示，多組均數(shù)比較采用OneWay ANOVA 進(jìn)行組間兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LCB 對肺癌A549 細(xì)胞增殖的影響 LCB 能顯著的抑制A549 細(xì)胞增殖，抑制作用隨著劑量增大和時間延長增強(qiáng)。LCB 作用于A549 細(xì)胞24h，其抑制率為5.30%～51.40%，IC50 為143.92μmol/L；48h，抑制率為14.32%～69.78%，IC50 為55.35μmol/L；72h，抑制率為24.20%～85.68%，IC50 為34.39μmol/L。見圖1。

圖1 LCB 對A549 細(xì)胞增殖的影響

2.2 LCB 對肺癌A549 細(xì)胞平板克隆形成的影響對照組的細(xì)胞克隆形成率（100±13.2）%，20μmol/L、40μmol/L LCB 細(xì)胞克隆形成率分別為（75.4±11.9）%、（65.4±10.8）%，相對于對照組的細(xì)胞克隆形成率明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 LCB 對A549 細(xì)胞平板克隆形成的影響

2.3 LCB 對A549 細(xì)胞周期的影響 LCB 干預(yù)72h 后，LCB 各劑量組G0/G1 期細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05），可以將細(xì)胞阻滯在G1。10μmol/L、40μmol/L 組均可使S期細(xì)胞比例降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；20μmol/L、40μmol/L 組G2/M 細(xì)胞比例也明顯降低（P＜0.05），10μmol/L 劑量組G2/M 細(xì)胞比例無明顯變化（P＞0.05）。見圖3。

圖3 LCB 對A549 細(xì)胞周期的影響

2.4 LCB 對A549 細(xì)胞凋亡的影響 LCB 干預(yù)A549細(xì)胞72h，10μmol/L、20μmol/L 和40μmol/L 細(xì)胞總凋亡率分別為：（11.26±1.11）%、（14.12±1.25）%和（19.17±2.76）%，對照組為（5.38±0.25）%；總凋亡的發(fā)生率均高于對照組（P＜0.05），并且隨著LCB 濃度增加，凋亡率也隨之上升。LCB 干預(yù)A549 細(xì)胞72h，10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L 細(xì)胞凋亡率均高于對照組（P＜0.05），并且隨著LCB 濃度增加，凋亡率隨之上升。見圖4。

圖4 LCB 對A549 細(xì)胞凋亡的影響

2.5 LCB 對Bax、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表達(dá)影響A549 細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)48h，LCB 各劑量組Bax 蛋白表達(dá)升高，而Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，Bax/Bcl-2 比值升高，與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。LCB 各劑量組干預(yù)A549 細(xì)胞48h，Caspase-3 蛋白表達(dá)量隨劑量上升而增加，20μmol/L 和40μmol/L 劑量組與對照比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。見圖5。

圖5 LCB 對A549 細(xì)胞BAX、Bcl-2 及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率很高的惡性腫瘤之一。近年來肺癌的分子靶向治療和免疫治療等手段的出現(xiàn)為患者帶來了希望，但對于無靶點(diǎn)和出現(xiàn)耐藥的患者化療仍然是最常用的臨床治療方案。

LCB 為查爾酮類物質(zhì)，也屬于甘草黃酮類，具有保護(hù)心肌［4］、預(yù)防老年癡呆［5］和護(hù)肝［6］等生理作用，同時研究顯示LCB 可以抑制多種癌細(xì)胞的增殖活性。近年來，LCB 的抗腫瘤作用日益受到關(guān)注。研究表明LCB 可以抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827 的生長并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡［7］，也具有誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞［8］、膀胱癌細(xì)胞［9］、乳腺癌細(xì)胞［10］、口腔鱗狀細(xì)胞癌凋亡的作用［11-12］。本研究通過CCK-8、平板克隆形成實驗及周期檢測，顯示LCB 能顯著抑制非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的增殖，且抑制程度隨LCB 濃度的增加而增加。

細(xì)胞凋亡是一種正常的生理性保護(hù)機(jī)制，能夠清除體內(nèi)多余或受損的細(xì)胞，是一種精確的細(xì)胞分裂和細(xì)胞死亡之間的動態(tài)平衡。但細(xì)胞分化異常、凋亡受到抑制、細(xì)胞增殖失控均會造成腫瘤的無限生長。凋亡相關(guān)基因表達(dá)異常、突變或缺失，可以阻斷細(xì)胞的凋亡，打破細(xì)胞分裂和細(xì)胞死亡的平衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［13-14］。細(xì)胞線粒體途徑凋亡的激活與外膜的通透性密切相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞受到某種程度的影響時，促凋亡基因就會從膜間隙轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，進(jìn)而啟動Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)凋亡現(xiàn)象，而線粒體外膜的通透程度是由Bcl-2 家族內(nèi)部多種蛋白相互調(diào)控決定。Bcl-2 家族在調(diào)控線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中十分關(guān)鍵，其中比較重要的有抑制凋亡的Bcl-2 和促進(jìn)凋亡的Bax，二者之間的相互平衡決定了生物體內(nèi)細(xì)胞的存活與死亡［15-16］。Caspase 蛋白酶家族是許多介導(dǎo)凋亡途徑的最終聚集點(diǎn)，而Caspase-3 為整個凋亡途徑中的核心蛋白之一，是凋亡的執(zhí)行者和關(guān)鍵酶，可與Caspase-8 酶原和Caspase-9前體蛋白相互結(jié)合，觸發(fā)相應(yīng)的凋亡順序活化［17］。

本研究采用Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測LCB對A549 細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，隨著LCB 濃度的增加和時間延長，細(xì)胞凋亡率明顯增加，提示LCB 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡呈濃度和時間依賴性。蛋白免疫印跡法進(jìn)行定量檢測，結(jié)果顯示LCB 可以上調(diào)Bax/Bcl-2及Caspase-3 的表達(dá)，從而推測LCB 對A549 細(xì)胞的增殖抑制作用可能是通過介導(dǎo)線粒體途徑細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的。但LCB 對A549 細(xì)胞凋亡上游的受體及其他通路的影響，有待進(jìn)一步深入探討。