申卓未, 李 睿, 王 楊, 許曉光, 肖 禎

大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 大連 116000

引 言

宮頸癌是女性發(fā)病率第四位的癌癥, 據(jù)統(tǒng)計, 2018年全球約有57萬的宮頸癌患者, 及31萬的死亡患者。 其中我國和印度為宮頸癌重災(zāi)區(qū), 承擔(dān)了近三分之二的病例數(shù)[1]。 如果能早期診斷宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變可大大提高生存率。 盡管現(xiàn)在有諸如細胞學(xué)涂片檢查(巴氏涂片)和人乳頭狀瘤病毒(HPV)檢測等篩查工具, 但平均靈敏度和特異性令人不甚滿意[2]。 細胞學(xué)檢查假陽性率高, 會帶來過度醫(yī)療及額外的經(jīng)濟損失； HPV DNA的檢測成本高、 缺乏訓(xùn)練有素的實驗室人員； 陰道鏡檢查具有良好的敏感性(>90%); 但其特異性較差(<50%), 假陽性率高, 常導(dǎo)致不必要的活檢； 組織病理學(xué)檢查是目前評估和診斷癌癥的金標(biāo)準(zhǔn), 但它的各種過程, 大約需要1周時間, 存在耗時長、 價格昂貴的缺點[2]。 因此新型的快速、 高效、 便捷的檢測技術(shù)應(yīng)運而生, 如只需一小時就能直接從宮腔標(biāo)本中提取出HPV 16型的DNA的“紙張芯片“、 使用固定焦距相機實現(xiàn)實時檢測宮頸狀態(tài)、 及拉曼顯微鏡。

拉曼光譜學(xué)的基本原理是光的彈性散射。 拉曼光譜技術(shù)是一種可靠的新興的技術(shù), 它可分析物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu), 并保證受試對象不受破壞且保持完整, 還可以在微米級別的分辨率下分析人體組織的化學(xué)成分。 拉曼成像目前已被成功應(yīng)用于許多領(lǐng)域, 包括分析化學(xué)材料, 食品質(zhì)量監(jiān)督, 藥物分析和法醫(yī)調(diào)查。 在醫(yī)學(xué)研究方面, 拉曼成像已成功應(yīng)用于鼻咽、 胃腸、 肺、 食管、 腎、 腦癌等[3]。

1 拉曼技術(shù)在宮頸癌中的應(yīng)用

Mahadevan等于1998年記錄了宮頸組織的體內(nèi)及體外拉曼光譜。 隨后的研究逐漸伸展, 包括了組織學(xué)上正常、 癌前病變及癌組織的區(qū)分； 癌組織的低中高分化分類； 宮頸鱗癌腺癌的分類等。 研究也逐漸從組織學(xué)慢慢擴展到細胞學(xué)及血清學(xué)中。

1.1 拉曼技術(shù)在組織學(xué)上的應(yīng)用

拉曼光譜技術(shù)在宮頸活體組織的研究主要方式是設(shè)計拉曼光譜儀和光纖探針, 用光纖探針在活體宮頸表面獲得正常和癌前組織的拉曼光譜。 通過分析所得光譜, 分辨出宮頸的正常組織及宮頸癌組織。 所研究分析的拉曼特征光譜集中在紅外光譜指紋區(qū)(1 300～400 cm-1, 7.69～25 μm), 這個區(qū)域的吸收峰特征性強, 可用于區(qū)分分子結(jié)構(gòu)的細微變化。

表1 宮頸組織學(xué)的拉曼檢測Table 1 Raman detection of cervical histology

光學(xué)顯微鏡在臨床診斷中的應(yīng)用日益增加, 如漫反射顯微鏡和拉曼顯微鏡, 但Shaikh等的研究發(fā)現(xiàn), 拉曼顯微鏡的敏感性、 特異性、 陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值(91%，96%，95%，93%)均高于漫反射顯微鏡(85%，95%，93%，88%)。 由于成本較低和復(fù)雜性較低, 漫反射顯微鏡更適合作為農(nóng)村社區(qū)的大規(guī)模篩查方式, 而拉曼顯微鏡的診斷準(zhǔn)確性更高, 有望成為宮頸癌診斷的首選無創(chuàng)診斷技術(shù)[4]。

1.2 拉曼光譜用于診斷宮頸癌[5]

拉曼顯微鏡在組織學(xué)中體外的研究, 大多使用新鮮組織制成冰凍或切成石蠟切片, 或直接掃描新鮮組織的表面, 目的在于區(qū)別正常組織、 癌前病變與癌組織, 或癌組織的分類(低中高分化或鱗癌腺癌), 或炎癥對于假陽性的意義。

Daniel使用拉曼顯微鏡觀測并對同一組織切片進行蘇木精和伊紅(H&E)染色, 進行組織病理學(xué)報告, 揭示宮頸癌的生物分子結(jié)構(gòu)變化并得出拉曼光譜診斷的靈敏度為92%, 特異性為75%, 準(zhǔn)確度為85%[5]。

1.3 炎癥對拉曼光譜診斷宮頸癌的影響[7]

之前的研究認為, 炎癥的存在會使得拉曼光譜對宮頸癌診斷的假陽性增加。 但近些年的研究表明, 拉曼光譜可以區(qū)分宮頸炎、 不同類型的癌前病變、 鱗癌及腺癌。 Wang等收集了210例宮頸組織樣本, 并使用SVM(支持向量機)重點分析了炎性組織與其他病理組織的區(qū)別, 如表2。

表2 炎癥組織與其他五種組織的拉曼對比Table 2 Raman comparison of inflammatory tissue and other five tissues

1.4 拉曼光譜可以用于腫瘤組織的級別分類[6], 及鱗癌腺癌的區(qū)分[6，8-9]

Daniel等使用拉曼顯微鏡分析了新鮮切除的宮頸組織樣本中的某些生物分子含量, 分別對比了正常、 癌前及宮頸癌組織, 以及三種類型的癌組織, 并得出如下結(jié)論(表3、 表4、 表5)。 該研究表明使用拉曼光譜區(qū)分高分化、 中分化和低分化的鱗狀細胞癌, 準(zhǔn)確率為94.0%。 實驗認為拉曼光譜能夠成功對宮頸炎、 宮頸癌前病變(CIN Ⅰ，CIN Ⅱ，CIN Ⅲ)、宮頸癌(宮頸鱗狀細胞癌、 宮頸腺癌)進行分類, 區(qū)分6種宮頸組織的準(zhǔn)確率為85.7%[6]。

表3 三種組織樣本生物大分子對比Table 3 Comparison of biomacromoleculesin three tissue samples

表4 三種類型癌組織生物大分子含量Table 4 Contents of biomacromolecules inthree types of cancer tissues

表5 癌前與宮頸癌樣本中生物大分子對比

宮頸腺癌相對于鱗狀細胞癌來說, 更易發(fā)生淋巴結(jié)、 卵巢和遠處轉(zhuǎn)移, 預(yù)后較差。 有研究表明, 宮頸細胞學(xué)篩查方法對于宮頸腺癌的準(zhǔn)確性并不盡如人意。 有研究總結(jié)出了鱗癌腺癌的不同特征峰, 以及組織生化成分的差異。

Zheng等研究發(fā)現(xiàn)宮頸鱗狀細胞癌的特征波數(shù)在415，614，838，880，938，1 002，1 095，1 340，1 452，1 616，1 645和1 670 cm-1處, 這些譜帶可以初步劃分為脂類、 蛋白質(zhì)(色氨酸、 苯丙氨酸、 酰胺Ⅰ(α-螺旋))、 碳水化合物、 DNA(核酸)。 宮頸腺癌的特征波數(shù)在485，640，695和1 506 cm-1, 可歸屬于DNA(胞嘧啶)、 蛋白質(zhì)(酪氨酸、 蛋氨酸)、 糖原等生物分子。 說明了鱗癌腺癌中特征生物大分子的含量不同, 宮頸腺癌組織中碳水化合物含量占總拉曼活性成分的百分比高于宮頸鱗狀細胞癌組織, 而宮頸鱗狀細胞癌組織中RNA含量相對于總拉曼活性成分的百分比較高。 使用以上特征波長的光譜對宮頸腺癌和宮頸鱗癌的分型準(zhǔn)確率為93.125%[8]。

Zhang等應(yīng)用了偏最小二乘(PLS)、 主成分分析(PCA)、 核主成分分析(KPCA)、 等距特征映射(isomap)和局部線性嵌入(LLE) 5種特征提取算法, 建立了30種模型, 得出如下結(jié)論。 腺癌特征性峰強度高于鱗癌的波數(shù)有： 540，641，721，784，814，1 060和1 295 cm-1, 表明, 腺癌組織含有更多的葡萄糖、 酪氨酸、 磷脂和脯氨酸； 鱗狀細胞癌特征峰強度高于腺癌的波數(shù)有： 1 003，1 443和1 670 cm-1, 表明, 鱗狀細胞癌組織中苯丙氨酸、 脂類、 酰胺含量更高。 該實驗區(qū)分宮頸腺癌和宮頸鱗狀細胞癌準(zhǔn)確率達到96.3%[9]。

1.5 宮頸細胞學(xué)的拉曼檢測

Shiyamala Duraipandian等收集了35名女性的宮頸中間細胞、 淺表細胞和中間/淺表混合細胞, 并分別用主成分分析(PCA)、 線性判別分析(LDA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)的方法分析所得光譜, 發(fā)現(xiàn)PLS-DA方法的靈敏度和特異性較PCA-LDA均有明顯提高。 該研究還認為中間型和淺表型混合細胞可用于HSIL診斷[10]。

表6 宮頸細胞學(xué)的拉曼檢測Table 6 Raman detection of cervical cytology

Aljakouch等對來自30例樣本的宮頸細胞涂片的單個細胞進行拉曼光譜成像, 對比得到的CARS，SHG/TPF和Raman圖像, 分析細胞核與細胞質(zhì)的比例可以100%準(zhǔn)確地區(qū)分正常和癌變的pap涂片[11]。

Sitarz[12]等研究了96名HPV檢測后婦女的宮頸組織。 由于糖原含量因為癌細胞的糖酵解提供燃料而降低, 因此, 作者評估了所有研究組細胞中的糖原水平, 以確定它與細胞核大小和HPV感染的關(guān)系。 并得出了以下結(jié)論, 除癌癥組外, 所有研究組的子宮頸細胞胞漿中的糖原含量都隨著細胞核大小的增加而減少； 數(shù)據(jù)表明, 細胞核直徑超過10 μm的宮頸細胞, 其糖原水平明顯低于細胞核小直徑細胞； HPV感染的細胞糖原代謝高, 糖原含量減少； 與早期癌細胞相比, 晚期癌細胞的糖原水平顯著降低。

Karunakaran等使用拉曼顯微鏡研究了正常、 HSIL及宮頸癌的宮頸組織, 得出拉曼光譜使用單細胞、 細胞團和DNA診斷良惡性的準(zhǔn)確率分別為93.84%，74.26%和92.21%。 Karunakaran等還將以上樣本繪出的正常、 HSIL及宮頸癌的圖譜分別相減, 得到了這三種狀態(tài)的宮頸中各種生物大分子的差別[13]。

1.6 血液學(xué)拉曼檢測診斷宮頸病變

Lu等研究了150例女性的血清, 血樣均來自早餐前5 mL靜脈血。 檢測的靶抗原選擇了兩種： 鱗狀細胞癌抗原(SCCA)、 骨橋蛋白(osteopontin, OPN)。 數(shù)據(jù)匯總分析這兩種抗原在健康受試者中的拉曼光譜強度是最低的。 隨著病程的發(fā)展, 兩種抗原的拉曼光譜強度不斷增強, 說明拉曼顯微鏡可以同時檢測患者血清中SCCA和OPN水平。 這種做法成本低、 操作簡單、 選擇性高, 有望應(yīng)用于宮頸癌的篩查[14]。

表7 血液學(xué)拉曼檢測診斷宮頸病變Table 7 Hematology Raman detection in diagnosisof cervical lesions

2 拉曼技術(shù)在宮頸癌研究中的展望

目前拉曼技術(shù)在婦產(chǎn)科領(lǐng)域方興未艾, 作為一種新型科技, 目前相關(guān)研究并不太多, 在現(xiàn)有的文獻中, 我們也能發(fā)現(xiàn)其中樣本數(shù)量都不多的問題, 大多文獻的樣本個數(shù)不過百,

圖1 近五年拉曼技術(shù)在宮頸癌研究中的方向分類Fig.1 Classification of Raman technology in cervicalcancer research in recent five years

表8 生物大分子代表的波數(shù)Table 8 Wave number of biomacromolecules

沒有很高的說服力。 本文分類匯總了文中出現(xiàn)的所有文獻的研究方向, 制成簇狀柱形圖放置文末(圖1), 還匯總了部分生物大分子所代表的拉曼光譜波數(shù)(表8)。 可以看出大部分研究集中在組織學(xué)研究, 且體外研究較多, 細胞學(xué)以及血清學(xué)的相關(guān)研究待進一步發(fā)展。

同時, 拉曼顯微成像技術(shù)也存在著一些局限性, 比如拉曼技術(shù)的成本與費用高, 拉曼顯微鏡的高額成本也是其目前研究不多, 以后可能難以推廣的原因之一； 還有, 此前的研究大多是在實驗室條件下, 是否適用于體內(nèi)檢測還需研究； 由于目前的研究大多還是依賴冰凍切片或者石蠟切片, 雖然少了染色步驟可能帶來的誤差, 但是切片人員的技術(shù)高低也是影響成像清晰度的一大原因, 拉曼顯微鏡成像清晰度問題對后續(xù)研究也有著很大影響。

目前拉曼技術(shù)的有關(guān)研究都集中在實驗室條件下的組織, 關(guān)于血清、 分泌物、 代謝產(chǎn)物的研究還有待進一步發(fā)展。 拉曼顯微鏡的優(yōu)勢在于快速、 無創(chuàng), 目前的研究還局限在制成冰凍或者石蠟切片, 我們期待這一技術(shù)可以盡快革新應(yīng)用于臨床, 例如手持便攜式拉曼設(shè)備, 這種設(shè)備更小, 成像更快, 從而實現(xiàn)成本和時間上的高效診斷, 并且可以應(yīng)用于術(shù)中。