馮瑞章，田 婧，韓?？担愇镍P，劉艷麗，魏 琴，梁寒峭*，張勇波

1宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗室，宜賓 644000；2北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100083；3宜賓市龍茂檸檬種植有限公司，宜賓 644000

隨著科技的發(fā)展和人們生活水平的提高，人們對高脂血癥和高膽固醇問題的關(guān)注日益廣泛。據(jù)統(tǒng)計，全世界每天因高脂血癥引發(fā)的心血管疾病死亡人數(shù)近4 000人之多，我國每年因高血脂引起的動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、腦中風(fēng)等心腦血管疾病所導(dǎo)致的死亡人數(shù)以每年12%的速度遞增[1]。為了減少由于肥胖導(dǎo)致的諸多并發(fā)癥的產(chǎn)生，近年來開始有更多研究偏向于通過食療方式降低血脂從而減少引發(fā)的疾病，國外文獻(xiàn)研究[2]嘗試用乳酸菌結(jié)合飲食來調(diào)節(jié)脂肪代謝異常等問題，同時另有研究得出結(jié)論[3]，有益乳酸可以直接改善脂肪質(zhì)量和葡萄糖不耐受的合并健康問題，從而改善肥胖問題。

據(jù)多項研究結(jié)果表明微生物中的不同種類的益生菌具有降膽固醇和改善腸道菌群的作用[4]，例如TMC3115可以改善老年人的腸道微生物和糖脂譜[5]。且證實(shí)降脂作用和改善腸道菌群的作用直接或間接與微生物作用有關(guān)，其中的降脂活性與微生物的種類有關(guān)[6]。例如通過對非酒精性脂肪性肝病患者腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn)，藥物治療仍然是現(xiàn)在最主要的方法，但是雙歧桿菌三聯(lián)活菌聯(lián)合其他藥物也可以對改善腸道菌群從而降低膽固醇起到良好的效果而且在目前來看，在治療非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)方面的報道較少[7]。

檸檬(Citruslimon(L.)Burm.f.)，為雙子葉植物綱蕓香科柑橘屬植物，又叫益母果，來源于東南亞，現(xiàn)四川宜賓為國內(nèi)主產(chǎn)區(qū)之一。檸檬無論作為中藥材還是水果食用，口感都較酸澀，通過發(fā)酵形式制作成發(fā)酵汁后食用較容易被接受。國內(nèi)對于酵素研究近幾年剛剛興起，并不斷出臺新政策和法律法規(guī)，但是對于中藥材直接加工為飲品的方式研究幾乎為空白。本實(shí)驗擬采用微生物技術(shù)，將檸檬運(yùn)用發(fā)酵手法進(jìn)行加工，對其中的益生菌培養(yǎng)分離，并對分離出的菌種進(jìn)行鑒定以及降脂活性的篩選，以達(dá)到優(yōu)選得到具有降脂功能的益生菌目的?？蔀楹笃诮的懝檀家嫔膽?yīng)用進(jìn)行理論依據(jù)的提供[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗材料

新鮮檸檬(采自四川宜賓高縣主產(chǎn)區(qū))。

1.1.2 實(shí)驗儀器與藥品

PHS-3C型數(shù)顯pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；GSP-9080MBE恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；臺式離心機(jī)(EPPENDORFF公司)；島津LC-16高效液相色譜儀(SPD-16紫外可見雙波長檢測器，島津公司)；PCR擴(kuò)增儀(賽默飛世爾公司)；雙目電子顯微鏡(南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司)；KQ5200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AB204-N萬分之一電子天平(瑞士梅特勒儀器有限公司)；不同規(guī)格移液槍(大龍興創(chuàng)實(shí)驗儀器有限公司)。牛膽鹽、膽固醇(上海源葉生物科技有限公司)，瓊脂糖等其余實(shí)驗試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉粉8 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.04 g，吐溫-80 1 mL，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至5.5～5.9之間，高壓滅菌(101 kPa，121℃)30 min，備用。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉粉8 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.04 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至5.5～5.9之間，高壓滅菌(101 kPa，121 ℃)30 min，備用。

高膽固醇MRS-CHOL培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基的配置，參考Liu等[9]的體外試驗文獻(xiàn)，每100 mL MRS培養(yǎng)液為準(zhǔn)，準(zhǔn)確稱量膽固醇0.1 g至于50 mL小燒杯中，加入0.2 g膽鹽、0.1 g蔗糖酯、1 mL吐溫-80攪拌均勻，再移取5 mL冰乙酸于小燒杯中，加熱溶解。把溶解液用超聲波處理15 min后，快速加入到配置好的MRS液體培養(yǎng)基當(dāng)中，邊加入邊攪拌，使其形成均勻穩(wěn)定的膠體溶液。

1.2 內(nèi)生菌分離培養(yǎng)

檸檬內(nèi)生菌分離培養(yǎng)方法參照Wu[10]的試驗方法進(jìn)行修改。取四川宜賓鮮檸檬樣品，無菌水表面清洗后采用無菌濾紙吸干，再用酒精擦拭檸檬表皮后紫外燈照射30 min，使其表皮無菌。用滅菌刀切開檸檬，用滅菌手動榨汁器榨汁得檸檬汁。吸取檸檬汁，分別采用稀釋法、酸堿稀釋法[11]處理。

以無菌水梯度稀釋檸檬汁時，取一支無菌試管，加入9 mL無菌水。然后吸取1 mL檸檬汁加入到9 mL無菌水當(dāng)中，充分搖勻。即得1×10-1倍稀釋溶液，重復(fù)2、3、4次，分別得到濃度為1×10-2、1×10-3、1×10-4g/mL的檸檬汁溶液，各取1 mL進(jìn)行涂布。

酸堿稀釋法處理檸檬汁時，取一個50 mL無菌燒杯，加入適量檸檬汁。用數(shù)顯pH計進(jìn)行酸堿度的調(diào)節(jié)。向檸檬汁中逐滴加入無菌1 mol/L的NaOH溶液，邊加邊攪拌，調(diào)節(jié)pH值分別為6、7、8時，各取1 mL進(jìn)行涂布。

不同方法稀釋后的溶液，涂布于MRS固體培養(yǎng)基中。放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24～48 h。

1.3 內(nèi)生菌的分離純化

觀察涂布培養(yǎng)菌種的生長情況，選取外形多樣、生長良好的菌種，用八區(qū)平板劃線法將挑選出的菌株劃線于MRS培養(yǎng)基上，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后反復(fù)劃線分離純化，得到純化菌株后置于甘油凍存管中低溫保存。

1.4 MRS培養(yǎng)液培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱取出凍存保藏菌種，室溫下解凍。取一支10 mL試管，直接加入5 mL MRS培養(yǎng)液作為空白對照組。另取一只10 mL試管，先加入5 mL MRS培養(yǎng)液，而后將凍存管中的菌種樣品，用移液槍移取100 μL加入到培養(yǎng)液當(dāng)中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，取出后將試管底部菌種搖勻。

1.5 高膽固醇培養(yǎng)基培養(yǎng)

將高膽固醇MRS-CHOL培養(yǎng)基分裝于多個10 mL滅菌離心管當(dāng)中。取出一支離心管直接加入4 mL高膽固醇培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)入1 mL培養(yǎng)24 h后的空白對照MRS培養(yǎng)液，混勻后作為高膽固醇培養(yǎng)液空白對照組，重復(fù)三次；其余每個試管當(dāng)中先加入4 mL高膽固醇培養(yǎng)液，再用移液槍移入步驟“1.4”中培養(yǎng)24 h后的菌液1 mL，在37 ℃恒溫?fù)u床消化48 h。

1.6 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.6.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)膽固醇0.100 0 g，用無水乙醇定容于50 mL棕色容量瓶中，濃度為0.002 g/mL。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

通過參考Zhang[12]的文獻(xiàn)，采用高效液相色譜法測定體外降膽固醇的結(jié)果較為準(zhǔn)確，鄰苯二甲醛法和濃硫酸法結(jié)果影響因素較大，考慮到本實(shí)驗測定的降膽固醇活性較高，因此采用高效液相色譜法。用膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液配成濃度為1、0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 mg/mL的系列使用液，分別進(jìn)樣100 μL進(jìn)行色譜測定，以膽固醇濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 菌種對膽固醇降解率篩選

參考Li[13]對膽固醇的測定方法，采用高效液相色譜法分析。將在高膽固醇MRS-CHOL培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h后的菌種取出，放入離心機(jī)，以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min。用1 mL針筒取上清液1 mL，菌液通過0.22 μm有機(jī)過濾膜過濾，取上清液續(xù)濾液移入上機(jī)小瓶待用，用于高效液相色譜分析。

高效液相色譜條件：色譜柱：C18反相色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：100%甲醇(V/V，分析純)；測定波長：205 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：38 ℃；進(jìn)樣量100 μL。

得到峰面積結(jié)果并記錄，選取膽固醇降解率較好的菌種，重復(fù)上述進(jìn)行復(fù)篩。膽固醇降解率公式如下。

膽固醇降解率=(Ac-As)/Ac×100%

式中，Ac為高膽固醇MRS-CHOL培養(yǎng)液初始膽固醇的峰面積；As為培養(yǎng)后培養(yǎng)液中剩余膽固醇的峰面積。

1.8 菌種鑒定

1.81 6S rDNA和26S rDNA序列測定

根據(jù)Li[14]的文獻(xiàn)研究，進(jìn)行細(xì)菌和酵母DNA的提取。內(nèi)生細(xì)菌采用通用引物：27F(5′-AGAGTTTCATCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對菌株16S rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；內(nèi)生酵母采用通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)擴(kuò)展26S rDNA D1/D2區(qū)基因。

1.8.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

登錄NCBI微生物鑒定系統(tǒng)，將基因測序儀得到的菌株序列提交至GenBank獲取序列號(OM658523-OM658539)，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知菌株序列進(jìn)行同源性比對分析。采用MEGA 7軟件應(yīng)用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并確定分離菌株的分類地位。

2 結(jié)果和分析

2.1 內(nèi)生菌分離純化結(jié)果

采用無菌水稀釋法和酸堿稀釋法處理檸檬汁，由此得到濃度為1×10-2、1×10-3、1×10-4g/mL和酸堿度為6、7、8時的檸檬汁溶液，經(jīng)內(nèi)生菌的培養(yǎng)及分離純化之后，根據(jù)菌株在MRS培養(yǎng)基生長的情況，選擇濃度為1×10-2g/mL、pH為6和7的檸檬汁，培養(yǎng)菌株數(shù)量可達(dá)在300株以上，根據(jù)菌株的生長情況及多樣性，從中篩選出122株檸檬內(nèi)生菌進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過高效液相法得到膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=4 488 129.619x+2 111.418，R2=0.999 9。

2.3 膽固醇降解率

2.3.1 降解率初篩結(jié)果

分離得到的檸檬內(nèi)生菌菌株在高膽固醇MRS-CHOL培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h后，利用高效液相色譜法測定膽固醇含量，與空白對照組對比計算得到膽固醇降解率，將初篩結(jié)果匯總，得到圖1、2，膽固醇降解率初篩結(jié)果在25%以上的菌株共23株。

圖1 1～60號菌種膽固醇降解率初篩結(jié)果

2.3.2 降解率復(fù)篩結(jié)果

對膽固醇降解率初篩結(jié)果在25%以上的菌株，重復(fù)“2.3.1”實(shí)驗操作進(jìn)行高效液相色譜法復(fù)篩，重復(fù)測定三次膽固醇的峰面積取平均值(見表1)。共篩選獲得膽固醇降解率高于25%菌株共17株。

圖2 61～122號菌種膽固醇降解率初篩結(jié)果

表1 菌種膽固醇降解率復(fù)篩結(jié)果

2.4 菌種鑒定結(jié)果

據(jù)BLAST比對結(jié)果，取相似度較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3和圖4)，分析可知28號、38號、39號、76號、79號、92號和94號菌株均與MeyerozymacarpophilaCBS 5256在進(jìn)化樹上處于同一分支，同源性高達(dá)99.65%，親緣關(guān)系最近，可鑒定為卡氏假絲酵母(Meyerozymacarpophila)；62號、97號、98號、101號和118號菌株與MeyerozymaguilliermondiiCBS 2030在進(jìn)化樹上處于同一分支，同源性高達(dá)99.66%，親緣關(guān)系最近，可鑒定為季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)；85號和88號菌株與WickerhamomycesanomalusCBS 5759在進(jìn)化樹上處于同一分支，同源性高達(dá)99.83%和99.48%；可鑒定為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)；89號和90號菌株與PichiamembranifaciensCBS 107在進(jìn)化樹上處于同一分支，同源性高達(dá)99.72%可鑒定為膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)。結(jié)果表明，菌株119號與AcetobacterghanensisLMG 23848處在同一分支，同源性100%，鑒定為加納醋桿菌(Acetobacterghanensis)。

圖3 檸檬內(nèi)生菌酵母屬系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 119號菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

本試驗以膽固醇為底物，采用高效液相色譜法篩選檸檬內(nèi)生菌的膽固醇降解率，再結(jié)合16S或26S rDNA基因序列鑒定。篩選獲得25%以上膽固醇降解率的菌株17株，鑒定結(jié)果為酵母屬16株和醋酸桿菌1株，分別為卡氏假絲酵母，季也蒙畢赤酵母，異常威克漢姆酵母，膜醭畢赤酵母和加納醋桿菌。

最早Shaper實(shí)驗室1963年發(fā)現(xiàn)非洲某些部落大量飲用乳桿菌發(fā)酵的乳制品后，體內(nèi)血清膽固醇含量普遍較低[15]。研究發(fā)現(xiàn)普通動物糞便中排泄的膽固醇比無菌動物排泄的多，而且當(dāng)給這兩種動物同時喂食高膽固醇食物時，無菌動物血液中的膽固醇含量是普通動物的兩倍，這暗示腸道中定居的微生物可能會對腸道中膽固醇的吸收有一定的影響[16-19]。迄今，有大量實(shí)驗證實(shí)不同種類的乳酸菌具有降低膽固醇的效果，其中以嗜酸乳桿菌的材料最為豐富[20]。

本實(shí)驗篩選出多株酵母菌和醋酸桿菌具有降低膽固醇的效果，為后期降脂發(fā)酵食品或藥品的開發(fā)提供了更多的菌種選擇。