曾浩南，鐘展明，徐志婷，滕金言，袁曉龍，李加琪，張 哲

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心, 廣東 廣州 510642)

單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotide polymorphisms, SNP)是指由于單個(gè)核苷酸發(fā)生變異引起的基因組水平上DNA序列的多態(tài)性，具有遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、位點(diǎn)數(shù)量多且分布廣，易于大規(guī)模自動(dòng)化檢測的優(yōu)勢，SNP芯片作為檢測SNP的重要手段，已被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域[1]。在豬育種中，相對低密度芯片的位點(diǎn)信息不足和高密度芯片的價(jià)格高昂，中密度50K芯片成為了豬基因組選擇的主流芯片類型。其中，Neogen子公司Geneseek研發(fā)的紐勤50K(Porcine SNP 50K beadchip)、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的中芯一號50K(KPS Porcine breeding chip v2)及中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的液相50K(GenoBaits porcine SNP 50K)為國內(nèi)常見的3款豬50K SNP芯片。3款芯片設(shè)計(jì)的原理不同，紐勤50K和中芯一號50K均是基于Illumina平臺研發(fā)的固相芯片，液相50K芯片是基于靶向測序基因型分型技術(shù)[2]研發(fā)的芯片。

全基因組測序數(shù)據(jù)(Whole genome sequencing,WGS)相比芯片數(shù)據(jù)記錄了更完整的遺傳信息，但由于直接測序成本較高，因此人們常用基因型填充技術(shù)將低密度的芯片數(shù)據(jù)填充至序列數(shù)據(jù)?；蛐吞畛涫且豁?xiàng)根據(jù)參考群體的基因型信息推斷目標(biāo)群體缺失基因型的技術(shù)，其能夠充分利用現(xiàn)有的SNP芯片信息將低密度數(shù)據(jù)準(zhǔn)確填充至高密度，實(shí)現(xiàn)了在節(jié)約育種成本的基礎(chǔ)上提高育種準(zhǔn)確性[3-4]?，F(xiàn)有的基因型填充軟件有很多，常用的有Beagle[5-6]、Impute2[7]、Findhap[8]、AlphaImpute[9]、FAMHAP[10]、FImpute[11]等。基因型填充技術(shù)現(xiàn)已成為一種常規(guī)、有效的工具，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物遺傳育種領(lǐng)域，在豬的相關(guān)研究中，基于填充后的數(shù)據(jù)有助于篩選新的候選基因[12]、提升基因組選擇的準(zhǔn)確性，并降低生產(chǎn)的成本[13-15]。同樣，在牛[16-17]、羊[18]、雞[19]的遺傳育種研究中基因型填充也起到了重要的作用。一方面，基因型填充的效果受到許多數(shù)據(jù)如參考群體大小、參考群體與目標(biāo)群體之間的遺傳關(guān)系、最小等位基因頻率(Minor allele frequency, MAF)等的影響；另一方面，不同填充軟件計(jì)算的質(zhì)控指標(biāo)對填充準(zhǔn)確性也有一定的影響，如Beagle[5-6]軟件的 DR2(Dosage R-squared)、Impute[7]軟件的INFO等。

此前，國內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)對3款芯片之間相互填充的效果進(jìn)行了評估[20]，但對3款芯片填充至序列數(shù)據(jù)的效果鮮有報(bào)道，因此本研究旨在評估3款豬50K SNP芯片基因型填充至序列數(shù)據(jù)的效果，以期為我國豬遺傳研究和分子育種工作提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 芯片群體

本研究所用的48頭杜洛克豬的芯片群體來自廣西某育種場，該群體在紐勤50K、中芯一號50K及液相50K芯片的位點(diǎn)數(shù)分別為50 697、57 466和50 885，具體的位點(diǎn)重疊情況見圖1a。另外，在芯片重疊的位點(diǎn)里，本研究在等位基因精確匹配后評估了3款芯片兩兩之間的一致性與相關(guān)性。

芯片數(shù)據(jù)利用根據(jù)以下步驟進(jìn)行質(zhì)量控制：1)剔除位置重復(fù)或未知的位點(diǎn)；2)剔除非常染色體位點(diǎn)；3)利用Conform-gt軟件校正正反鏈并去除參考群以外的位點(diǎn)。質(zhì)控后紐勤50K、中芯一號50K及液相50K芯片剩余位點(diǎn)數(shù)分別為31 756、29 469和42 311，分別占原始芯片數(shù)據(jù)的62.6%、51.3%和83.2%，質(zhì)控后具體的位點(diǎn)重疊情況見圖1b。

圖1 3款芯片之間的位點(diǎn)分布Fig. 1 Distribution of loci among three chips

1.2 參考群體

本研究使用的全基因組測序參考群體共260頭豬，其中50頭來自福建某種豬場的杜洛克，210頭來自華南地區(qū)的21個(gè)地方豬品種。該群體平均測序深度為14.53×，平均測序覆蓋度為98.85%，經(jīng)過MAF＜0.01的質(zhì)量控制后，本研究使用Beagle5.1對其進(jìn)行單倍型分型(Phasing)，最后參考群體的SNP位點(diǎn)數(shù)為31 407 555個(gè)。

1.3 基因型填充方法及準(zhǔn)確性評估

本研究使用Beagle5.1軟件對芯片數(shù)據(jù)的18條常染色體進(jìn)行基因型填充。評估填充準(zhǔn)確性的步驟如下：1)在填充前將芯片數(shù)據(jù)有序不重復(fù)地缺失5%，共缺失20次；2)根據(jù)保留的95%芯片位點(diǎn)填充缺失的5%芯片位點(diǎn)，共填充20次；3)將20次填充后的結(jié)果合并在一起，從位點(diǎn)水平上以缺失前與填充后的基因型一致性與相關(guān)性作為基因型填充準(zhǔn)確性的評估指標(biāo)。其中，基因型一致性指的是基因型完全一致的個(gè)數(shù)占總基因型個(gè)數(shù)的比例，而基因型相關(guān)性指的是將基因型轉(zhuǎn)換為0、1、2編碼方式后計(jì)算基因型之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。

相比基因型一致性，基因型相關(guān)性更能反映準(zhǔn)確性整體的變化規(guī)律，因此本研究在研究MAF與DR2對填充準(zhǔn)確性的影響時(shí)，均以基因型相關(guān)性作為填充準(zhǔn)確性的指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芯片之間重疊位點(diǎn)的基因型一致性與相關(guān)性

表1展示了3款芯片之間位置與等位基因信息完全重疊的位點(diǎn)基因型一致性與相關(guān)性情況。從表1中可以看出，3款芯片重疊的位點(diǎn)基本保持一致，其中2款固相芯片之間的一致性最高，達(dá)到了0.999；2款固相芯片與液相50K芯片之間的一致性略低，為0.991。

表1 芯片之間重疊位點(diǎn)的基因型一致性與相關(guān)性Table 1 The consistency and correlation of overlapping loci among three chips

2.2 芯片填充至序列數(shù)據(jù)的填充準(zhǔn)確性

表2展示了3款芯片基因型填充后未進(jìn)行任何質(zhì)控處理的填充準(zhǔn)確性情況。從表2中可以看出液相50K芯片的位點(diǎn)基因型一致性最高，達(dá)到0.898，紐勤50K的位點(diǎn)基因型相關(guān)性最高，達(dá)到0.828，此時(shí)，3款芯片填充后的位點(diǎn)數(shù)均為31 407 555。

表2 3款芯片基因型填充至序列數(shù)據(jù)的填充準(zhǔn)確性1)Table 2 The imputation accuracy of three chips from chip data to sequencing data

2.3 MAF與DR2對填充準(zhǔn)確性的影響

本研究將3款芯片合并為一個(gè)整體，研究MAF對填充準(zhǔn)確性(位點(diǎn)的基因型相關(guān)性)的影響，結(jié)果見圖2a。從整體可以看出，隨著MAF的增加，填充的準(zhǔn)確性顯示出上升的趨勢；當(dāng)MAF＜0.1時(shí)，隨著MAF的增加，填充準(zhǔn)確性得到了顯著的提升，而當(dāng)MAF＞0.1時(shí)，填充的準(zhǔn)確性也有提升的趨勢，但提升的程度趨于平緩。其中，質(zhì)控過濾MAF＜0.1的位點(diǎn)時(shí)，紐勤50K、中芯一號50K及液相50K這3款芯片的準(zhǔn)確性分別為0.838、0.835和0.825，而此時(shí)剩余的位點(diǎn)數(shù)分別為7 956 801、8 202 065和 7 717 077。

圖2 MAF、DR2與填充準(zhǔn)確性(基因型相關(guān)性)的分布Fig. 2 Distribution of MAF, DR2 and imputation accuracy (genotype correlation)

DR2可以作為Beagle[5-6]軟件基因型填充后的質(zhì)控指標(biāo)，3款芯片整體的DR2對填充準(zhǔn)確性的影響結(jié)果見圖2b。從圖2b中可以明顯看到DR2與填充準(zhǔn)確性存在較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，其中，質(zhì)控過濾DR2＜0.4的位點(diǎn)后填充的準(zhǔn)確性增長趨勢較為緩慢，當(dāng)逐步剔除0.4≤DR2≤1的位點(diǎn)時(shí)，3款芯片的填充準(zhǔn)確性得到了較有效的提升。相比DR2≥0.4的情況，DR2≥0.6時(shí)，紐勤50K、中芯一號50K和液相50K芯片的填充準(zhǔn)確性分別提升了3.84%、4.16%和3.92%；DR2≥0.8時(shí)，3款芯片的填充準(zhǔn)確性分別提升了9.17%、9.44%和9.88%；當(dāng)DR2≥0.95時(shí)，3款芯片的填充準(zhǔn)確性分別提升了14.95%、14.37%和16.11%，此時(shí)的準(zhǔn)確性分別為0.966、0.959和0.960，剩余的位點(diǎn)數(shù)為3 393 066、3 139 095和 3 320 627。

3 討論與結(jié)論

本研究展示了國內(nèi)3款常用的豬50K SNP芯片的基本情況與基因型填充至序列數(shù)據(jù)的結(jié)果。從芯片的基本情況來看，3款芯片均有較高的SNP檢出率及重疊位點(diǎn)的一致率，3款芯片的SNP位點(diǎn)數(shù)均達(dá)到50K芯片的標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中，中芯一號50K芯片雖然原始位點(diǎn)數(shù)較多，但非多態(tài)的位點(diǎn)也較多，導(dǎo)致填充前質(zhì)控位點(diǎn)后剩余的位點(diǎn)數(shù)較少，一方面的原因是本研究使用的芯片數(shù)據(jù)個(gè)體數(shù)偏少導(dǎo)致位點(diǎn)整體的多態(tài)率較低，另一方面可能是中芯一號50K芯片位置的設(shè)計(jì)原則與其余2款芯片的有較大的出入，但從結(jié)果上看這并沒有導(dǎo)致中芯一號50K芯片基因型填充的效果弱于其余2款芯片。

從芯片的基因型填充的結(jié)果上看，3款芯片的原始填充效果并沒有明顯的差異。此外，在本研究中3款芯片填充后的位點(diǎn)基因型一致性均值為0.890，尚未達(dá)到很高的水平。一方面，已有研究證實(shí)參考群規(guī)模的大小會影響填充的效果[21-22]，本研究使用的參考群體個(gè)體數(shù)為260，在參考群體規(guī)模上一定程度地限制了填充的效果；另一方面，本研究參考群體里杜洛克個(gè)體數(shù)僅為50，個(gè)體數(shù)少導(dǎo)致參考群體的杜洛克單倍型信息并不能很好地囊括整個(gè)品種，進(jìn)而填充的效果降低。

MAF也是影響填充準(zhǔn)確性的一個(gè)重要因素，據(jù)報(bào)道，MAF＜0.05時(shí)，MAF每提升0.01填充準(zhǔn)確性都會得到較大的提升，而MAF≈0.1已經(jīng)與最高點(diǎn)沒有明顯的差異[23-27]，在本研究中，MAF的趨勢也與前人的結(jié)果基本符合。

DR2作為Beagle[5-6]填充的質(zhì)控指標(biāo)，根據(jù)DR2進(jìn)行基因型填充后，位點(diǎn)的質(zhì)控可以最直接地提升基因型填充的準(zhǔn)確性，從而提升全基因組關(guān)聯(lián)分析及基因組選擇等下游分析的效果[28-31]。從本研究的結(jié)果看，當(dāng)DR2≥0.95時(shí)，紐勤50K、中芯一號50K及液相50K芯片的填充效果很好(基因型一致性與相關(guān)性均高于0.950)，但是位點(diǎn)數(shù)也由原來的約4 000萬減少到約300萬。在基因組選擇領(lǐng)域，一方面位點(diǎn)數(shù)的減少可能會導(dǎo)致位點(diǎn)變異解釋的遺傳力降低，從而影響基因組選擇的效果[32]，另一方面位點(diǎn)錯(cuò)誤率升高也會降低基因組選擇的效果[33]，因此在實(shí)際應(yīng)用中，DR2的閾值選取需要研究者根據(jù)自身需求進(jìn)行考量。需要注意的是，DR2和填充準(zhǔn)確性的增長趨勢與Beagle設(shè)置的參數(shù)有效群體大小(ne)有關(guān)，默認(rèn)的參數(shù)較大(1 000 000)，而畜禽育種的有效群體大小相比人類普遍較低，因此基因型填充時(shí)需要根據(jù)參考群體的規(guī)模適當(dāng)進(jìn)行該參數(shù)的調(diào)整，以適應(yīng)更多畜禽育種的群體情況，這有利于提升填充效果[5-6]。

綜上所述，本研究評估了3款豬SNP芯片基因型填充至序列數(shù)據(jù)的效果，結(jié)果表明3款芯片基因型填充至序列數(shù)據(jù)的策略可行，均可獲得較高的填充準(zhǔn)確性。