郭雪瑩，曹 陽，武天元，陳 柱，王 博，吳晨悅，張樹明

(1黑龍江省中醫(yī)藥科學院·黑龍江 哈爾濱 150036；2黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院·黑龍江 哈爾濱 150040；3荊門市第一人民醫(yī)院·湖北 荊門 448000)

人體的腸道中寄生著數(shù)以億計的微生物，不同菌群的微生物按照一定比例構(gòu)成了人體健康的菌群環(huán)境，在維護身體健康方面發(fā)揮著復雜的、廣泛的、多維度的作用，但同時，腸道菌群的結(jié)構(gòu)也受多種因素的影響，比如疾病、飲食結(jié)構(gòu)、服用藥物等原因都會使其發(fā)生變化?？股厥歉腥拘约膊〉某Ｓ盟幖疤匦?，其使用范圍廣、頻率高，但在使用中常出現(xiàn)未經(jīng)醫(yī)囑的濫用或過度應(yīng)用，給身體帶來了諸多不良影響，比如菌群失調(diào)所造成的免疫力降低或免疫系統(tǒng)過度活躍、腸炎、肥胖、甚至是糖尿病、癌癥等疾病[1-3]。因此，抗生素治療后健康腸道菌群結(jié)構(gòu)的恢復，對促進患者恢復健康、避免誘發(fā)其他疾病顯得尤為重要。

納豆是由枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆制成，富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及活性成分[5-6]，具有溶栓、醒酒、抗癌、抗氧化等多種功效[7-8]。目前，枯草芽孢桿菌對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用已有報道[9]，但是納豆作為一種枯草芽孢桿菌與大豆共同發(fā)酵的食品，是否具有更好的效果，還有待深入研究。Biolog-ECO板通過微生物對碳源的利用能力來表征微生物群落代謝多樣性和功能特征，目前這項技術(shù)在土壤微生物群落的研究中應(yīng)用比較廣泛[10]。Biolog微生物自動分析系統(tǒng)中包含糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等6大類碳源，并根據(jù)微生物對其中每一種碳源的利用強度，判斷某些代謝途徑中關(guān)建酶的活性大小，以此代表某代謝路徑及代謝能力[11-14]。所以，本研究中采用biolog-ECO板檢測納豆對抗生素誘導腸道菌群失調(diào)模型小鼠的腸道微生態(tài)恢復的影響，以明確納豆在此過程中的促進作用。

1 材料

1.1 實驗動物 選取30日齡SPF級健康ICR小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g，由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部提供，許可證號SCXK(黑)2013-001。小鼠飼養(yǎng)在黑龍江省中醫(yī)藥科學院動物室屏障動物實驗設(shè)施中。

1.2 藥物和試劑 納豆：黑龍江省中醫(yī)藥科學院制劑室提供，以大豆作為發(fā)酵基質(zhì)，采用實驗室分離菌種進行純種發(fā)酵而成，勻漿機制成細膩的勻漿液，濃度為325 g/L，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩？莶菅挎邨U菌活菌膠囊：北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號：1801068，0.25 g/粒(含活菌數(shù)不低于2.5×107CFU),取1粒，無菌生理鹽水稀釋到14.625 g/L，臨用時配制。頭孢曲松鈉粉針劑：上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，批號：1703111，無菌生理鹽水配成濃度為6.5 g/L，臨用時配制。

1.3 主要儀器 Biolog微生物自動分析儀：Biolog公司；生物安全柜：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

2 實驗方法

2.1 動物分組、造模及給藥 40只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量隨機分為4組，即正常組、模型組、陽性組、納豆組，每組10只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。正常組小鼠每只每次灌胃給予等體積(0.2 mL/10 g)無菌水，其余各組灌胃給予頭孢曲松鈉溶液(260 mg/kg)，2次/日，連續(xù)5 d。造模成功后，正常組、模型組給予等量無菌水；陽性組給予枯草芽孢桿菌藥液，292.5 mg/(kg·d)；納豆組給予納豆勻漿液6.5 g/(kg·d)；所有藥物均以成人用量換算為小鼠臨床等效劑量。每天灌胃給藥1 次，連續(xù)給藥14 d。實驗期間每天觀察并記錄各組小鼠的飲食、飲水、排便、毛色、精神、活動等一般狀況。

2.2 觀察指標測定

2.2.1 小鼠糞便的提取 無菌操作臺紫外燈照射30 min滅菌，將小鼠頸椎脫臼處死后立即放于超凈工作臺上，無菌采集各組小鼠空腸到回腸段內(nèi)容物，樣品混合收集于無菌離心管中，立即用液氮迅速降溫冷凍，回到實驗室后，轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 Biolog-ECO分析 Biolog-ECO生態(tài)板中含有31種碳源，編號同參考文獻[15]。無菌狀態(tài)下將1 g腸道內(nèi)容物放入15 mL無菌管中，加入10 mL生理鹽水，渦旋振蕩15 min制成混懸液，500 r/min離心10 min后收集上清液，即為腸道菌液。取腸道菌液，倍比稀釋，制備成濃度為10-3g/mL的混懸液。用8通移液器將稀釋后的菌液加入ECO培養(yǎng)板中，每孔150μL。完成后將培養(yǎng)板放入有氧培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，溫度設(shè)定為37 ℃，在培養(yǎng)的第4、12、24 h及之后的每24 h用Biolog讀數(shù)系統(tǒng)讀取數(shù)據(jù)。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理 (1)小鼠腸道微生物的代謝活性用每孔顏色平均變化率(Average well color development，AWCD)來描述，計算公式參照文獻[16]，AWCD=∑ (Ci-R)/31。式中，Ci為各碳源孔在590 nm下的吸光度值與750 nm下吸光度值的差值，R為ECO板對照孔A1的吸光度值，Biolog-ECO板的碳源數(shù)目為31。(2)計算各組樣本微生物多樣性的Shannon指數(shù)(H’)、Shannon均勻度(E)、Simpson指數(shù)(1/D)和Mclntosh指數(shù)(U)，所有數(shù)據(jù)采用培養(yǎng)72 h時數(shù)據(jù)。計算方法參照文獻[17]。

Shannon指數(shù)：H’=-∑(Piln Pi).式中，Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)，表示有碳源的孔與對照孔A1的光密度值之差與整板總差的比值。

Shannon均勻度：E=H’/ln S.式中，S表示碳源代謝孔的數(shù)目(Ci-R>0，則表示該孔碳源被利用，該孔即為反應(yīng)孔)。

Simpson指數(shù)(1/D)：D=∑ni(ni-1)/N(N-1)。式中，ni是第i孔的相對吸光度值(Ci-R)，N是相對吸光度值的總和(∑(Ci-R))，同時，為防止出現(xiàn)負值，需將數(shù)據(jù)擴大1 000倍.

2.3 統(tǒng)計學方法 AWCD、Shannon指數(shù)(H’)、Shannon均勻度(E)、Simpson指數(shù)(1/D)和Mclntosh指數(shù)(U)用Microsoft Excel 2010計算，SPSS軟件做聚類分析和主成分分析及t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 納豆對小鼠腸道微生物AWCD的影響 見圖1。

由圖1可知，4組小鼠腸道微生物AWCD值在培養(yǎng)168 h內(nèi)隨時間的延長而增加。4～72 h，各組AWCD值呈不同速率的增加，納豆組增加最為緩慢，72 h后各組數(shù)值變化趨于穩(wěn)定。各組之間AWCD值比較可見，培養(yǎng)12 h、24 h時，模型組>正常組>陽性組>納豆組，培養(yǎng)48 h及以后，模型組>陽性組>正常組>納豆組。培養(yǎng)初期菌群的生長還處于不穩(wěn)定的增長狀態(tài)，當培養(yǎng)到某個時間時，菌群中菌的數(shù)量及生長速度達到某種平衡狀態(tài)，所以在48 h前后，各組間AWCD值排序出現(xiàn)變化。綜合考慮，選取72 h時間點數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。

圖1 各組小鼠各時段腸道微生物AWCD變化

3.2 納豆對小鼠腸道微生物多樣性的影響 見表1。

表1 各組小鼠腸道微生物的多樣性和均勻度指數(shù)比較

3.3 各組小鼠腸道微生物群落代謝變化的聚類分析 見圖2。

由圖2 可見，當聚類距離≤10時，正常組碳源可以聚類為4類，模型組碳源可以聚類為3類，納豆組碳源聚類為5類；陽性組碳源可聚為4類且有部分碳源不能聚類為任一類別。正常組中主要為單糖及糖苷類以及聚合糖類為一類，造模后，聚為一類的物質(zhì)中單糖及糖苷類、聚合糖類成分減少，而氨基酸類、酯類及酸類增多；陽性組與模型組比較，單糖及糖苷類物質(zhì)有所增多，相應(yīng)的氨基酸和酯類、酸類物質(zhì)減少，但與正常組比較仍有較大差異。納豆組與陽性組比較，酸類物質(zhì)減少，與正常組比較，組成成分類別更接近。

1.β-甲基-D-葡萄糖苷；2.D-半乳糖酸-γ內(nèi)酯；3.L-精氨酸；4.丙酮酸甲酯；5.D-木糖；6.D-半乳糖醛酸；7.L-天冬酰胺酸；8.吐溫40；9.I-赤藻糖醇；10.2-羥苯甲酸；11.L-苯基丙氨酸；12.吐溫80；13.D-甘露醇；14.4-羥基苯甲酸；15.L-絲氨酸；16.α-環(huán)式糊精；17.N-乙?；?D-葡萄胺；18.γ-羥基丁酸；19.L-蘇氨酸；20.肝糖；21.D-葡萄胺酸；22.衣康酸；23.甘氨酰-L-谷氨酸；24.D-纖維二糖；25.葡萄糖-1-磷酸鹽；26.α-丁酮酸；27.苯乙基胺；28.α,D-乳糖；29.D,L-α-甘油；30.D-蘋果酸；31.腐胺

當聚類距離≤5時，正常組中的β-甲基D-葡萄糖苷和D-纖維二糖在模型組中分別與其他物質(zhì)聚為一類，所利用的氨基酸及胺類具體物質(zhì)也不同。陽性組與模型組比較，僅3種單糖及糖苷類物質(zhì)聚為一類，其他物質(zhì)均未聚于此類。納豆組與模型組比較，對氨基酸及酸類物質(zhì)的利用減少，胺類物質(zhì)的種類不同，并沒有對酯類物質(zhì)的利用，這與正常組的情況更為接近，葡萄糖-1-磷酸鹽、α-環(huán)式糊精、苯乙基胺三種物質(zhì)聚為一類，同時有氨基酸類，但是增加了對蘋果酸的利用。

3.4 各組小鼠腸道微生物菌落代謝變化的主成分分析 見圖3。

ECO板的數(shù)據(jù)代表微生物對不同碳源的代謝利用情況，從數(shù)據(jù)可知，不同組小鼠的腸道微生物能夠代謝ECO板中的絕大多數(shù)種類的碳源。分別對4個組數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)，在正常組、模型組、陽性組及納豆組中，成分1(PC1)的方差貢獻率分別為58.46%、67.39%、65.86%和72.73%。

對ECO板數(shù)據(jù)進行提取，4個組分別獲得1張呈現(xiàn)2個主成分的載荷圖，以此來分析各組的代謝特點。見圖3。圖3可見，PC1各組比較，模型組與正常組相比，增加了單糖及糖苷類和胺類化合物；陽性組與模型組相比，減少了聚合糖類化合物，酸類物質(zhì)數(shù)量減少；納豆組與模型組相比，參與代謝的化合物種類相同，而與陽性組相比，增加聚合糖類碳源。綜合4組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)糖類和羧酸類在PC1上載荷均較高，提示此兩類碳源為腸道微生物基礎(chǔ)代謝所需；4個組在7種碳源上有不同程度上的利用。利用較多且具有較高負荷的碳源，正常組為酯類及酸類碳源，模型組為酸類、聚合糖類、酯類及氨基酸類碳源，陽性組為聚合糖類、醇類及氨基酸類碳源，納豆組為氨基酸類、酯類、胺類及酸類碳源。納豆組、陽性組和正常組比較發(fā)現(xiàn)，納豆組中載荷在0.9以上的碳源中，脂類碳源有4種，正常組脂類碳源有4種，而陽性組中脂類碳源僅有1種，且載荷排位順序較后。納豆組、陽性組和模型組比較發(fā)現(xiàn)，納豆組對酯類的利用較模型組更多，納豆組和陽性組對聚合糖類、酸類碳源利用更少。

圖3顯示：4個組別中，PC2在酸類碳源上均具有較高載荷，提示此類碳源對PC2的貢獻率較高，是小鼠腸道微生物的基礎(chǔ)代謝所需碳源。與正常組相比，模型組缺少了聚合糖類及胺類碳源，增加了醇類和脂類碳源；陽性組缺少聚合糖類、胺類及氨基酸類碳源，增加了脂類碳源；納豆組缺少了胺類、氨基酸類及單糖及糖苷類碳源，增加了醇類碳源。與模型組比較，陽性組缺少氨基酸類及醇類碳源，納豆組缺少單糖及氨基酸類碳源，增加了聚合糖類碳源。

圖3 各組小鼠腸道微生物碳源代謝的主成分分析圖

聚合物類碳源肝糖在正常組及納豆組中對PC1的貢獻率較大，而模型組中對PC1貢獻率都不大，對PC2無貢獻率，表明納豆組腸道微生物代謝更接近正常組，具有調(diào)控作用。D-半乳糖酸γ內(nèi)酯在正常組及納豆組中對PC1的貢獻率較大，模型組及陽性組中對PC2的貢獻率較大，可見在某些方面，納豆對其代謝的調(diào)控作用更顯著，陽性藥的調(diào)控與自然恢復差別相似。

4 討論

納豆是大豆經(jīng)過枯草芽孢桿菌發(fā)酵制成的食品，具有多種保健功能。本文通過給予腸道菌群失調(diào)小鼠納豆勻漿液研究納豆對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。AWCD是微生物群落代謝的整體活性的直接指標，其值與微生物活性成正比[18]，本研究采用Biolog-ECO微生態(tài)板進行測定，經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，模型組小鼠的腸道微生物AWCD最大，說明模型組的菌群在抗生素的作用下出現(xiàn)失調(diào)，腸內(nèi)容物中好氧微生物代謝活力最強，這可能是由于模型組腸道菌群在自然恢復期間，菌群數(shù)量出現(xiàn)的反跳現(xiàn)象[19-20]。不同時間點AWCD值比較，培養(yǎng)48 h后，4 組的關(guān)系穩(wěn)定在模型組>陽性藥組>正常組>納豆組，說明培養(yǎng)48 h之前，各組的AWCD值還在波動，各組微生物群落還未穩(wěn)定；而培養(yǎng)48 h及之后，各組的AWCD值逐漸穩(wěn)定，說明納豆可降低模型小鼠腸道中好氧微生物代謝活動，并低于陽性組和正常組。

Shannon指數(shù)(H’)是功能多樣性指標，代表整個生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落的功能多樣性，即同一狀態(tài)下能夠利用碳源種類的多少，Shannon指數(shù)大，說明在這個生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落功能多樣性越高，反之則越低[14，16]。微生物Shannon均勻度指數(shù)(E)包括兩個因素，即豐富度和種類中個體分布的均勻性。微生態(tài)系統(tǒng)中的某些最為常見的微生物的優(yōu)勢度以及均勻度用Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)(U)兩個指標衡量[21]。Simpson指數(shù)與優(yōu)勢度物種成反比[22]。而Mclntosh指數(shù)(U)代表微生物群落的均勻度[23]。模型組小鼠腸道微生物H’、E、1/D和U均為最大，高于正常組，在一定程度上反應(yīng)出模型組小鼠腸道中好氧微生物數(shù)量豐富且結(jié)構(gòu)更復雜，可能是因為使用抗生素后，對其敏感的厭氧菌減少甚至消失，耐藥菌大量繁殖的原因[24]；也可能是因為在模型組腸道菌群已紊亂的情況下，在停止給予抗生素的期間，好氧菌數(shù)量迅速回升且超過正常水平所造成，這與謝莉敏[19]、 Holota Y[20]結(jié)果相符合。陽性組結(jié)果提示經(jīng)過陽性藥物的干預(yù)，小鼠腸道菌群發(fā)生改變，功能多樣性及微生物群落均勻性有所降低，而優(yōu)勢度物種有所增加，小鼠腸道菌群的狀態(tài)與正常組已基本相同，恢復到正常態(tài)。納豆組結(jié)果提示，納豆可以改變模型小鼠腸道菌群狀態(tài)，在H’、U及1/D 3方面恢復至正常水平，豐富度及種類中個體分布的均勻性仍未恢復至正常小鼠水平。

腸道微生物參與能夠維持人體機能的穩(wěn)定，包括免疫功能、代謝穩(wěn)態(tài)以及其他各種疾病。腸道菌群中主要是厭氧菌，比如雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌等，其次還包括腸桿菌、腸球菌等好氧菌[25]。本研究從聚類分析和主成分分析上都可以看出，模型組與正常組之間存在較大差異，陽性組、納豆組均發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用，但兩者之間也存在差異，其中，納豆組的調(diào)節(jié)作用更接近正常組，效果更佳。使用抗生素后，對抗生素敏感的厭氧菌大量減少，好氧菌乘機繁殖，導致體內(nèi)菌群間的平衡被打破。服用枯草芽胞桿菌后，枯草芽孢桿菌消耗腸道內(nèi)氧氣，使腸道內(nèi)更傾向于無氧環(huán)境，從而促進厭氧菌繁殖，或產(chǎn)生包括抗生素、細菌素和類細菌素[26]在內(nèi)的抗菌物質(zhì)，可在一定程度上抑制腸道中腸桿菌、腸球菌等條件致病菌的生長。如Somaye Mazkour等研究結(jié)果提示，給大鼠服用枯草芽孢桿菌后，大腸桿菌數(shù)量降低[27]。Zhang X等[28]有類似研究結(jié)果，即枯草芽孢桿菌能平衡腸道菌群，增加芽胞桿菌屬、理研菌科和乳酸菌屬的豐度，降低大腸桿菌屬和擬桿菌屬的豐度。這些方面于宿主調(diào)整腸道正常菌群并維持其環(huán)境的平衡方面非常有益[29]。另一方面，枯草芽孢桿菌制劑還可以減輕腸道黏膜損傷，促進腸道黏膜屏障修復[28]。而納豆組表現(xiàn)比陽性組效果更好，可能是因為納豆為大豆的發(fā)酵產(chǎn)品，其中不僅含有充分的枯草芽孢桿菌，亦含有大豆本身發(fā)酵的產(chǎn)物以及枯草芽孢桿菌分泌的各種營養(yǎng)物質(zhì)，比如多種維生素、氨基酸、黃酮類、皂苷類、納豆激酶、超氧化物歧化酶等各種活性酶[30]等等,參與機體的生長代謝，并輔助發(fā)揮調(diào)節(jié)菌群的作用。

本研究通過Biolog-ECO技術(shù)以及數(shù)據(jù)分析，可從整體上看到納豆對抗生素引起的小鼠腸道菌群失調(diào)的調(diào)節(jié)、促進恢復作用，但是研究尚有不足之處，如不能得出具體菌的種屬信息等，因此需要在后續(xù)的研究中對數(shù)據(jù)從其他角度進行分析或者利用其他技術(shù)手段進行檢測來實現(xiàn)。