王 豪，王 委，劉艷芳，郭志謀，王超然*

1泰州新藥創(chuàng)制服務(wù)中心，泰州 225300；2中國科學院大連化學物理研究所，大連 116023

抑郁癥、焦慮癥和睡眠障礙為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，現(xiàn)代藥理學研究認為其發(fā)病與褪黑素(melatonin，MT)和5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)的含量降低及受體功能下降有關(guān)[1-3]。因而，這些神經(jīng)遞質(zhì)的受體模型常被應(yīng)用于抗精神疾病藥物的研發(fā)，其中，MT1受體激動劑circadin、ramelteon、agomelatine等已在臨床上用于抑郁癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[1,3]。

茶葉由山茶科山茶屬(Camellia)植物的幼嫩葉或芽加工而成，藥食同源，使用歷史悠久?，F(xiàn)代藥理學研究表明茶葉具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、利尿、抗氧化、抗病毒、降血壓等諸多藥理活性[4-6]，茶多酚類化合物一般被認為是茶葉活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[6-8]，然而，茶葉抗精神疾病活性的物質(zhì)基礎(chǔ)并不十分明確，茶葉對褪黑素受體功能的影響也鮮有報道。

為了進一步闡明茶葉抗精神疾病活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究在前期發(fā)現(xiàn)普洱大葉茶(Camelliasinensis)新鮮葉片提取物的乙酸乙酯部分對褪黑素受體具有明顯激動作用的基礎(chǔ)上，基于褪黑素受體激動活性測試模型，在活性跟蹤指導(dǎo)下，綜合運用硅膠柱層析和高效液相色譜等分離技術(shù)，對上述茶葉活性部位進行跟蹤分離，并在HEK293細胞模型上通過鈣流檢測法測試分離化合物對褪黑素受體的激動作用，以期為茶葉的進一步開發(fā)利用和新的抗精神疾病藥物的研發(fā)提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

SGW?X-4B熔點測定儀(上海精密儀器科技有限公司)；1290-6530 LC-QTOF液質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent公司，美國)；Nicolet iS5紅外光譜儀(ThermoFisher公司，美國)；Avance III-600超導(dǎo)核磁共振儀(Bruker公司，德國)；NewstyleTM制備/半制備高效液相色譜儀(漢邦科技有限公司)；柱層析用硅膠及GF254薄層層析板(青島海洋化工廠)；顯色劑為10%的硫酸乙醇溶液；FlexStation 3臺式多功能酶標儀(Molecular Devices，美國)；分析純級陽性對照藥褪黑素(CAS：73-31-4，上海晶純生化科技股份有限公司)；實驗中所用其它試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 材料

實驗用新鮮樣品5 kg采自云南省普洱市，由河南農(nóng)業(yè)大學李家美研究員鑒定為普洱大葉茶Camelliasinensis，標本(20190509)存放于江蘇省手性醫(yī)藥化學品生物制造重點實驗室。

1.3 提取與分離

新鮮普洱大葉茶葉片先用50%乙醇回流提取2次后再用熱水回流提取1次，每次4 h，總提取液濃縮后用乙酸乙酯萃取，得到茶葉乙酸乙酯部分浸膏和水部分浸膏。

對MT1和MT2受體均具有激動作用的茶葉乙酸乙酯部分浸膏(80 g)經(jīng)硅膠柱層析分離，經(jīng)氯仿-甲醇-水梯度洗脫(100∶0∶0、90∶10∶1、80∶20∶2、70∶30∶3、0∶100∶0)粗分得到組分Fr.1～Fr.5，活性組分Fr.3(20 g)經(jīng)硅膠柱層析(氯仿∶甲醇=90∶10)分離得到亞組份Fr.3-1～Fr.3-6，活性亞組分Fr.3-1(0.45 g)再經(jīng)半制備液相色譜(RP C-18，甲醇∶水=10∶90→100∶0)分離得到Fr.3-1-1～Fr.3-1-4，F(xiàn)r.3-1-1再經(jīng)反復(fù)純化得到化合物7(150 mg)，F(xiàn)r.3-1-3(60 mg)經(jīng)凝膠柱層析(LH-20，氯仿∶甲醇=50∶50)純化得化合物8(14 mg)；活性亞組分Fr.3-4(4.6 g)經(jīng)硅膠柱層析(氯仿∶乙酸乙酯=70∶30)洗脫得到4個次組分Fr.3-4-1～Fr.3-4-4，F(xiàn)r.3-4-1(450 mg)經(jīng)硅膠柱層析(氯仿∶丙酮=15∶85)分離得到Fr.3-4-1-1～Fr.3-4-1-3，F(xiàn)r.3-4-1-1和Fr.3-4-1-2再分別經(jīng)凝膠柱層析純化得化合物4(15 mg)和化合物9(6 mg)，F(xiàn)r.3-4-2(1.7 g)經(jīng)半制備液相色譜(MCI，CHP20P，甲醇∶水=10∶90→100∶0)洗脫得Fr.3-4-2-1～Fr.3-4-2-5，F(xiàn)r.3-4-2-3(0.95 g)再經(jīng)硅膠柱層析(氯仿∶乙酸乙酯=80∶20)劃分為Fr.3-4-2-3-1～Fr.3-4-2-3-3，F(xiàn)r.3-4-2-3-2(0.7 g)再經(jīng)硅膠柱層析純化得化合物3(520 mg)；活性組分Fr.3-5(9.3 g)經(jīng)半制備液相色譜(MCI，CHP20P，甲醇∶水=10∶90→100∶0)洗脫得Fr.3-5-1～Fr.3-5-6，F(xiàn)r.3-5-1(1.2 g)經(jīng)硅膠柱層析(氯仿∶甲醇=90∶10)洗脫得到Fr.3-5-1-1和Fr.3-5-1-2，F(xiàn)r.3-5-1-1(0.5 g)先后經(jīng)半制備液相色譜(RP C-18，甲醇∶水=40∶60)和凝膠柱層析(氯仿∶甲醇=50∶50)純化，得化合物6(280 mg)，F(xiàn)r.3-5-1-2(0.4 g)先后經(jīng)硅膠柱層析(氯仿∶乙酸乙酯=40∶60)、半制備液相色譜(RP C-18，甲醇∶水=40∶60)和凝膠柱層析(氯仿∶甲醇=50∶50)純化，得化合物5(50 mg)。

活性組分Fr.4(29 g)經(jīng)硅膠柱層析(氯仿-甲醇-水(90∶10∶1、80∶20∶2))洗脫得到Fr.4-1～Fr.4-7，F(xiàn)r.4-5(1.2 g)經(jīng)半制備液相色譜(MCI，CHP20P，甲醇∶水=10∶90→100∶0)洗脫得到Fr.4-5-1～Fr.4-5-5，其中，活性次組分Fr.4-5-3(0.4 g)再經(jīng)半制備液相色譜(RP C-18，甲醇∶水=15∶85→75∶25)分離得到Fr.4-5-3-1～Fr.4-5-3-6，F(xiàn)r.4-5-3-1(0.12 g)再反復(fù)經(jīng)硅膠柱層析和凝膠柱層析純化，得化合物1(12 mg)；Fr.4-5-3-2(0.20 g)經(jīng)凝膠柱層析純化得到化合物2(13 mg)。

1.4 對褪黑素受體的激動活性測試

被測樣品對褪黑素受體的激動作用在HEK293細胞模型上通過鈣流檢測法測試[6,9]。取培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的杜氏改良培養(yǎng)基中的穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293細胞，接種于Matrigel?Matrix 預(yù)先包被的96孔黑色板(細胞密度為4 × 104/孔)，在含5% CO2的溫箱中培養(yǎng)24 h后，用HDB免洗Fluo-8鈣試劑盒在37 ℃下黑暗中染色1 h，然后分別用被測樣品和陽性藥物處理，室溫下用Flex-Station 3臺式多模式微孔板閱讀器讀取吸收值。以褪黑素作為陽性對照，將陽性對照的激動率設(shè)定為100%，供試樣品對褪黑素受體的激動率以陽性對照的百分比計算[6]。

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末，(+)HR-ESI-MS：m/z331.117 3[M+H]+(calcd for C18H19O6，331.117 6)；(-)HR-ESI-MS：m/z329.098 7[M-H]-(calcd for C18H17O6，329.099 0)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.01(1H，s，H-6′)，6.56(1H，s，H-3′)，5.95(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.93(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，4.43(1H，d，J=9.2 Hz，H-2)，3.83(1H，ddd，J=10.6，9.2，6.0 Hz，H-3)，2.94(1H，dd，J=15.3，6.0 Hz，H-4a)，2.43(1H，dd，J=15.3，10.6 Hz，H-4b)，1.52(3H，s，H-8′)，1.47(3H，s，H-9′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：74.5(d，C-2)，68.0(d，C-3)，28.0(t，C-4)，157.8(s，C-5)，96.6(d，C-6)，156.9(s，C-7)，95.9(d，C-8)，157.9(s，C-9)，101.3(s，C-10)，125.4(s，C-1′)，135.4(s，C-2′)，112.8(d，C-3′)，145.1(s，C-4′)，146.1(s，C-5′)，112.7(d，C-6′)，76.9(s，C-7′)，32.1(q，C-8′)，28.5(q，C-9′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道一致，故被鑒定為(+)-7′,7′-dimethyl-5-hydroxy-2R,3S-trans-pubeschin。

化合物2白色粉末，(+)HR-ESI-MS：m/z347.111 3[M+H]+(calcd for C18H19O7，347.112 5)；(-)HR-ESI-MS：m/z345.097 1[M-H]﹣(calcd for C18H17O7，345.098 0)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.39(1H，s，H-6′)，5.91(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，5.76(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，4.39(1H，s，H-2)，4.24(1H，d，J=5.0 Hz，H-3)，2.86(1H，dd，J=17.4，5.0 Hz，H-4a)，2.74(1H，d，J=17.4 Hz，H-4b)，1.62(3H，s，H-8′)，1.60(3H，s，H-9′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：72.6(d，C-2)，64.6(d，C-3)，26.5(t，C-4)，157.5(s，C-5)，96.2(d，C-6)，156.6(s，C-7)，95.7(d，C-8)，157.8(s，C-9)，99.8(s，C-10)，124.8(s，C-1′)，122.2(s，C-2′)，143.7(s，C-3′)，135.1(s，C-4′)，145.3(s，C-5′)，109.4(d，C-6′)，75.5(s，C-7′)，28.6(q，C-8′)，24.5(q，C-9′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道一致，因而被鑒定為plumbocatechin A。

化合物3白色粉末，(+)HR-ESI-MS：m/z291.086 6[M+H]+(calcd for C15H15O6，291.086 3)；(-)HR-ESI-MS：m/z289.068 1[M-H]﹣(calcd for C15H13O6，289.065 9)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.83(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.75(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.71(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)，5.92(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，5.85(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，4.56(1H，d，J=7.5 Hz，H-2)，3.97(1H，ddd，J=8.2，7.5，5.6 Hz，H-3)，2.84(1H，dd，J=16.4，5.6 Hz，H-4a)，2.50(1H，dd，J=16.4，8.2 Hz，H-4b)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：82.8(d，C-2)，68.8(d，C-3)，28.5(t，C-4)，157.6(s，C-5)，96.3(d，C-6)，156.9(s，C-7)，95.5(d，C-8)，157.8(s，C-9)，100.8(s，C-10)，132.2(s，C-1′)，115.2(d，C-2′)，146.2(s，C-3′)，146.2(s，C-4′)，116.1(d，C-5′)，120.0(d，C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道一致，故被鑒定為(-)-兒茶素。

化合物4白色粉末，(+)HR-ESI-MS：m/z443.097 0[M+H]+(calcd for C22H19O10，443.097 3)；(-)HR-ESI-MS：m/z441.078 9[M-H]﹣(calcd for C22H17O10，441.082 7)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.96(2H，s，H-2′，H-6′)，6.83(1H，s，H-5′)，6.72(2H，s，H-3″，H-7″)，5.96(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.94(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，5.37(1H，ddd，J=6.1，5.9，5.1 Hz，H-3)，5.06(1H，d，J=5.9 Hz，H-2)，2.81(1H，dd，J=16.5，5.1 Hz，H-4a)，2.71(1H，dd，J=16.5，6.1 Hz，H-4b)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：71.1(d，C-2)，79.3(d，C-3)，24.3(t，C-4)，157.5(s，C-5)，96.4(d，C-6)，156.4(s，C-7)，95.6(d，C-8)，158.0(s，C-9)，99.6(s，C-10)，131.4(s，C-1′)，114.4(d，C-2′)，146.2(s，C-3′)，146.2(s，C-4′)，116.2(d，C-5′)，119.2(d，C-6′)，167.6(s，C-1″)，121.3(s，C-2″)，110.1(d，C-3″，C-7″)，146.3(s，C-4″，C-6″)，139.8(s，C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道一致，因而被鑒定為兒茶素-3-氧-沒食子酸酯。

化合物5白色粉末，(+)HR-ESI-MS：m/z459.075 6[M+H]+(calcd for C22H19O11，459.072 2)；(-)HR-ESI-MS：m/z457.041 6[M-H]﹣(calcd for C22H17O11，457.041 2)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.97(2H，s，H-3″，H-7″)，6.40(2H，s，H-2′，H-6′)，5.95(2H，s，H-6，H-8)，5.37(1H，ddd，J=5.3，5.1，4.7 Hz，H-3)，5.05(1H，d，J=5.1 Hz，H-2)，2.76(1H，dd，J=16.3，4.7 Hz，H-4a)，2.71(1H，dd，J=16.3，5.3 Hz，H-4b)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：71.0(d，C-2)，79.1(d，C-3)，23.7(t，C-4)，157.6(s，C-5)，96.3(d，C-6)，156.3(s，C-7)，95.5(d，C-8)，158.1(s，C-9)，99.5(s，C-10)，130.9(s，C-1′)，106.2(d，C-2′，C-6′)，146.9(s，C-3′，C-5′)，133.9(s，C-4′)，167.7(s，C-1″)，121.4(s，C-2″)，110.3(d，C-3″，C-7″)，146.3(s，C-4″，C-6″)，139.8(s，C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道一致，故被鑒定為沒食子兒茶素沒食子酸酯。

化合物6白色粉末，(+)HR-ESI-MS：m/z481.054 6[M+Na]+(calcd for C22H18O11Na，481.054 1)；(-)HR-ESI-MS：m/z457.039 9[M-H]﹣(calcd for C22H17O11，457.041 2)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.94(2H，s，H-3″，H-7″)，6.49(2H，s，H-2′，H-6′)，5.95(2H，s，H-6，H-8)，5.52(1H，brs，H-3)，4.96(1H，s，H-2)，2.97(1H，dd，J=17.3，4.5 Hz，H-4a)，2.83(1H，dd，J=17.3，1.9 Hz，H-4b)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：69.9(d，C-2)，78.6(d，C-3)，26.8(t，C-4)，157.8(s，C-5)，96.5(d，C-6)，157.2(s，C-7)，95.8(d，C-8)，157.8(s，C-9)，99.4(s，C-10)，130.8(s，C-1′)，106.8(d，C-2′，C-6′)，146.7(s，C-3′，C-5′)，133.8(s，C-4′)，167.6(s，C-1″)，121.5(s，C-2″)，110.2(d，C-3″，C-7″)，146.3(s，C-4″，C-6″)，139.8(s，C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道一致，因而被鑒定為表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯。

化合物7白色粉末，(+)HR-ESI-MS：m/z291.083 8[M+H]+(calcd for C15H15O6，291.086 3)；(-)HR-ESI-MS：m/z289.066 0[M-H]﹣(calcd for C15H13O6，289.065 9)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.97(1H，d，J=1.7 Hz，H-2′)，6.79(1H，dd，J=8.2，1.7 Hz，H-6′)，6.75(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，5.93(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，5.91(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，4.80(1H，s，H-2)，4.16(1H，s，H-3)，2.85(1H，dd，J=16.7，4.6 Hz，H-4a)，2.73(1H，dd，J=16.7，2.8 Hz，H-4b)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：79.8(d，C-2)，67.5(d，C-3)，29.2(t，C-4)，157.6(s，C-5)，96.4(d，C-6)，157.4(s，C-7)，95.9(d，C-8)，158.0(s，C-9)，100.1(s，C-10)，132.3(s，C-1′)，115.3(d，C-2′)，145.7(s，C-3′)，145.9(s，C-4′)，115.9(d，C-5′)，119.4(d，C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道一致，故被鑒定為(-)-表兒茶素。

化合物8乳白色粉末，(+)HR-ESI-MS：m/z307.079 1[M+H]+(calcd for C15H15O7，307.081 2)；(-)HR-ESI-MS：m/z305.059 8[M-H]﹣(calcd for C15H13O7，305.060 8)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.39(2H，d，J=1.8 Hz，H-2′，H-6′)，5.91(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，5.85(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，4.51(1H，d，J=7.2 Hz，H-2)，3.95(1H，ddd，J=7.8，7.2，5.3 Hz，H-3)，2.80(1H，dd，J=16.2，5.3 Hz，H-4a)，2.49(1H，dd，J=16.2，7.8 Hz，H-4b)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：82.9(d，C-2)，68.8(d，C-3)，28.1(t，C-4)，157.6(s，C-5)，96.2(d，C-6)，156.9(s，C-7)，95.5(d，C-8)，157.9(s，C-9)，100.7(s，C-10)，131.6(s，C-1′)，107.2(d，C-2′，6′)，146.9(s，C-3′，5′)，134.0(s，C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道一致，因而被鑒定為沒食子酸兒茶素。

化合物9淡黃色粉末，(+)HR-ESI-MSm/z307.079 1[M+H]+(calcd for C15H15O7，307.081 2)；(-)HR-ESI-MSm/z305.059 8[M-H]﹣(calcd for C15H13O7，305.060 8)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.51(2H，d，J=1.8 Hz，H-2′，H-6′)，5.93(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，5.90(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，4.74(1H，s，H-2)，4.12(1H，s，H-3)，2.84(1H，dd，J=16.6，4.6 Hz，H-4a)，2.72(1H，dd，J=16.6，2.9 Hz，H-4b)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：79.9(d，C-2)，67.5(d，C-3)，29.2(t，C-4)，157.7(s，C-5)，96.3(d，C-6)，157.3(s，C-7)，95.9(d，C-8)，158.0(s，C-9)，100.1(s，C-10)，131.5(s，C-1′)，107.0(d，C-2′，6′)，146.7(s，C-3′，5′)，133.6(s，C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道一致，故被鑒定為表沒食子酸兒茶素。

化合物1～9結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～9的化學結(jié)構(gòu)

2.2 對褪黑素受體的激動作用

活性跟蹤指導(dǎo)下得到的化合物對褪黑素受體的激動作用在HEK293細胞模型上通過鈣流檢測法進行測試[1,9]，測試結(jié)果如表1所示，上述9個化合物對褪黑素MT1受體均具有激動作用，同時，化合物1、3、5、7和8對褪黑素MT2受體也具有一定的激動作用。其中，化合物3在0.96 mmol/L濃度時對MT1受體的激動率為362.93%(EC50為46.29 μmol/L)，對MT2受體的激動率為136.13%(EC50為102.41 μmol/L)；化合物1在0.98 mmol/L濃度時對MT1和MT2受體的激動率分別為301.51%和79.37%；化合物4在0.98 mmol/L濃度時對MT1受體的激動率為174.26%，對MT2受體沒有明顯激動作用。

表1 茶葉活性組分及化合物1～9對褪黑素受體MT1和 MT2的激動作用

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)代藥理學研究表明，褪黑素的受體功能和抑郁癥、焦慮癥等精神疾病的發(fā)病與治療密切相關(guān)[1-3]；茶葉具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理活性[4-6]，但其活性物質(zhì)基礎(chǔ)并不十分明確。因而，為進一步闡明茶葉抗精神疾病活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用褪黑素受體MTT法測試模型，在活性跟蹤指導(dǎo)下，從普洱大葉茶的活性部位分離得到9個多酚類化合物，通過HR-ESI-MS及NMR分析并與文獻數(shù)據(jù)比對，鑒定了它們的化學結(jié)構(gòu)?；衔?和2為首次從山茶屬中發(fā)現(xiàn)的黃烷醇類吡喃衍生物，豐富了茶葉的化學信息。

活性測試結(jié)果表明，本研究得到的9個化合物對褪黑素MT1受體均具有一定的激動作用，并且對褪黑素MT1受體的激動作用普遍高于相應(yīng)的對褪黑素MT2受體的激動作用。尤為值得注意的是，化合物(-)-兒茶素(3)含量較高，作為茶葉的大量成分之一，對褪黑素MT1和MT2受體同時具有較高的激動活性，很有可能是茶葉調(diào)節(jié)MT受體而發(fā)揮抗精神疾病活性的主要活性物質(zhì)，其作用機制值得進一步研究。