鄭韶爵， 朱厚榮， 羅佳佳， 劉攀道， 羅麗娟， 劉國道*， 董榮書*

(1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院， 海南 ?？?570228； 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所， 海南 海口 571101)

磷(Phosphorus，P)是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素之一，參與了生物膜和核酸的合成、新陳代謝、酶的活性調(diào)節(jié)等重要生物過程[1]。我國南方土壤呈酸性，在酸性土壤中可被植物根系直接吸收的無機可溶磷(Inorganic phosphate，Pi)容易被金屬離子及有機物所固定，形成難溶性無機磷和有機磷，導(dǎo)致磷有效性較低，嚴(yán)重限制植物的生長[2]。在農(nóng)業(yè)上，主要通過施用磷肥來緩解土壤缺磷問題，但過量的施用磷肥不僅造成資源浪費，且會導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化等環(huán)境污染問題[3]。因此，提高作物對土壤磷匱乏的適應(yīng)能力及磷效率，對發(fā)展綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)具有重要作用。

提高磷效率是植物適應(yīng)低磷脅迫的重要機制，磷效率主要包括磷吸收效率(P acquisition efficiency，PAE)和磷利用效率(P utilization efficiency，PUE)。在低磷環(huán)境下，植物主要通過調(diào)整根系形態(tài)和構(gòu)型、分泌磷酸酶和有機酸、增強磷轉(zhuǎn)運子活性、加強土壤有益微生物互作等，提高根系從土壤中獲取磷素的能力，以提高磷吸收效率[4]。近十年來，大量科研工作者在植物磷吸收效率機理方面取得了諸多成果，其中部分成果已用于育種實踐，指導(dǎo)培育出一批高磷吸收效率作物新品種，包括水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)等[5-6]。植物提高磷利用效率的機制之一是增加對體內(nèi)含磷代謝物(磷脂、核酸、磷酸化蛋白等有機磷組分)的磷素循環(huán)再利用[7]。植物葉片貯存有大量有機磷，其中磷脂占葉片細胞全磷的15%～20%，是潛在的巨大磷源，故加強磷脂中磷素的循環(huán)再利用，能有效緩解低磷脅迫[8]。在缺磷環(huán)境中，含磷脂質(zhì)(磷脂)可被磷脂酶和酸性磷酸酶等水解，產(chǎn)生無機磷酸根(Pi)和二酰甘油(Diacylglycerol，DAG)，其中Pi被分配到生長活躍器官得到再利用，DAG被用于合成半乳糖脂和硫脂等不含磷脂質(zhì)替代磷脂進行膜脂重塑，維持細胞膜[1]。研究發(fā)現(xiàn)，澳大利亞磷貧瘠土壤上的山龍眼科植物新葉磷脂含量較高，而老葉磷脂含量顯著降低，老葉中磷脂被半乳糖脂和硫脂取代，增加了磷利用率，以適應(yīng)低磷環(huán)境[9]。脂質(zhì)組學(xué)作為代謝組學(xué)的分支，是研究植物磷脂代謝的有效技術(shù)手段[10]。

大葉山螞蝗(Desmodiumgangeticum)是豆科蝶形花亞科山螞蝗屬多年生亞灌木植物，具有根系發(fā)達、抗逆性強、生物量大、蛋白質(zhì)含量高等優(yōu)點，屬于南方熱帶地區(qū)優(yōu)良牧草和飼料作物之一[11-12]。我國南方土壤普遍面臨低磷脅迫的問題，大葉山螞蝗卻生長良好，而其對低磷脅迫的適應(yīng)機制仍不清楚。因此，本研究將通過脂質(zhì)組學(xué)，初步分析大葉山螞蝗葉片對缺磷脅迫的響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養(yǎng)條件

本研究所用的大葉山螞蝗種子材料是由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究提供。試驗在海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院科研基地大棚中開展，大葉山螞蝗采用Magnavaca營養(yǎng)液(表1)進行水培。試驗流程如下：篩選大小一致、飽滿均一的種子，在80℃水浴鍋中熱激3 min，放于墊有潤濕濾紙的培養(yǎng)皿避光萌發(fā)2～3 d，待幼根伸長1～1.5 cm，再轉(zhuǎn)移至含300 μmol·L-1KH2PO4營養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)10 d。挑選長勢良好、均一的幼苗，分別進行正常供磷(+P，300 μmol·L-1KH2PO4)和缺磷脅迫處理(-P，0 μmol·L-1KH2PO4)。營養(yǎng)液pH為5.8～6.0，每隔3 d換一次每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。分別在處理0 d,5 d,10 d,15 d收取地上部和根系樣品，用于生物量和全磷含量的測定。處理15 d時收取所有葉片，用液氮速凍后，于-80℃保存用于脂質(zhì)代謝組學(xué)分析。

表1 改良的Magnavaca營養(yǎng)液配方Table 1 Modified Magnavaca nutrient solution formulation

1.2 試驗方法

1.2.1生物量與全磷含量測定 生物量測定：樣品收獲后放入烘箱中105℃殺青20 min，70℃恒溫烘干至恒重后稱量。

全磷含量測定：將收取的大葉山螞蝗地上部和根系烘干樣品用液氮研磨成粉末，放回烘箱烘至恒重后稱取0.05 g于50 mL消煮管中，加入5 mL濃硫酸，搖勻后放置4 h，使用消煮爐消煮。當(dāng)溶液冒白煙時逐漸升高溫度，始終保持微沸狀態(tài)30 min。當(dāng)溶液呈棕黑色時加入5～8滴30%過氧化氫，邊滴邊搖晃消煮管至溶液無色，再消煮20 min后冷卻，雙蒸水定容至50 mL，溶液澄清后待測。參照Murphy和Riley[13]鉬銻抗比色法測定OD700吸光度值，計算全磷含量。

1.2.2脂質(zhì)分子提取 大葉山螞蝗葉片的脂質(zhì)代謝組學(xué)分析在深圳華大基因BGI生物科技有限公司進行。脂質(zhì)代謝物的提取參考Chauhan等[14]方法進行，略作修改：稱取25 mg樣品放入1.5 mL Eppendorf管中，加入800 μL -20℃預(yù)冷的提取液(二氯甲烷∶甲醇=3∶1，V∶V)和10 μL SPLASH內(nèi)標(biāo)儲液，管內(nèi)加入兩顆鋼珠，將混合物放入研磨儀中進行研磨(50 Hz，5 min)，隨后進行水浴超聲(4℃，10 min)，放入-20℃冰箱靜置1 h。樣品離心(4℃，25000 rpm，15 min)。離心后取600 μL上清液進行凍干，加入200 μL重組溶劑(異丙醇∶乙腈∶H2O=2∶1∶1，V∶V∶V)進行復(fù)溶，渦旋震蕩1 min，4℃條件下水浴超聲10 min后離心(25 000 rpm，15 min)，取出鋼球，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL上樣瓶中。每個樣本的上清液各取20 μL混合成QC質(zhì)控樣本，用于評估LC-MS分析過程的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

本試驗采用Waters 2D UPLC(Waters，USA)串聯(lián)Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientifific，USA)來進行代謝物的分離和檢測。

1.2.3基于高效液相色譜-質(zhì)譜的代謝組分析 參考McLoughlin等[15]方法進行脂質(zhì)代謝物的分離、鑒定和定量分析，略作修改。色譜條件：采用CSHC18柱(1.7 μm，2.1×100 mm，Waters，USA)進行UPLC分析。正離子模式的流動相由溶劑A(0.1%甲酸、60%乙腈水溶液、10 mM甲酸銨)和溶劑B(0.1%甲酸、10%乙腈水溶液、90%異丙醇和10 mM甲酸銨)組成。為了進行比較，溶劑A和溶劑B分別為在負離子模式下，不含甲酸(0.1%)。設(shè)置梯度洗脫方法如下：40%～43% B(0～2 min)；43%～50% B(2～2.1 min)；50%～54% B(2.1～7 min)；54%～70% B(7～7.1 min)；70%～99% B(7.1～13 min)；99%～40% B(13～13.1 min)；40% B(13.1～15 min)。流量設(shè)置為0.35 mL·min-1，柱溫度保持在保持在55℃。注射量設(shè)置為5 μL。

質(zhì)譜條件：利用Q Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientifific，USA)進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。質(zhì)譜掃描的電荷質(zhì)量比(m/z)在200～2 000m/z以內(nèi)。MS1分辨率、自動增益控制(AGC)和最大注入時間(MIT)分別為70 000 ms、3 e6和100 ms。根據(jù)前驅(qū)體離子強度，選擇前3個離子進行MS2分析，并將MS2分辨率、AGC和MIT的參數(shù)分別調(diào)整到17，500，1 e5和50 ms。階梯式歸一化碰撞能量(NCE)值分別設(shè)置為15，30和45 eV。電噴霧電離(ESI)參數(shù)設(shè)置為：鞘氣流速40 L·min-1，輔助氣體流速10 L·min-1，正離子模式下3.80(|KV|)噴霧電壓，負離子模式下3.20(|KV|)，離子傳輸管溫度320℃，輔助氣加熱器溫度350℃。為了保證檢測過程中結(jié)果的可靠性，對樣品進行了隨機排序，以減少系統(tǒng)誤差。在整個分析分析過程中，每10個樣品注入一次QC樣品。

差異脂質(zhì)代謝物的鑒定：以Fold Change≥2或Fold Change≤0.5，且P<0.05條件下篩選出差異顯著的脂質(zhì)代謝物。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Microsoft Excel 2019軟件(Microsoft，美國)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和可視化作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Standard error，SE)表示。利用SPSS 18.0軟件(IBM-SPSS，美國)對同一時期大葉山螞蝗不同磷水平處理下的各指標(biāo)進行獨立樣品T檢驗方差分析。脂質(zhì)分析采用LipidSearch version 4.1(Thermo Fisher Scientific，USA)進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析篩選出潛在脂質(zhì)分子，數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaX進行數(shù)據(jù)預(yù)處理和后續(xù)分析。采用SIMCA-P 14.0進行有監(jiān)督的主成分分析(Principal component analysis，PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺磷脅迫對大葉山螞蝗生長的影響

如圖1所示，缺磷脅迫會抑制大葉山螞蝗生長。從-P處理的10 d開始，地上部的干重顯著降低了29.9%～56.0%(P< 0.01，圖1B)。但是，-P處理5 d和10 d對根系生長有促進作用，表現(xiàn)為根系干重顯著增加33.9%～24.0%(P<0.05)(圖1C)。+P處理相比，-P處理5～15 d，大葉山螞蝗地上部和根系磷含量顯著降低52.38%～87.95%和54.55%～77.78%(P<0.01，圖1D,E)。以上結(jié)果表明，缺磷脅迫顯著抑制了大葉山螞蝗地上部的生長，降低了地上部和根系全磷含量，而短期缺磷處理(5 d和10 d)會促進了根系的生長。

圖1 缺磷脅迫對大葉山螞蝗的生長和生理指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of low phosphorus stress on the growth and physiological indictors of Desmodium gangeticum注：(A)缺磷脅迫下大葉山螞蝗在不同時期的生長表型；(B)地上部干重；(C)根系干重；(D)地上部磷含量；(E)根系磷含量。*表示同一時期正常供磷(+P)和缺磷處理(-P)條件下差異顯著，*：P < 0.05，**：P < 0.01；***：P < 0.001。下同Note:(A) Growth phenotypes of D. gangeticum at different periods under low phosphorus stress;(B) Shoot dry weight;(C) Root dry weight;(D) Shoot P content;(E) Root P content. *,** and *** indicate significant difference between +P and -P treatments under the same stages at 0.05,0.01 and 0.001 level,respectively. The same as below

2.2 大葉山螞蝗葉片響應(yīng)缺磷脅迫的脂質(zhì)組分析

對-P處理與+P處理的大葉山螞蝗葉片進行脂質(zhì)組分析。PCA結(jié)果顯示，-P處理的3個生物學(xué)重復(fù)(-P_1，-P_2，-P_3)與+P處理的3個生物學(xué)重復(fù)(+P_1，+P_2，+P_3)在第一主成分(PC1)明顯分離，分別聚為一類，可以解釋66.7%脂質(zhì)代謝物的差異變化，表明處理間的差異明顯，可用于后續(xù)分析(圖2A)。大葉山螞蝗葉片脂質(zhì)代謝組共檢測到240個脂質(zhì)，其中無顯著差異脂質(zhì)158個，占所檢測到脂質(zhì)的65.83%；-P處理上調(diào)脂質(zhì)43個，占所檢測到脂質(zhì)的17.92%；-P處理下調(diào)脂質(zhì)39個，占所有代謝物的16.25%(圖2B)。

圖2 脂質(zhì)代謝物主成分分析(A)及火山圖(B)Fig.2 Principal component analysis of lipid metabolites (A) and volcanic plot (B)注：(A)橫軸為第一主成分(PC1)，縱軸為第二主成分(PC2)。(B)綠色為下調(diào)的顯著差異脂質(zhì)代謝物，紅色為上調(diào)的顯著差異脂質(zhì)代謝物，不顯著的脂質(zhì)代謝物為灰色Note:(A)The horizontal axis is the first principal component (PC1) and the vertical axis is the second principal component (PC2). (B) Significantly differentially down-regulated lipid molecules are in green,significantly up-regulated differential lipid molecules are in red,and insignificant lipid molecules are in gray

將82個差異脂質(zhì)(上調(diào)脂質(zhì)43個，下調(diào)脂質(zhì)39個)進行分類，其可分為甘油磷脂類(GP)、糖脂類(SL)、甘油脂類(GL)、固醇脂類(ST)四大類(圖3)。其中，39個下調(diào)的代謝物全為甘油磷脂類，包括磷脂酰乙醇胺(14個)、磷脂酰甘油(8個)和磷脂酰肌醇(6個)等八個亞類；43個上調(diào)的代謝物均為不含磷的脂質(zhì)，包括糖脂類(38個)，甘油脂類(3個)和固醇脂類(2個)。以上結(jié)果表明，缺磷脅迫導(dǎo)致大葉山螞蝗葉片中含有磷酸基團的甘油磷脂質(zhì)的相對含量降低，而不含磷的脂質(zhì)的相對含量顯著增加。

圖3 差異脂質(zhì)代謝物分類Fig.3 Classification of differential lipid metabolites注：綠色為下調(diào)的差異脂質(zhì)代謝物，紅色為上調(diào)的差異脂質(zhì)代謝物。縮寫分別表示GP,甘油磷脂類;SL,糖脂類;GL,甘油脂類;ST,固醇脂類;PE,磷脂酰乙醇胺;PG,磷脂酰甘油;PI,磷脂酰肌醇;PA,磷脂酸;PS,磷脂酰絲氨酸;PC,磷脂酰膽堿;LPC,溶血磷脂酰膽堿;PEth,磷脂酰乙醇;DGDG,雙半乳糖基二酰甘油酯;MGDG,單半乳糖二?；视王?SQDG,硫代異鼠李糖二酰基甘油;MGMG,單半乳糖單?；视王?DGMG,雙半乳糖基單酰甘油酯;SQMG,硫代異鼠李糖單酰基甘油;StE,豆甾醇酯;SiE,谷甾醇酯;DG,甘油二酯Note:Green represented down-regulated differential lipid metabolites,red indicated up-regulated differential lipid metabolites. Abbreviations represented that GP,glycerophospholipids;SL,saccharolipids;GL,glycerolipids;ST,lipids;PE,phosphatidylethanolamine;PG,phosphatidylglycerol;PI,phosphatidylinositol;PA,phosphatidic acid;PS,phosphatidylserine;PC,phosphatidylcholine;LPC,lyso-phosphatidylcholine;PEth,phosphatidylethanol;DGDG,digalactosyldiacylglycerol;MGDG,monogalactosyldiacylglycerol;SQDG,sulfoquinovosyldiacylglycerol;MGMG,monogalactosylmonoacylglycerol;DGMG,digalactosylmonoacylglycerol;SQMG,sulfoquinovosy-lmonoacylglycerol;StE,stigmasteryl ester;SiE,sitosteryl ester;DG,diglyceride

2.3 缺磷脅迫對大葉山螞蝗葉片甘油磷脂積累的影響

脂質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，缺磷脅迫下大葉山螞蝗葉片中鑒定到39個顯著下調(diào)的脂質(zhì)，均為甘油磷脂類(圖4)。其中，與+P處理相比較，-P處理的大葉山螞蝗葉片中，下調(diào)的磷脂酰乙醇胺(PE)有14個(相對含量降低了50.69%～98.31%)，下調(diào)的磷脂酰甘油(PG)有8個(相對含量降低了50.25%～86.41%)，下調(diào)的磷脂酸(PA)有5個(相對含量降低了53.27%～69.88%)，下調(diào)的磷脂酰肌醇(PI)有6個(相對含量降低了50.98%～82.08%)，下調(diào)的磷脂酰絲氨酸(PS)有3個(相對含量降低了55.95%～81.95%)，及磷脂酰膽堿PC(32∶0) 相對水平降低了62.11%，溶血磷脂酰膽堿LPC(18∶2) 降低了64.99%，磷脂酰乙醇PEth(34∶1) 降低了79.12%。以上結(jié)果顯示，下調(diào)數(shù)目和相對含量降低最多的是PE，其次是PG。

圖4 顯著下調(diào)差異脂質(zhì)代謝物Fig.4 Significantly down-regulated differential lipid metabolites注：其他類包含了磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)、磷脂酰乙醇(PEth)Note:Others including phosphatidylcholine (PC),lyso-phosphatidylcholine (LPC),phosphatidylethanol (PEth)

2.4 缺磷脅迫對大葉山螞蝗葉片糖脂、固醇脂和甘油脂積累的影響

脂質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，缺磷脅迫下大葉山螞蝗葉片中鑒定到43個顯著上調(diào)的脂質(zhì)代謝物，其均為不含磷的脂質(zhì)(圖5)。其中，糖脂類(上調(diào)38個)尤為顯著，13個雙半乳糖基二酰甘油酯(DGDG)上調(diào)幅度最大的為DGDG(40∶1)(34.78倍)；7個硫代異鼠李糖二?；视?SQDG)上調(diào)幅度最大的為SQDG(35∶0)(9.38倍)；7個單半乳糖二酰基甘油酯(MGDG)上調(diào)最高的為MGDG(42∶1)(17.51倍)；雙半乳糖基單酰甘油酯(DGMG)和單半乳糖單酰基甘油酯(MGMG)均包含4個上調(diào)的代謝物，上調(diào)最高的分別為DGMG(24∶0)(1332.57倍)和MGMG(23∶4)(18.25倍)；3個硫代異鼠李糖單?；视?SQMG)上調(diào)最高的為SQMG(18∶0)(8.40倍)。此外，3個固醇脂類最高上調(diào)的是豆甾醇酯StE(18∶3)(3.75倍)，2個甘油脂類最高上調(diào)的是甘油二酯DG(35∶2)(2.57倍)。以上結(jié)果顯示，在缺磷脅迫下，大葉山螞蝗葉片中大量不含磷的脂質(zhì)的積累增加。

圖5 顯著上調(diào)的差異脂質(zhì)代謝物Fig.5 Significantly up-regulated differential lipid metabolites

3 討論

低磷脅迫會抑制植物的生長發(fā)育[16]。大量研究顯示，缺磷會顯著降低植物磷含量，進而抑制植物地上部的生長，降低其生物量。本研究也發(fā)現(xiàn)缺磷脅迫處理大葉山螞蝗的10 d和15 d時，其地上部生長明顯受抑制(圖1A)，地上部和根系磷含量也均顯著降低(P<0.05，圖1D,E)。該結(jié)果與其他植物中表現(xiàn)一致，比如柱花草(Stylosanthesguianensis)、水稻、大豆、白羽扇豆(Lupinusalbus)等[17-20]。

在低磷脅迫下，植物通過調(diào)整根系形態(tài)和構(gòu)型，促進對外源磷的獲取效率以提高磷吸收效率，包括增強側(cè)根的生長、增加根毛密度、擴大根系分布范圍等，這是植物適應(yīng)低磷環(huán)境的有效策略之一[1,21]。本研究也發(fā)現(xiàn)，短期(5 d和10 d)的缺磷處理會促進大葉山螞蝗根系生長，但隨著缺磷處理時間延長(10 d)，根系生長也會受到抑制(圖1)。表明當(dāng)遭受缺磷脅迫時，大葉山螞蝗可能通過分配更多的碳水化合物至根系，促進其快速生長，以期獲取更多的磷營養(yǎng)響應(yīng)磷饑餓脅迫。

在缺磷環(huán)境中，植物加強對體內(nèi)含磷代謝物的活化再利用以提高磷利用效率，包括核酸、磷脂、磷酸糖和磷酸化蛋白等[22]。磷脂是生物膜的主要組成成分，脂質(zhì)磷占植物有機磷庫的30%，在低磷環(huán)境中，磷元素供應(yīng)不足，植物會通過降解膜磷脂釋放Pi，再通過大量合成不含磷的脂質(zhì)替代磷脂，維持生物膜完整性，幫助植物在缺磷環(huán)境下生存[1]。磷脂的循環(huán)再利用主要包括兩個關(guān)鍵代謝過程，即磷脂降解和膜脂重塑。對于磷脂降解，含磷脂質(zhì)(磷脂)通過磷脂酶水解，可釋放Pi，供植物再利用[23]。前人研究顯示，低磷脅迫下，多個作物根系中的多種磷脂水平顯著降低，包括大豆、木豆(Cajanuscajan)、玉米[19,24-25]。本研究也發(fā)現(xiàn)，缺磷脅迫下大葉山螞蝗葉片大量磷脂代謝物相對水平顯著降低，主要包括PE、PG和PA等(圖3,4)。結(jié)果暗示，大葉山螞蝗葉片中大量含磷脂質(zhì)被降解再利用，是其適應(yīng)缺磷脅迫的重要策略之一。對于膜脂重塑，是植物通過磷脂降解產(chǎn)生的DAG為骨架，大量合成不含磷的脂質(zhì)(如半乳糖脂質(zhì)、硫脂、葡萄糖醛酸脂等)替代含磷膜脂，維持生物膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性[1]。對擬南芥(Arabidopsisthaliana)、燕麥(Avenasativa)和山龍眼科(Proteaceae)等植物中已被證實，在缺磷環(huán)境中，磷脂可以被半乳糖脂、硫脂和葡萄糖醛酸脂等不含磷的脂質(zhì)取代以釋放出磷酸基團[9,26-28]。本研究中，缺磷脅迫下的大葉山螞蝗葉片中大量不含磷的脂質(zhì)(38個糖脂、3個類固醇脂和2個甘油脂)相對水平顯著升高(圖3,5)。結(jié)果暗示，缺磷環(huán)境下，大葉山螞蝗葉片中磷脂被不含磷的脂質(zhì)替換，在維持細胞膜完整性的同時促進了體內(nèi)磷的循環(huán)再利用。

4 結(jié)論

綜上所述，磷的缺乏顯著抑制大葉山螞蝗地上部的生長，降低其全磷含量。大葉山螞蝗可能通過促進根系生長，加強葉片含磷脂質(zhì)(主要是PE，PG和PA等)的降解和大量累積不含磷的脂質(zhì)(主要是半乳糖脂和硫脂)，提高體內(nèi)的磷利用效率，以適應(yīng)缺磷脅迫。