樊嘉琦，賈 芳，李宇思，周學章

(寧夏大學 生命科學學院, 寧夏 銀川 750000)

奶牛乳腺炎是影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，奶牛乳腺炎發(fā)生時會導致乳腺組織的損傷，也會導致奶牛乳腺上皮細胞(Bovine mammary epithelial cells，BMECs)的存活率降低，牛奶中乳蛋白表達量減少[1]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥及中藥提取物可提高細胞免疫活性，調動組織的自身防御機制，達到治療乳腺炎的目的[2]。黃芪提取物黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ)、黃芪多糖 (Astragalus polysacharin，APS)因具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗應激等多種活性被廣泛報道[3-4]。AS-Ⅳ和APS是黃芪的主要活性成分，可通過清除自由基、降低炎癥因子、保持Ca2＋平衡等方式起到消炎作用。AS-Ⅳ可通過抑制細胞的氧化應激與炎癥反應，減少氨對BMECs的破壞作用[5]；APS可通過提高細胞中抗氧化酶的活性，抑制氧化應激因子的表達，以減弱過氧化氫(H2O2)誘導的BMECs的凋亡[6]；奶牛乳房組織灌注APS注射液可有效抑制隱性奶牛乳腺炎的發(fā)病情況，并提高乳腺組織的免疫水平[7]；使用添加APS的飼料飼喂奶牛可提高奶牛乳腺的免疫力，降低隱性乳腺炎的發(fā)病率[8]；使用發(fā)酵的黃芪粉飼喂奶?？娠@著提高牛奶中乳蛋白含量，降低奶牛乳腺組織中體細胞脫落數(shù)量[9]。上述研究表明APS能抑制隱性奶牛乳腺炎，并能提高動物的免疫力，但是系統(tǒng)的作用機制還不清楚，因此本文研究關于AS-Ⅳ、APS干預脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）刺激BMECs的炎癥反應機制以及對β-酪蛋白表達的影響，以明確AS-Ⅳ、APS抑制BMECs炎癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗細胞

BMECs由寧夏大學生命科學學院王東老師惠贈，培養(yǎng)在含10%(φ)胎牛血清和1%(φ)青鏈霉素的高糖培養(yǎng)基中，所有細胞均在含有5%(φ)CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要儀器及試劑

GE化學發(fā)光檢測儀(美國Promega公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，PCR儀(德國Eppendorf公司)，Nanodrop2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)，熒光定量PCR儀IQ5、酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

AS-Ⅳ、APS、LPS、青霉素、林可霉素、Hoechst 33342染色液、瑞氏-姬姆薩復合染液(北京索萊寶公司)，β-Actin、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 抗體 (Abcam 公司)，TGF-β、ERK1/2、p-ERK1/2、β-酪蛋白抗體(北京博奧森公司)，ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司)，CCK-8試劑盒(大連美侖生物技術有限公司)。

1.3 BMECs炎癥模型建立

1.3.1 CCK-8檢測LPS刺激BMECs的生物學活性 BMECs懸液以1×104個/孔的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁。試驗分為對照組 (CK)，試驗組 (LPS 質量濃度為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L)，空白組，孵育 6、12、18、24 h，每組設置6次重復。棄去培養(yǎng)基，在含10%(φ)CCK-8的培養(yǎng)液中避光孵育3 h，450 nm處測量光密度，并計算細胞存活率。

1.3.2 RT-qPCR檢測LPS刺激BMECs的炎癥因子變化 BMECs懸液以2×105個/孔的密度接種于6孔板中。試驗分為對照組(CK)、試驗組(LPS質量濃度為 0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L)。使用Trizol法提取細胞總RNA。按照HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR(R232)試劑盒說明書步驟逆轉錄合成cDNA。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Q711-03)試劑盒說明書步驟進行RT-qPCR。引物設計參考文獻[10]，具體見表1。

表1 細胞炎癥因子基因表達變化 RT-qPCR引物Table 1 RT-qPCR primers for expression changes of inflammatory genes

1.3.3 觀察LPS刺激奶牛BMECs的細胞形態(tài)變化

BMECs懸液以2×105個/孔的密度接種于6孔板中。試驗分為對照組(CK)、試驗組(LPS質量濃度為 0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L)。加入 500 μL 瑞氏-姬姆薩染液初染2 min，加入1 mL的PBS緩沖液復染5 min，用PBS緩沖液洗掉染色液，在油鏡下觀察細胞形態(tài)。加入500 μL的Hoechst 33342染色液，37 ℃避光孵育20～30 min，用PBS緩沖液洗滌3次，最后用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4 AS-IV、APS、青霉素和林可霉素對BMECs生物學活性的影響

BMECs懸液以1×104個/孔的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁，每組設置6次重復。AS-Ⅳ CCK-8試驗分為對照組(CK)，AS-Ⅳ試驗組 (AS-Ⅳ質量濃度為 12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、300.0 mg /L)和空白組，孵育 1、2、3、4 h。APS、青霉素、林可霉素 CCK-8試驗分為對照組(CK)，APS試驗組(APS質量濃度為 0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 g/L)，青霉素試驗組 (青霉素質量濃度為 50、100、250、500、1 000 mg/L)，林可霉素試驗組(林可霉素質量濃度為50、100、250、500、1 000 mg/L)和空白組，孵育 1 h。試驗方法同“1.3.1”。

1.5 AS-IV、APS干預對LPS誘導BMECs中LDH、MDA、ROS表達的影響

BMECs懸液以2×105個/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁。試驗分為9組，A組為陰性對照組(CK)；B組為LPS刺激組；C組為LPS+1 g/L APS組；D組為LPS+50 mg/L林可霉素組；E組為LPS+50 mg/L青霉素組；F組為LPS+1%(φ)乙醇組；G 組為 LPS+50 mg/L AS-Ⅳ組；H 組為LPS+75 mg/L AS-Ⅳ組；I組為LPS+100 mg/L AS-Ⅳ組。收集處理組樣品上清液，按照乳酸脫氫酶 (Lactic dehydrogenase，LDH)、丙二醛 (Malonaldehyde，MDA)和活性氧 (Reactive oxygen species，ROS)測定試劑盒說明書進行檢測，每組設置3次重復。

1.6 AS-IV、APS干預對LPS誘導BMECs中炎癥因子表達的影響

培養(yǎng)、處理細胞同“1.5”，試驗方法同“1.3.2”。檢測細胞中 IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 炎癥因子基因表達變化，引物見表1。另外，收集處理組樣品上清液，3 000 r/min離心10 min。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測細胞上清液中炎癥因子的分泌。

1.7 AS-IV、APS干預對LPS誘導BMECs中凋亡因子表達的影響

培養(yǎng)、處理細胞同“1.5”，試驗方法同“1.3.2”。檢測細胞凋亡相關基因表達變化，引物設計參考文獻[11]，引物見表2。使用凱基全蛋白提取試劑盒提取細胞全蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。在含125 g/L分離膠、50 g/L濃縮膠的SDS-PAGE凝膠中進行蛋白電泳，將蛋白轉移至PVDF膜。轉膜完成后的PVDF膜轉移至0.5%(w)的脫脂奶粉中，封閉4 h。一抗4 ℃孵育12 h，TBST緩沖液清洗3次。辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液清洗3次。使用ECL化學發(fā)光顯色液曝光和拍照。Western blot法檢測Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達。

表2 細胞凋亡相關基因表達變化RT-qPCR引物Table 2 RT-qPCR primers for expression changes of apoptosis related genes

1.8 AS-IV、APS干預對LPS誘導BMECs中TGF-β、ERK1/2、β-酪蛋白表達的影響

BMECs懸液以2×105個/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁。試驗分為6組：對照組 (CK)、1g/L APS組、乙醇組 (φ為 1%)、50 mg/L AS-Ⅳ組、75 mg/L AS-Ⅳ組、100 mg/L AS-Ⅳ組，試驗方法同“1.3.2”。檢測細胞中TGF-β、ERK1/2、CSN2基因表達變化，引物設計參考文獻[11]，引物見表3。培養(yǎng)、處理細胞同“1.5”，試驗方法同“1.7”，Western blot法檢測 TGF-β、ERK1/2、β-酪蛋白表達。

表3 TGF-β、ERK1/2、CSN2表達變化RT-qPCR引物Table 3 RT-qPCR primers for TGF-β, ERK1/2 and CSN2 expression changes

1.9 統(tǒng)計學分析

使用SPSS22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，所有試驗均重復3次，數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，P＜0.05、P＜0.01為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 BMECs炎癥模型建立

通過CCK-8法檢測LPS刺激BMECs的活性，結果如圖1所示，隨著作用時間的延長和濃度的升高，LPS對BMECs有明顯的抑制作用，選取刺激時間24 h為后續(xù)試驗基礎。通過RT-qPCR檢測LPS刺激BMECs中炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 表達變化，結果如圖2所示，在 0.1～5.0 mg/L LPS刺激細胞 24 h時，IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α炎癥因子基因相對表達量均顯著升高(P＜0.01)。之后分別通過瑞氏-姬姆薩染色和Hoechst 33342染色觀察細胞形態(tài)及細胞核形態(tài)。LPS刺激細胞24 h時細胞形態(tài)及細胞核形態(tài)發(fā)生變化。細胞形態(tài)變化如圖3a所示，與對照組相比，試驗組中細胞核消失，細胞之間連接明顯被破壞；2.5 mg/L LPS處理組細胞形態(tài)顯著改變，細胞出現(xiàn)明顯的凋亡小體。細胞核形態(tài)變化如圖3b所示，與對照組相比，0.1、0.5 mg/L LPS處理組細胞核形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則圓形，1.0、2.5、5.0 mg/L LPS處理組細胞核出現(xiàn)斷裂，隨著LPS濃度的升高細胞核的斷裂增多。將使用0.5 mg/L LPS刺激BMECs 24 h建立炎癥模型。

圖1 不同LPS質量濃度和作用時間下BMECs生物學活性Fig. 1 BMECs bioactivities under different concentrations and action time of LPS

圖2 不同LPS質量濃度對BMECs炎癥因子基因表達的影響Fig. 2 Effects of different LPS concentrations on the gene expression of inflammatory factor in BMECs

圖3 不同質量濃度LPS刺激的BMECs細胞形態(tài)(a)及細胞核形態(tài)(b)變化Fig. 3 Cell morphology (a) and nuclear morphology (b) changes of BMECs stimulated by different concentrations of LPS

2.2 AS-IV、APS、青霉素、林可霉素刺激BMECs的生物學活性檢測

CCK-8法檢測AS-Ⅳ、APS、青霉素、林可霉素對BMECs生物學活性的影響。隨著作用時間的延長和濃度的升高，AS-Ⅳ對BMECs有抑制作用，50、75、100 mg/L AS-Ⅳ作用1 h對細胞沒有毒性，細胞存活率為 100%(圖4a)。0.1、0.25、0.5、1 g/L APS作用1 h對細胞沒有毒性，細胞存活率為100%(圖4b)。50 mg /L青霉素(約86 U/mL)刺激細胞時，細胞存活率達到90%以上(圖4c)。50 mg /L林可霉素刺激細胞時，細胞存活率達到90%以上(圖4d)。將選取 50、75、100 mg /L AS-Ⅳ，1 g/L APS，50 mg /L(86 U/mL)青霉素，50 mg /L林可霉素，作為后續(xù)試驗的基礎。

圖4 AS-IV、APS、青霉素、林可霉素對BMECs存活率的影響Fig. 4 Effects of AS-IV, APS, penicillin and lincomycin on the viabilities of BMECs

2.3 AS-IV及APS干預對LPS刺激BMECs損傷的影響

LDH的表達量可反映細胞膜被破壞程度；MDA是細胞中自由基和脂質發(fā)生氧化反應產(chǎn)生的最終產(chǎn)物，可直接反映脂質過氧化程度；ROS是線粒體有氧代謝時的副產(chǎn)物，一般在細胞中保持平衡狀態(tài)，當其失去平衡時會導致細胞氧化損傷[12]。LDH、MDA、ROS表達分別見圖5a、5b、5c。與對照組(A組)相比，LPS(B組)顯著激活細胞中LDH、MDA、ROS的表達(P＜0.01)。AS-Ⅳ、APS、林可霉素、青霉素均能顯著抑制炎癥細胞上清液中LDH的分泌(P＜0.05或P＜0.01)，其中 100 mg/L AS-Ⅳ(I組)和1 g/L APS(C 組)對LDH的抑制效果最佳；4種藥物均可顯著抑制炎癥細胞中MDA的表達(P＜0.01)，其中100 mg/L AS-Ⅳ(I組)對MDA的抑制效果最好。AS-Ⅳ、APS、青霉素能顯著抑制炎癥細胞ROS的表達(P＜0.05或P＜0.01)，其中 APS(C 組)的抑制效果最佳。

圖5 AS-IV、APS干預對LPS刺激BMECs損傷的影響Fig. 5 Effects of AS-IV and APS interference on LPS damaging BMECs

2.4 AS-IV及APS干預對LPS刺激BMECs中炎癥因子表達的影響

通過RT-qPCR試驗和ELISA試驗檢測4種藥物干預炎癥細胞中 IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 炎性因子的變化。RT-qPCR試驗結果如圖6所示，AS-Ⅳ、APS均能顯著抑制炎癥細胞中IL-6、IL-8、TNF-α3種基因的相對表達(P＜0.05或P＜0.01)，但IL-1β基因的相對表達無顯著變化(P＞0.05)；林可霉素顯著激活炎癥細胞中IL-6、IL-8、IL-1β3種基因的相對表達(P＜0.01)，TNF-α基因的相對表達無顯著變化(P＞0.05)；青霉素顯著提高炎癥細胞中IL-6、IL-8基因的相對表達 (P＜0.01)，IL-1β、TNF-α基因的相對表達無顯著變化(P＞0.05)。ELISA試驗結果如圖7所示，AS-Ⅳ、APS可顯著抑制炎癥細胞中IL-6、IL-8、TNF-α 蛋白的表達 (P＜0.05 或P＜0.01)，其結果與基因變化一致；林可霉素顯著抑制炎癥細胞IL-8蛋白的表達(P＜0.05)；青霉素顯著抑制IL-6、IL-8蛋白的表達 (P＜0.05、P＜0.01)；4種藥物對 IL-1β蛋白的分泌無顯著影響(P＞0.05)。綜上發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ、APS對LPS刺激的BMECs炎性因子表達的抑制效果強于林可霉素、青霉素2種抗生素的抑制效果。

圖6 AS-IV、APS干預對LPS刺激BMECs中炎癥因子基因相對表達量的影響Fig. 6 Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating relative expression of inflammatory factor genes in BMECs

圖7 AS-IV、APS干預對LPS刺激BMECs炎癥因子表達量的影響Fig. 7 Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating the expression of inflammatory factors in BMECs

2.5 AS-IV及APS干預對LPS刺激BMECs中凋亡因子表達的影響

為研究AS-Ⅳ、APS對LPS誘導的BMECs凋亡過程中的細胞保護機制，通過RT-qPCR試驗和Western blot試驗檢測細胞中凋亡相關因子Caspase-3/8/9表達變化。RT-qPCR結果如圖8所示，AS-Ⅳ可以下調炎癥細胞中caspase-3基因的表達，APS和林可霉素對于炎癥細胞中caspase-3/8/9基因均有顯著抑制效果(P＜0.05或P＜0.01)，青霉素可以顯著抑制炎癥細胞中caspase-3/8的表達(P＜0.01)。蛋白變化如圖9、10所示，AS-Ⅳ對炎癥細胞中Caspase-3/8/9蛋白的表達均有抑制效果(P＜0.05或P＜0.01)；APS能顯著抑制炎癥細胞中Caspase-3/8蛋白的表達(P＜0.01)，Caspase-9表達量卻顯著上升(P＜0.01)。因此推測AS-Ⅳ可以通過死亡受體途徑和線粒體途徑共同抑制細胞凋亡；APS則通過死亡受體途徑抑制細胞凋亡。

圖8 AS-IV、APS干預對LPS刺激BMECs凋亡因子mRNA相對表達量的影響Fig. 8 Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating relative expression of apoptosis factor mRNA in BMECs

圖9 AS-IV、APS干預對LPS刺激BMECs凋亡蛋白表達的影響Fig. 9 Effect of AS-IV and APS intervention on LPS stimulating expression of apoptotic protein in BMECs

圖10 AS-IV、APS干預LPS對BMECs凋亡蛋白表達量的影響Fig. 10 Effect of AS-IV and APS intervention on LPS affecting expression of apoptotic protein in BMECs

2.6 AS-IV及APS刺激對 BMECs中TGF-β、ERK1/2、β-酪蛋白表達的影響

本試驗將通過RT-qPCR試驗和Western blot試驗，檢測AS-Ⅳ和APS 2種藥物作用于BMECs后，細胞中 TGF-β、ERK1/2、β-酪蛋白的表達變化。RT-qPCR檢測結果如圖11所示，與對照組相比，APS組顯著激活了TGF-β、ERK1/2基因的相對表達(P＜0.01)，顯著抑制了CSN2基因的相對表達(P＜0.05)；與乙醇組相比，AS-Ⅳ能顯著抑制細胞中ERK1/2基因的相對表達(P＜0.01)，顯著激活CSN2基因的相對表達(P＜0.01)，100 mg/L AS-Ⅳ能顯著抑制細胞中TGF-β基因的相對表達(P＜0.05)。Western blot檢測結果如圖12、13所示，與對照組相比，APS顯著激活細胞中β-酪蛋白(P＜0.05)，極顯著激活ERK1/2蛋白的表達(P＜0.01)，對 TGF-β 蛋白無顯著影響 (P＞0.05)；與乙醇組相比，AS-Ⅳ能顯著抑制細胞中TGF-β、ERK1/2蛋白的表達 (P＜0.05或P＜0.01)，100 mg/L AS-Ⅳ能顯著激活β-酪蛋白表達(P＜0.01)。說明AS-Ⅳ和APS均可激活細胞中β-酪蛋白的表達，但正常狀態(tài)下，AS-IV刺激BMECs中β-酪蛋白表達的效果更好。

圖11 AS-IV和APS對BMECs 中 TGF-β、ERK1/2、CSN2 相對表達量的影響Fig. 11 Effects of AS-IV and APS on relative expression level of TGF-β, ERK1/2 and CSN2 in BMECs

圖12 AS-IV 和 APS對 BMECs 中 TGF-β、ERK1/2、β-酪蛋白表達的影響Fig. 12 Effects of AS-IV and APS on expression of TGF-β,ERK1/2 and β-casein proteins in BMECs

圖13 AS-IV和APS對BMECs 中 TGF-β、ERK1/2、β-酪蛋白表達的影響Fig. 13 Effects of AS-IV and APS on expression of TGF-β, ERK1/2 and β-casein in BMECs

2.7 AS-IV及APS干預對LPS刺激BMECs中TGF-β、ERK1/2、β-酪蛋白表達的影響

AS-Ⅳ和APS 這2種藥物干預炎癥細胞β-酪蛋白及其拮抗蛋白的表達，結果如圖14、15所示。與對照組(A組)相比，LPS(B組)能顯著激活細胞中p-ERK1/2蛋白的表達(P＜0.01)，顯著抑制細胞中β-酪蛋白的表達(P＜0.01)；與炎癥細胞 (B、F組)相比，AS-Ⅳ(G、H、I組)、APS(C 組)、林可霉素(D組)、青霉素(E組)多能顯著抑制炎癥細胞中p-ERK1/2、TGF-β的表達，激活β-酪蛋白的表達 (P＜0.05或P＜0.01)，其中 AS-Ⅳ、APS 對于激活炎癥細胞β-酪蛋白表達效果最好。說明AS-Ⅳ、APS可激活炎癥細胞中β-酪蛋白的表達，抑制炎癥細胞中p-ERK1/2、TGF-β蛋白的表達。

圖14 4種藥物干預對LPS刺激BMECs 中 TGF-β、ERK1/2、β-酪蛋白表達量的影響Fig. 14 Effect of four drugs intervention on LPS stimulating the protein expression of TGF-β, ERK1/2 and β-casein in BMECs

圖15 4種藥物干預對LPS刺激BMECs中TGF-β、ERK1/2、β-酪蛋白表達量的影響Fig. 15 Effect of four drugs intervention on LPS stimulating expression of TGF-β, ERK1/2 and β-casein in BMECs

3 討論與結論

奶牛乳腺組織主要由上皮細胞、原代細胞、干細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞和巨噬細胞等組成，BMECs是乳腺組織中唯一有泌乳功能且高度分化的免疫細胞，BMECs在乳腺組織中正常的生長、分化、繁殖、死亡，一方面保障了乳汁成分的正常合成，另一方面保障了乳腺組織的動態(tài)重塑[13]。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌在隱性奶牛乳腺炎和臨床型奶牛乳腺炎中均是主要致病菌，大腸埃希菌常作為刺激乳腺炎模型的誘導細菌，其在刺激乳腺組織時主要引起急性臨床型乳腺炎[14]。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，其作為細菌的毒力因子是使乳腺炎加劇的主要因素之一。因試驗條件與試驗經(jīng)費的問題常使用大鼠作為研究乳腺炎的試驗模型動物，研究發(fā)現(xiàn)與使用大腸埃希菌刺激乳腺組織相比，使用LPS刺激乳腺組織會引起與大腸埃希菌相似的感染情況及臨床特征，且LPS在刺激乳腺炎方面可表現(xiàn)更好的重復性[15-16]。使用不同劑量的LPS刺激大鼠乳腺組織會導致如漿液性、出血性、卡他性等不同類型的急性乳腺炎，且病理特征與臨床型奶牛乳腺炎的乳腺組織中的病理學特征相似，乳腺炎的損傷程度與LPS濃度呈劑量依賴性，LPS已成為刺激乳腺炎的理想模型[14,17]。長期使用精料飼喂會導致奶牛瘤胃菌群紊亂，致病菌過度繁殖，并持續(xù)釋放LPS，LPS釋放進入血液引起機體的低度炎癥，并在乳腺組織中富集，破壞血乳屏障，誘發(fā)乳腺炎癥反應[18]。多項研究發(fā)現(xiàn)，當乳腺組織中發(fā)生乳腺炎時，不僅會引起組織中多種炎性因子表達被激活，而且會導致組織中乳蛋白及泌乳前體物的表達被抑制[19-20]。林杰[21]使用50 mg/L的LPS刺激奶牛乳腺上皮細胞12 h，發(fā)現(xiàn)炎性因子表達量增加，建立炎癥模型。田青等[22]研究發(fā)現(xiàn)500～25 000 μg/L的LPS刺激大鼠乳腺上皮細胞24 h，會激活細胞中IL-6、IL-1β、TNF-α炎性因子的表達，抑制CSN2和α-LA基因的表達。李瑩瑩[11]采集奶牛養(yǎng)殖場的奶樣發(fā)現(xiàn)，牛奶中乳蛋白率與TGF-β1含量成負相關，當外源添加TGF-β1刺激BMECs會抑制BMECs的細胞增殖，進而上調ERK1/2基因的表達，并抑制CNS2基因的表達。本研究中使用LPS刺激BMECs 24 h，發(fā)現(xiàn)細胞中 IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α炎癥因子基因和蛋白的表達升高，細胞中p-ERK1/2蛋白的表達被激活，細胞中β-酪蛋白的表達被抑制。本研究結果與田青等[22]研究結果類似，證明炎癥狀態(tài)下BMECs中的β-酪蛋白的表達會被抑制，并激活β-酪蛋白拮抗蛋白p-ERK1/2蛋白的表達，以及誘導炎癥因子中促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 的表達。

黃芪具有補陽血、補虛損、愈腎衰等功效，傳統(tǒng)中醫(yī)上被應用于治療氣虛、表虛、水腫及瘡瘍等多種病癥，是我國西北地區(qū)的特色中藥產(chǎn)品之一，已經(jīng)有2000多年的藥用歷史，其滋補效果溫和，現(xiàn)已成為一種新興的保健食品和飼料添加劑[23-24]。黃芪中包含200多種活性成分，其中，AS-Ⅳ、APS是有效成分，AS-Ⅳ、APS具有免疫調節(jié)、抗炎、抗氧化、抗應激、抗病毒、抗腫瘤等多種生物功效[25-26]。近年來，學者們使用BMECs作為體外研究的細胞模型，發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ、APS具有抑制炎癥的作用；王鳳鴿[5]發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ通過抑制氯化銨刺激的BMECs中氧化因子ROS，炎癥因子IL-6、IL-8，凋亡因子BAX、Caspase-3的表達，達到保護細胞的目的；曾涵芳等[6]發(fā)現(xiàn)APS可抑制過氧化氫誘導的BMECs中ROS的表達，激活SOD(超氧化物歧化酶)和GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)的表達，從而緩解細胞的氧化損傷，起到保護細胞的作用。本研究發(fā)現(xiàn)AS-IV、APS這2種中藥提取物均可顯著抑制LPS誘導的BMECs炎癥細胞中炎癥因子(IL-6、IL-8、TNF-α)表達，降低促炎因子持續(xù)分泌，AS-IV、APS 2種中藥提取物可抑制炎癥細胞中炎癥因子的持續(xù)分泌，抗生素對炎癥因子的抑制效果不如ASIV及APS。ROS是細胞代謝過程中產(chǎn)生的氧分子衍生物，當細胞受到外界刺激時會大量產(chǎn)生，使細胞處于氧化應激狀態(tài)，對細胞造成損傷；MDA常用于反映細胞中內脂質過氧化程度。本試驗發(fā)現(xiàn)ASIV、APS可抑制炎癥細胞中ROS、MDA的表達，從而提高細胞抗氧化能力，緩解細胞損傷，降低細胞功能紊亂；且AS-Ⅳ抑制炎癥細胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表達，APS能抑制炎癥細胞中Caspase-3、Caspase-8蛋白的表達，減緩炎癥引起的細胞凋亡。本試驗證明了AS-IV、APS對炎癥細胞具有保護作用，研究結果與王鳳鴿[5]和曾涵芳等[6]的試驗結果相似。綜上所述，AS-Ⅳ、APS可通過抑制細胞中凋亡因子的表達，還原細胞中的氧化平衡，進而保護細胞，并且通過抑制炎性因子的分泌，緩解細胞持續(xù)的炎性損傷。

β-酪蛋白是乳蛋白的主要成分，在BMECs中合成并分泌，可通過β-酪蛋白含量反映動物奶制品品質。中藥成分復雜，具有多功能、多途徑、多靶點的特點，且中藥及中藥提取物可補充動物營養(yǎng)，也可增強機體代謝，提高機體免疫力，多種中藥提取物可激活乳腺上皮細胞中β-酪蛋白的表達，目前對于中藥的催乳機制研究越發(fā)增多[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ刺激的正常細胞及炎癥細胞均可激活β-酪蛋白的表達，抑制β-酪蛋白拮抗蛋白TGF-β、ERK1/2的表達；APS可激活正常細胞及炎癥細胞中β-酪蛋白的表達，不可抑制正常細胞中ERK1/2蛋白表達，但可抑制炎癥細胞中TGF-β、p-ERK1/2蛋白表達；青霉素和林可霉素也可激活炎癥細胞中β-酪蛋白的表達，但AS-Ⅳ、APS對激活β-酪蛋白表達的效果更好。李楠等[28]研究發(fā)現(xiàn)，甲珠、漏蘆、王不留行、蒲公英、通草等中藥均可促進小鼠分泌乳汁，考慮到經(jīng)濟效益，推薦王不留行作為中藥催乳劑為畜牧生產(chǎn)提供方向。本研究結果表明，AS-IV、APS不僅可抑制炎癥細胞中炎性因子、氧化因子、凋亡因子的表達，而且可提高正常細胞及炎癥細胞中乳蛋白的表達與分泌，這證明ASIV、APS對BMECs不僅有抗炎作用，還可激活細胞中乳蛋白分泌及細胞保護，存在有益影響。這為開發(fā)AS-IV、APS成為治療奶牛乳腺炎的藥物提供理論基礎。

中藥提取物AS-Ⅳ、APS可以激活BMECs中β-酪蛋白的表達，且可抑制炎癥細胞中炎癥因子、凋亡因子、氧化因子的表達。本研究提示AS-Ⅳ、APS可作為飼料添加劑飼喂奶?；蛑苽涑芍兴幹苿┲委熑橄傺祝瑸樘岣呷橹破菲焚|、預防治療奶牛乳腺炎提供理論依據(jù)。