劉蘭蘭

昆蟲幾丁質(zhì)合成通路的研究進(jìn)展

劉蘭蘭

（西南林業(yè)大學(xué)云南昆明650224）

Candy等早在1962年就發(fā)表了完整的昆蟲幾丁質(zhì)合成通路，并在沙漠蝗蟲中證實(shí)了該通路共有8種酶參與其中。為了進(jìn)一步深入研究昆蟲幾丁質(zhì)的合成通路，文章梳理了該通路中8種酶的相關(guān)研究現(xiàn)狀，通過對(duì)已有相關(guān)研究內(nèi)容的綜合分析，以期為昆蟲幾丁質(zhì)合成通路的后續(xù)科學(xué)研究提供新的思路。

幾丁質(zhì)；合成通路；合成酶；研究進(jìn)展

幾丁質(zhì)作為昆蟲極其重要的結(jié)構(gòu)性組分，參與昆蟲表皮及中腸圍食膜的形成[1]，能幫助昆蟲抵御機(jī)械損傷，減少不良環(huán)境的危害。Candy和Kilby于1962年在沙漠蝗蟲（desertlocust）中首次證實(shí)了完整的昆蟲幾丁質(zhì)合成通路。整個(gè)通路起始于海藻糖，在8種酶的協(xié)助下，生成了最終的產(chǎn)物——幾丁質(zhì)[2]。之后隨著越來越多的研究證實(shí)，這一昆蟲幾丁質(zhì)合成通路已經(jīng)得到驗(yàn)證及公認(rèn)。

盡管昆蟲幾丁質(zhì)合成通路中的8種酶都已經(jīng)明確，其研究深度也從蛋白質(zhì)水平深入到基因水平，但8種酶基因的研究深度及研究進(jìn)展是不平衡的?？傮w來說，海藻糖酶（Tre）和幾丁質(zhì)合成酶（CHS）的研究較為深入，其余6種酶的研究較淺。對(duì)通路中8種酶的研究進(jìn)展進(jìn)行梳理，能更充分地了解昆蟲幾丁質(zhì)合成通路的研究現(xiàn)狀，從而為進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)幾丁質(zhì)合成通路相關(guān)酶的研究及充分利用奠定基礎(chǔ)。

1 幾丁質(zhì)的研究進(jìn)展及其在昆蟲中的功能

1.1 幾丁質(zhì)的發(fā)現(xiàn)

1811年，法國生物化學(xué)家Henri Braconnot發(fā)現(xiàn)了一種來自蘑菇的多糖，并稱之為“真菌素”。后來Odier于1823年發(fā)現(xiàn)這種存在于蘑菇中的多糖在昆蟲中也有存在，由于觀察到這種多糖所發(fā)揮的功能類似于一種包膜或是被膜，Odier在希臘單詞“殼聚糖”的基礎(chǔ)上，將這種多糖命名為“幾丁質(zhì)”[3-4]。

1.2 幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)

從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，幾丁質(zhì)是一種線性的多糖聚合物，純天然的幾丁質(zhì)一般是由比例為5%～20%的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）殘基和氨基葡萄糖（GlcN）殘基所組成的雜聚物[5]。在結(jié)構(gòu)上，幾丁質(zhì)與纖維素的區(qū)別并不大，唯一的不同點(diǎn)是幾丁質(zhì)單體第二個(gè)C原子上的乙酰氨基（—NHCOCH3）與纖維素單體第二個(gè)C原子上的羥基（—OH），如圖1所示。乙酰氨基的替代使得相鄰的幾丁質(zhì)鏈之間的氫鍵大大增加了，從而增強(qiáng)了纖維支架結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度，也使其更易形成多鏈[6]，賦予了幾丁質(zhì)可以構(gòu)建各種細(xì)胞外基質(zhì)支架的能力[7]。

圖1　幾丁質(zhì)（左）與纖維素（右）的部分分子結(jié)構(gòu)

1.3 幾丁質(zhì)在自然界的分布

目前已經(jīng)有大量前人的研究證明，幾丁質(zhì)是自然界中多種生物不容小覷的結(jié)構(gòu)組分[8]，其豐富度已達(dá)到地球上僅次于纖維素，是第二豐富的有機(jī)物[7]。在前人的研究成果中，已發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)主要分布于甲殼動(dòng)物、昆蟲外骨骼及中腸圍食膜，藻類、線蟲、真菌以及軟體動(dòng)物的表皮中，且相關(guān)的大多數(shù)科研工作者認(rèn)為，在高等植物、人類和其他脊椎動(dòng)物體內(nèi)沒有幾丁質(zhì)的存在[9-11]。

1.4 昆蟲中幾丁質(zhì)的功能

在昆蟲中，幾丁質(zhì)既是昆蟲外骨骼的重要成分，也是昆蟲中腸圍食膜的重要成分[1]，其作用如下：

（1）幾丁質(zhì)是昆蟲外骨骼的重要支撐成分，使得昆蟲在保持外在特定形態(tài)的基礎(chǔ)上，還能保護(hù)內(nèi)部器官免受外界的物理損傷，抵御不良環(huán)境帶來的傷害。

（2）幾丁質(zhì)參與昆蟲中腸圍食膜基質(zhì)的形成，能保護(hù)腸道細(xì)胞免受硬度較大的食物顆粒的損傷[12]。前人利用x-射線衍射對(duì)昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，證實(shí)幾丁質(zhì)在生物體中共有3種不同的結(jié)晶形式，如圖2所示，目前3種晶體都已在昆蟲中被證實(shí)存在[13-14]。

圖2　昆蟲幾丁質(zhì)的三種晶體形式[14]

2 昆蟲幾丁質(zhì)合成通路的發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)酶的研究進(jìn)展

2.1 昆蟲幾丁質(zhì)合成通路的發(fā)現(xiàn)

1962年，Candy等在沙漠蝗蟲（desert locust）中驗(yàn)證了完整的幾丁質(zhì)合成通路。該通路全程有8種酶參與催化，首先是海藻糖酶（trehalase, Tre），中間經(jīng)過了糖酵解途徑的2種酶、己糖胺通路的4種酶，最后終止于通路中最重要幾丁質(zhì)合成酶（CHS）[2]，如圖3所示。次年，Jaworski等就將這條通路在中得到證實(shí)，并在上發(fā)表了該成果[15]。之后隨著相關(guān)研究的不斷增多，這一昆蟲幾丁質(zhì)合成通路已經(jīng)被多次驗(yàn)證及公認(rèn)。

圖3　昆蟲合成通路示意圖[16]

2.2 昆蟲幾丁質(zhì)合成通路相關(guān)酶的研究進(jìn)展

2.2.1 海藻糖酶

合成途徑中，第1個(gè)酶是海藻糖酶（trehalase, Tre; EC 3.2.1.28），Tre作為通路中的第一個(gè)催化酶，將一分子的海藻糖催化水解，從而產(chǎn)生兩分子的葡萄糖[17]。昆蟲中有可溶性海藻糖酶（Tre-1）與膜結(jié)合海藻糖酶（Tre-2）這兩大類別的基因。有關(guān)-基因的報(bào)道最早是在1992年，Takiguchi等用同源性基因篩選的方法從黃粉蟲雄性副腺中分離到一個(gè)-基因的cDNA[18]，而-基因直到2005年才被報(bào)道，Mitsumasu等完成了在家蠶（）中的-的分子克隆及其在幼蟲中腸中的定位[19]。Lee等于2007年克隆出了歐洲蜜蜂（European honeybee）的膜結(jié)合海藻糖酶基因-的cDNA序列[20]。隨后在甜菜夜蛾（）褐飛虱（）等昆蟲中都有基因的克隆、分子特征及表達(dá)模式的相關(guān)報(bào)道[21-22]。

2.2.2 己糖激酶

合成途徑中的第2個(gè)酶是己糖激酶（hexokinase, HK; EC 2.7.1.1），它開啟了糖酵解途徑，能催化多種功能蛋白的合成，并調(diào)控細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)錄等活動(dòng)。己糖激酶在昆蟲幾丁質(zhì)合成通路中催化己糖磷酸化，并生成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）[23-26]。

2.2.3 葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶

合成通路中的第3個(gè)酶是葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（G6PI; EC 5.3.1.9），其也是糖酵解途徑的第2個(gè)酶。G6PI是一種二聚體酶，能使得果糖-6-磷酸（F6P）與葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）發(fā)生雙向的異構(gòu)化[27-28]。G6PI不僅在合成幾丁質(zhì)的過程中發(fā)揮重要的作用，作為二聚體酶對(duì)多物質(zhì)的合成都起到了催化作用，同時(shí)G6PI的單體形式還可以作為一種細(xì)胞因子活動(dòng)，如人類脊椎白血病細(xì)胞的分化介導(dǎo)因子和成熟介導(dǎo)因子，以及神經(jīng)白介素等[29-30]。

2.2.4 谷氨酸鹽:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶

合成通路的第4個(gè)酶是谷氨酸鹽:果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶（GFAT; EC:2.6.1.16）。GFAT不但參與幾丁質(zhì)的生物合成和蛋白質(zhì)糖基化的調(diào)控，還是其他復(fù)雜有機(jī)物合成過程中的一種重要酶，如雄性黑果蠅（）唾液腺黏液蛋白合成的第一步就是由GFAT催化的[31]。GFAT也是誘導(dǎo)TGF-β1和纖維連接蛋白在系膜細(xì)胞中表達(dá)所必需的[32]，還被證實(shí)是一種胰島素調(diào)節(jié)酶，在培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用[33]。Huang等（2007）在其研究中報(bào)道了一種來自長角血蜱（）的新型GFAT（GFAT）的分子特征和潛在功能，實(shí)驗(yàn)過程使用RNA干擾GFAT后，成年雌性小鼠的充血率顯著降低。這一效應(yīng)的潛在機(jī)制可能是限制了GFAT的表達(dá)后幾丁質(zhì)的生物合成也受到了抑制，從而破壞了血液喂養(yǎng)過程中角質(zhì)層的生長和圍食膜基質(zhì)的形成[34]。Liu等（2015）的研究表明，凡納濱對(duì)蝦（）胰腺中GFAT的表達(dá)水平會(huì)受到海洋中重金屬殘留和化學(xué)污染物的影響。在pH=9.3和鎘的脅迫下，-基因的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)明顯提升。然而，在這些脅迫下，mRNA的表達(dá)水平在不同的時(shí)間達(dá)到峰值。以上結(jié)果表明，堿性條件（pH=9.3）和鎘的脅迫可刺激-基因的表達(dá)，可能在凡納濱對(duì)蝦對(duì)抗環(huán)境脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[35]。

2.2.5 葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶

合成通路的第5個(gè)酶是葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（GNA; EC 2.3.1.4），催化葡糖胺-6-磷酸（glucosamine-6-phosphate, GlcN6P）生成N-乙酰葡糖胺-6-磷酸（N-acetylglucosamine-6-phosphate, GlcNAc6P）[36-37]。在前人的研究中，已經(jīng)有布氏錐蟲（）、酵母菌和人類的GNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的報(bào)道[38-41]。埃及伊蚊（）的基因表達(dá)也已經(jīng)有了相關(guān)報(bào)道[42]。

2.2.6 乙酰氨基葡萄糖變位酶

合成通路的第6個(gè)酶是乙酰氨基葡萄糖變位酶（AGM; EC 5.4.2.3），它可以轉(zhuǎn)移分子內(nèi)的磷酸基團(tuán)（磷酸轉(zhuǎn)移酶或磷酸基化酶），并催化GlcNAc-6-P和GlcNAc-1-P的可逆轉(zhuǎn)化。在真核生物中，乙?；磻?yīng)發(fā)生在分子內(nèi)磷酸化轉(zhuǎn)移的步驟之前，而在原核生物中，乙?；磻?yīng)發(fā)生在分子內(nèi)磷酸化轉(zhuǎn)移的步驟之后，因此原核生物和真核生物中UDP-GlcNAc的生物合成機(jī)制有所不同[43]。Kato等在2010年克隆了埃及伊蚊（）的基因，該基因在埃及伊蚊的整個(gè)齡期都有表達(dá)[44]。張政等在2019年利用RNAi實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基因的沉默會(huì)致使約30%飛蝗（）出現(xiàn)死亡表型，推測其在飛蝗的新表皮合成過程中發(fā)揮了重要作用[45]。

2.2.7 UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶

合成通路的第7個(gè)酶是UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶（UAP; EC 2.7.7.23），它廣泛分布于自然界中。從賈第鞭毛蟲（）、粗糙脈孢菌（）、豬肝細(xì)胞、小牛肝和酵母菌中均得到部分純化[46-50]。UAP作為關(guān)鍵糖基化蛋白質(zhì)催化N-acetylglucosamine-1-phosphate和UDP-N-acetylglucosamine發(fā)生可逆反應(yīng)，是昆蟲幾丁質(zhì)合成通路中不可缺少的一個(gè)酶。目前在部分昆蟲中已經(jīng)得到基因的測序結(jié)果。Palaka等（2014）證明，埃及伊蚊在缺失UAP的情況下，昆蟲會(huì)由于個(gè)體發(fā)育和外骨骼的形成受到阻礙而死亡[51]。

2.2.8 幾丁質(zhì)合成酶

昆蟲幾丁質(zhì)合成通路中的第8個(gè)酶是幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase, CHS; EC 2.4.1.16），對(duì)于昆蟲的幾丁質(zhì)合成途徑來說，它是最關(guān)鍵、最重要的催化酶。CHS屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族，分子量超過170 kDa[52]，昆蟲中有兩種CHS，分別由（）基因和（）基因編碼?；蛲ǔＴ诶ハx的表皮及氣管中表達(dá)，編碼的酶能催化表皮幾丁質(zhì)、氣管幾丁質(zhì)的形成。基因則是在中腸圍食膜中表達(dá)，編碼的酶催化中腸圍食膜的形成[52-53]。目前在直翅目、鱗翅目、膜翅目、半翅目等多種昆蟲中都有基因的cDNA序列克隆及功能研究。如Ibrahim在2000年就克隆了埃及伊蚊中腸組織中基因的cDNA[54]，汪小東等（2014）采用同源基因克隆技術(shù)克隆了二斑葉螨（）的基因的cDNA全長，并進(jìn)行了序列分析，結(jié)果表明該基因?qū)儆诨蝾愋蚚55]。

3 展望

盡管昆蟲幾丁質(zhì)合成通路中的所有相關(guān)酶都已經(jīng)明確，其研究深度也從蛋白質(zhì)水平深入到基因水平，但人們對(duì)昆蟲中幾丁質(zhì)的生物合成途徑的研究仍不是透徹的，例如幾丁質(zhì)合成酶的跨膜運(yùn)輸模式至今仍然還是處在模型分析的階段。加強(qiáng)進(jìn)一步的研究是該領(lǐng)域正在進(jìn)行的重要工作。

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