孫勝男，劉凡，曾令益，陳旺，任莉，徐理，方小平

（中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，湖北 武漢，430062）

十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌（Plɑsmodiophorɑ brɑssicɑeWoronin）引起的一種世界性病害，寄主范圍廣，嚴重威脅著十字花科作物的生產(chǎn)。根腫病為土傳病害，其休眠孢子能在土壤中存活多年，防治困難。十字花科作物中蘿卜對根腫菌的抗性整體上比白菜、油菜和甘藍等抗性強[1,2]，前期也有通過遠緣雜交將蘿卜中的抗病基因?qū)氲礁仕{型油菜中的案例[3]。但遠緣雜交困難，需要不斷回交親本，周期長，并且對受體親本有負面連鎖累贅性狀的影響?？傮w而言油菜的抗根腫病育種在我國的進展也較為緩慢。因此利用對蘿卜等其它抗病材料的研究，有助于我們了解根腫病的抗病機制，制定根腫病的防治策略，并且能夠利用優(yōu)質(zhì)的抗病資源增加油菜品種的遺傳多樣性。

根腫菌侵染過程一般分為兩個階段，即根毛（初級）侵染和皮層（次級）侵染[4]。在根毛侵染階段，休眠孢子萌發(fā)釋放初級游動孢子，初級游動孢子形成初級原生質(zhì)團，然后割裂分化成次級游動孢子囊，寄主的表型在此階段沒有變化;而在皮層侵染階段，次級游動孢子囊萌發(fā)產(chǎn)生次級游動孢子會侵染皮層[5]，次級游動孢子在皮層細胞內(nèi)會逐漸發(fā)育并分化成大量的休眠孢子囊，造成寄主的根部異常膨大。

根腫菌侵染植物前期沒有任何癥狀，但后期寄主根龜裂腐爛，大量的休眠孢子會被釋放到土壤中，其發(fā)病周期長，這給根腫菌的早期防治帶來困難，并且增大了防治難度。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展和應用，PCR 作為一種快速精確的技術(shù)能夠可靠地檢測植物和土壤中的病原菌含量。關(guān)格格等[6]通過優(yōu)化PCR 反應體系對根腫菌含量進行檢測和病害評估，此方法檢測根腫菌DNA 時不受細菌和寄主植物內(nèi)生菌等的干擾。因此，通過PCR 技術(shù)可以對寄主根內(nèi)以及土壤中的根腫菌含量進行定量，為根腫病的早期病害診斷和防治提供依據(jù)。

植物在被病原菌侵染后會產(chǎn)生一系列防御反應，一些防御酶包括過氧化物酶（POD），超氧化物歧化酶（SOD）, 過氧化氫酶（CAT）等可能通過參與清除細胞內(nèi)的活性氧從而起著重要的調(diào)控作用，因而防御酶的活性變化與植物的抗病性緊密相關(guān)[7]。植物體內(nèi)受活性氧水平升高毒害時，SOD 最先表現(xiàn)出在植物中的抗逆作用[8]。POD 則可以通過抗氧化作用保護細胞膜[9]，同時POD 活性在特定的組織中隨著環(huán)境的改變（生物脅迫）發(fā)生急劇變化，參與多種植物防御機制，比如發(fā)生在細胞壁的木質(zhì)化反應[10]。POD、SOD 以及CAT 均在植物抗病機制中起到一定作用，但酶活與植物抗病的相關(guān)性結(jié)果在前人研究中存在分歧，防御酶在植物抗根腫病機制中的作用有待進一步明確。

可溶性糖作為一類滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，包括蔗糖、果糖和葡萄糖等。相關(guān)研究結(jié)果表明可溶性糖含量的變化與病害的抗性有關(guān)。Evans 等[11]研究了根腫菌未侵染和侵染后擬南芥中蔗糖的積累情況，結(jié)果顯示受根腫菌侵染后的擬南芥葉片中未能觀察到蔗糖積累，說明寄主植物在被根腫菌侵染后增加了對糖的需求。從目前的研究結(jié)果看，可溶性糖含量升高可以增加植物抗性。但可溶性糖在根腫病中的相關(guān)作用還有待探究。

本研究前期通過對十字花科植物進行根腫病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)油菜缺乏抗病品種，而蘿卜整體上抗性高于油菜及其它十字花科作物，因此我們對多個蘿卜品種進行了篩選，并鑒定到一個免疫蘿卜品種。通過抗、感病蘿卜接種根腫菌后的侵染過程觀察，比較接菌后蘿卜根毛和皮層侵染差異，根內(nèi)含菌量的變化、抗、感蘿卜根內(nèi)防御酶活性和可溶性糖含量變化的測定，以期探索蘿卜抗病機理，為制定油菜等十字花科作物對根腫病的防治策略提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株和蘿卜品種：根腫病發(fā)病病根（油菜）采自湖北省宜昌市枝江市，提取休眠孢子后用Williams 鑒別系統(tǒng)鑒定為根腫菌4 號生理小種[5]，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩蓚€蘿卜品種為‘JYY’和‘GLS’，分別購買自北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心和臺灣興農(nóng)種業(yè)公司。

1.2 方法

1.2.1 制備根腫菌孢子懸浮液病及接種 根腫病病根抽提得到休眠孢子懸浮液[3,12,13]，用血球計數(shù)板調(diào)整孢子懸浮液孢子濃度為5×107/mL。培養(yǎng)土按照營養(yǎng)土和蛭石體積1:1的比例，混合均勻。每40 g培養(yǎng)土裝于直徑8 cm，高度8 cm 的營養(yǎng)缽中，每一個缽子5 株苗。培養(yǎng)條件為20℃，光周期設(shè)置16 h光照8 h黑暗。采用注射法[13]對苗期7 d的兩個品種的蘿卜進行接種，每一個缽子接種20 mL的菌液，對照采用等量蒸餾水處理。

1.2.2 病害分級標準以及病情指數(shù)計算 根腫菌病害分級分為4 級[14]。0 級：寄主的根正常發(fā)育；1級：主根正常發(fā)育，少部分側(cè)根有腫大；2 級：主根發(fā)育正常，大部分側(cè)根形成腫瘤；3 級：主根膨大并有部分側(cè)根會形成腫瘤。

蘿卜接種根腫菌45 d后，每個重復取30株蘿卜根清洗干凈，調(diào)查發(fā)病情況，計算發(fā)病率并按照根腫菌的病害分級標準計算病情指數(shù)，最終結(jié)果為3個重復的平均值。發(fā)病率計算如下：

發(fā)病率=[n（發(fā)病株數(shù)）／N（調(diào)查總株數(shù)）]×100%

病情指數(shù)計算：

病情指數(shù)=[Σ（各級發(fā)病株數(shù)×級數(shù)）]／（調(diào)查總株數(shù)×最高病情級數(shù)）×100

1.2.3 侵染過程觀察 根腫菌接種蘿卜后3、11和14 d 分別取蘿卜根部，每個處理每個時期取3～4 株幼苗根放置于苯胺藍染液（50%乙酸配制，濃度為125 mg/L）中染色1 min，切下靠近主根上部的側(cè)根2～3 cm，然后用蒸餾水洗去浮色，置于載玻片上用顯微鏡（DMRX50）進行根毛侵染過程的觀察[15,16]。

取接種后13、23 和33 d 的蘿卜莖根連接處2～3 cm，然后置于固定液中（乙醇：乙酸=1:1），每個處理每個時期3株用于后續(xù)石蠟切片。皮層侵染的石蠟切片和組織染色由武漢賽維爾生物科技有限公司完成。石蠟切片的步驟為：先將新鮮組織固定并修切好組織，然后進行組織脫水、包埋和切片。組織番紅固綠染色的步驟為：先將石蠟切片脫蠟后并酒精梯度復水后用番紅染液染色，洗去多余染料并脫色后再用固綠染液染色，最后脫水將切片透明封片[17]。制備好的切片用顯微鏡（DMRX50）進行皮層侵染過程的觀察。

1.2.4 根內(nèi)含菌量測定 為了監(jiān)測抗感病蘿卜接種后不同時期根內(nèi)含菌量的變化，提取根腫菌DNA后 梯 度 稀 釋 為108fg、107fg、106fg、105fg、104fg 和103fg，采用qPCR 制作標準曲線；取對照及接種處理后7、13、32 和45 d 的蘿卜根，每個處理取3～4 株，3次重復，液氮快速冷凍后放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

用絕對定量法測定接種后不同時期蘿卜根內(nèi)含菌量。稱取研磨后的0.1 g 蘿卜根用CTAB 法提DNA，用于PCR 檢測含菌量大致情況和qPCR 對蘿卜根內(nèi)的根腫菌進行定量（提取根腫菌DNA 后根據(jù)qPCR 的Ct 值，對應標準曲線計算根腫菌含量）。PCR 反應體系為：模板DNA 1μL，2×Taq Plus Master Mix 10 μL，Primer F 0.5 μL，Primer R 0.5 μL，補充RNase-free ddH2O 至20 μL；擴增程序為：95℃預變性4 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，34 個循環(huán)，72℃延伸10 min。qPCR 用三步法，qPCR 反應體系為：樣品DNA 2 μL，2×Real universal Mix（SYBR Green blue）10 μL，Primer F 和Primer R分別為0.5 μL，補充RNase-free ddH2O 至20 μL。qPCR 擴增程序為：95℃預變性15 min，95℃變性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。

2×Taq Plus Master Mix 購于南京諾唯贊生物科技 股 份 公 司；2×Real universal Mix（SYBR Green blue）購于天根生化科技有限公司。普通PCR 和定量PCR（qPCR）的引物[18]（表1）合成由武漢擎科有限公司完成。

表1 PCR和qPCR引物序列Table 1 Primers sequences of PCR and qPCR

1.2.5 根部防御酶活性和可溶性糖含量測定 取對照及接種處理后3、13 和25 d 的蘿卜根用于酶活和可溶性糖含量測定，每個時期每個處理取0.1 g根作為1次重復，共設(shè)置3次重復。過氧化物酶（POD）活性檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒以及植物可溶糖含量檢測試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司。

POD 活性的測定：稱取0.1 g組織，加1 mL 提取液冰浴勻漿。8000g，4℃離心10 min，取上清置于冰上待測。1 mL 比色皿中加入實驗試劑（樣本用提取液稀釋5 倍后加入）混勻，并記錄樣品在470 nm下30 s 的吸光值A(chǔ)1 和90 s 的吸光值A(chǔ)2，△A=A2-A1。然后根據(jù)公式計算POD活性（W為樣本質(zhì)量）：

POD活性（U/g）=35665×△A÷W

SOD 活性的測定：稱取0.1 g 組織，加0.5 mL 提取液冰浴勻漿；放置于離心機8000g，4℃離心10 min，取上清置于冰上待測。樣品測定時在1、2、3和4 號管加入實驗試劑后混勻并置于1 mL 玻璃比色皿測定在560 nm 下的吸光度，△A 測定=A1-A2，△A空白=A3-A4。先計算抑制百分率：

抑制百分率=（△A空白-△A測定）÷△A空白×100%

保證抑制百分率在30%～70%范圍內(nèi)，再根據(jù)SOD 計算公式SOD 活性（W：樣本質(zhì)量，F(xiàn)：稀釋倍數(shù)）：

SOD 活性（U/mg）=11.4×抑制百分率÷（1-抑制百分率）÷W×F

CAT 活性的測定：稱取0.1 g 組織，加入1 mL 提取液后進行冰浴勻漿。放置于離心機8000g，4℃離心10 min，取上清置于冰上待測。樣品測定時實驗試劑加入1 mL比色皿中，室溫下立即測定240 nm下的初始吸光值A(chǔ)1 和1 min 后的吸光值A(chǔ)2，計算△A=A2-A1。最后根據(jù)公式計算樣品中CAT 的活性（W為樣本質(zhì)量）：

CAT活性（U/mg）=678×△A÷W

可溶糖含量測定：先將標準品用蒸餾水梯度稀釋0.3、0.2、0.1、0.05、0.025和0.0125 mg/mL；然后空白管1、測定管2 和標準管3 加入實驗試劑，混勻后95℃水浴10 min，冷卻室溫后取200μL 轉(zhuǎn)移至96孔板，于620 nm 處測定吸光值，記為A1、A2 和A3，計算△A=A2-A1，△A 標準=A3-A1。以吸光度A（x）為橫坐標，濃度（y）為縱坐標，建立標準曲線。根據(jù)標準曲線，計算出△A，再根據(jù)可溶糖計算公式，可溶糖（mg/g）=10y ÷ W，計算出樣品中可溶糖的含量（W為樣本質(zhì)量）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和GraphPad Prism（8.0）軟件進行數(shù)據(jù)分析，應用多重比較法（HSD）進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蘿卜品種對根腫菌的抗病性

對兩個蘿卜品種接種45 d 后的發(fā)病情況進行調(diào)查，感病蘿卜品種‘GLS’的發(fā)病率為92.3%，病情指數(shù)為76.49；抗病蘿卜品種‘JYY’的發(fā)病率為0，病情指數(shù)為0。

表2 兩蘿卜品種的發(fā)病率和病情指數(shù)Table 2 Disease incidence and disease index of two radish varieties

2.2 抗、感病蘿卜接種根腫菌后的表型

對抗、感病蘿卜接種后不同時期的根部表型進行觀察。在接種后第25 d（圖1A），感病蘿卜根部開始出現(xiàn)輕微腫大；在接種后第33 d（圖1B），感病蘿卜根部出現(xiàn)明顯的腫大并形成根瘤，大量側(cè)根形成腫瘤，根表面成灰黑色；在接種后第45 d（圖1C），感病蘿卜主根異常膨大，呈不規(guī)則狀，有較大的黑疤面積，部分側(cè)根也有較大腫瘤?？共√}卜在接種后不同時期，根部發(fā)育正常，側(cè)根發(fā)達并且無腫瘤產(chǎn)生。表型觀察表明接菌后第25 d 到第45 d 是根腫菌快速繁殖及病害發(fā)展的關(guān)鍵時期。

圖1 兩個蘿卜品種接菌后第25 d（A）、33 d（B）和45 d（C）的根部表型Fig.1 Disease symptom of two radish varieties after 25(A),33(B),45(C)days post-inoculation with P.brassicae

2.3 抗、感病蘿卜接種根腫菌后的組織學特征

2.3.1 根腫菌侵染抗、感病蘿卜的根毛 分別對接種3、5、9、11 和14 d 蘿卜的根部取樣進行根毛侵染觀察，其中對照組蘿卜根毛無侵染（圖2A、B）,而接種根腫菌的抗、感病蘿卜均能看到明顯的根毛侵染。接種第3 d 為根毛吸附階段，感病品種的根毛外吸附了大量的根腫菌休眠孢子，游動孢子將其原生質(zhì)體注入根毛，空的孢子囊呈絮狀粘附在根毛細胞上（圖2C）；而抗病品種的根毛周圍有少量的根腫菌休眠孢子，并且游動孢子大部分吸附于主根上（圖2D）。接種后第11 d，受侵染的大部分根毛內(nèi)由原生質(zhì)團形成了游動孢子囊，感病品種中游動孢子囊的分化處于高峰期（圖E）；而抗病品種受侵染根毛內(nèi)形成游動孢子囊的根毛數(shù)量相對較少（圖F）。至接種第14 d，感病品種可以觀察到表皮侵染（圖G）；而抗病品種還處于游動孢子囊分化階段（圖H）。結(jié)果表明，不管是感病品種還是抗病品種受根腫菌侵染后，根部都能發(fā)生根毛侵染，但皮層侵染僅發(fā)生在感病品種中。不僅抗、感病蘿卜中根腫菌發(fā)育進程有差異，同一品種根腫菌發(fā)育程度也存在很大差異，同一時期根內(nèi)出現(xiàn)根腫菌的不同發(fā)育的階段，有些根毛內(nèi)根腫菌還處于次級原生質(zhì)團階段，但有些根毛內(nèi)的根腫菌已經(jīng)分化成次級游動孢子囊。

圖2 抗、感病蘿卜的根毛侵染過程Fig.2 Dynamics of root hair infection by P.brassicae in susceptible and resistant varieties

2.3.2 抗、感蘿卜皮層侵染的組織學觀察 進一步對接種后13、23、和33 d 的抗、感病品種的根進行組織切片以觀察皮層侵染。結(jié)果顯示，接種后第13 d感病品種和抗病品種的根橫剖面沒有太大的區(qū)別（圖3A-D），但在感病品種中，幾個相鄰細胞之間的細胞壁開始溶解并相互融合成一個大的細胞，數(shù)量較多（圖3A-B）。在接種后第23 d，感病品種皮層細胞大部分處于次級原生質(zhì)團分化成休眠孢子囊的階段，開始出現(xiàn)淀粉粒，細胞排列略為混亂（圖3E-F）；抗病蘿卜遠離維管束的皮層細胞有少量的原生質(zhì)團狀態(tài)的根腫菌，但沒有能夠進一步發(fā)育成成熟次級原生質(zhì)團，并且根部的維管束結(jié)構(gòu)完整（圖3G-H）。在接種后第33 d，感病品種的皮層細胞充滿著大量的休眠孢子囊，細胞膨大的數(shù)量較多，并擠壓維管束，組織細胞形態(tài)部分變形（圖3I-J）；抗病品種的皮層細胞排列正常，沒有休眠孢子囊形成（圖3K-L）。對比接種后抗感蘿卜的皮層侵染切片，根腫菌正常完成次級侵染并產(chǎn)生休眠孢子囊是感病品種根部膨大的主要原因。

圖3 抗、感病蘿卜皮層侵染過程觀察Fig.3 Dynamics of cortical infection by P.brassicae in susceptible and resistant varieties

2.4 抗、感病蘿卜接種根腫菌后的根內(nèi)含菌量檢測

為了監(jiān)測抗、感病蘿卜接種后不同時期根內(nèi)含菌量的變化，對各個時期的蘿卜根提取DNA 后進行含菌量檢測。PCR 結(jié)果顯示對照組未被污染并且引物具有良好特異性；抗病品種和感病品種接種后各時期均能檢測到根腫菌，但是感病品種各個時期的擴增條帶均亮于抗病品種（圖4A）。

通過qPCR 構(gòu)建不同濃度標準曲線，根腫菌含量與循環(huán)閾值Ct 的線性回歸方程為Y= -3.906X +44.08（R2= 0.9999＞0.99），線性關(guān)系良好（圖4B）。根腫菌接種后，抗病蘿卜根內(nèi)的根腫菌含量在25 d達到峰值后下降，在第45 d 根內(nèi)含菌顯著低于第25 d；感病品根內(nèi)含菌量在接種后7～25 d 差異不顯著，但是在接種后25～45 d 的根中顯著增長。接種后第7 d，抗病品種根內(nèi)含菌量顯著低于感病品種（HSD，P＜0.05）；在接菌后第13 d 和25 d，抗感病蘿卜根內(nèi)含菌量無明顯差異；但在接菌后第45 d，抗病品種中的根內(nèi)含菌量極顯著低于抗病品種（HSD，P＜0.01，圖4C）。這與表型觀察結(jié)果一致，接菌后25～45 d，根腫菌在感病植株體內(nèi)快速繁殖（圖1），是其根部腫大形成腫瘤的直接原因。。

圖4 抗、感蘿卜接種后不同時間根內(nèi)含菌量的變化Fig.4 PCR detection of P.brassicae in roots of 2 radish varieties at 7,13,25 and 45 d post-inoculation

2.5 抗、感蘿卜接種根腫菌后根部防御酶及可溶性糖含量差異分析

2.5.1 抗、感蘿卜接種后不同時間根部防御酶活性分析 植物在遭受病原物侵染時候，植物體內(nèi)的防御酶會有不同程度的變化。為了了解抗、感蘿卜接種后的防御酶活性差異，對接種后不同時間的抗、感蘿卜根部的防御酶活性進行測定。結(jié)果顯示，感病蘿卜在接種后第13 d POD 活性顯著高于對照組（HSD，P＜0.05）；而抗病蘿卜在接種后第3 d POD 活性顯著高于對照組（HSD，P＜0.05）；抗病蘿卜在接種后第3 d 和第25 d 后POD 活性顯著高于感病蘿卜（HSD，P＜0.05）?？共√}卜在接種后第3 d SOD 活性顯著高于對照組，為對照組活性的2.7倍；抗病蘿卜在接種后第3 d SOD 活性顯著高于感病蘿卜，是感病蘿卜活性的2.4 倍。感病蘿卜在接種后第3、13、25 d CAT 活性分別為431.03 U·g-1、552.81 U·g-1和443.72 U·g-1，CAT 活性顯著高于對照組（HSD，P＜0.05）；抗病蘿卜在接菌后第25 d CAT 活性顯著高于對照組（HSD，P＜0.05）；感病蘿卜在接種后第3、13 和25 d CAT 活性均顯著高于抗病蘿卜（HSD，P＜0.05）。

2.5.2 抗、感蘿卜接種后不同時間根部可溶糖含量分析 可溶性糖是植物抗病中重要的非酶類物質(zhì)，為探究可溶糖在植物抗病過程中的作用，對抗、感病蘿卜接菌后不同時期根部的可溶糖含量進行測定。首先構(gòu)建了可溶性糖濃度與吸光度的標準曲線，得到可溶性糖和吸光度之間的線性回歸方程為Y=0.3204X-0.007941（R2=0.9983 ＞0.99），線性關(guān)系良好?？?、感病蘿卜在接種后第13和25 d根部可溶糖含量均顯著大于其對照組（HSD，P＜0.05）?？共√}卜在接種后第3 d 的根部可溶糖含量顯著大于感病蘿卜（HSD，P＜0.05）；而在接種后第13 d 顯著低于感病蘿卜（HSD，P＜0.05）。

結(jié)果說明，在接種后第13 d和第25 d（次級侵染期），根腫菌均會誘導抗、感蘿卜根內(nèi)可溶糖的積累。在根腫菌建立初侵染時期感病蘿卜較抗病蘿卜積累較多的可溶糖，但是在次級侵染時期，抗病蘿卜相對于感病積累更多的糖。

3 討論

油菜作為我國的重要油料作物，近年來其生產(chǎn)嚴重受到根腫病的威脅，盡管前期培育了具有抗根腫病品種的油菜，比如華雙5R 和華油雜62R[19,20]等，但長期種植單一抗病位點的材料，并隨著生理小種的不斷變異，抗病品種會發(fā)生抗性喪失的現(xiàn)象。本研究中的蘿卜材料對多個地區(qū)的生理小種均表現(xiàn)出免疫，對蘿卜的初步抗病研究，有助于我們了解不同十字花科作物對病原菌的表現(xiàn)，并且為制定根腫病防治計劃提供了依據(jù)。

根腫菌侵染過程包括根毛侵染和皮層侵染，大量研究結(jié)果表明根腫菌接種抗病寄主、感病寄主以及非寄主植物后均會發(fā)生根毛侵染[21,22]。本實驗結(jié)果顯示在抗、感蘿卜中觀察到根毛侵染，與前人研究一致，并且在感病蘿卜中觀察到次級游動孢子囊的時期要早于抗病品種。在感病蘿卜中，次級游動孢子產(chǎn)生的次級原生質(zhì)團逐漸增多并發(fā)育成熟，形成大量的休眠孢子囊，細胞組織變形；而在抗病蘿卜皮層細胞中，次級游動孢子不能發(fā)育成成熟的次級原生質(zhì)團，不能形成休眠孢子囊，組織細胞正常無變形，證實皮層侵染只發(fā)生在感病寄主中?？?、感病蘿卜表型觀察結(jié)果也與組織切片的結(jié)果一致，皮層侵染的發(fā)生是根腫菌寄主感病的直接原因[22,23]。推測在抗病蘿卜中，次級原生質(zhì)團的形成過程中可能會引發(fā)其產(chǎn)生抗病反應，阻斷根腫菌的進一步繁殖。

根腫菌侵染植物發(fā)病周期長，并且早期根部無癥狀，不利于根腫病的早期診斷和防治。常規(guī)的PCR 檢測可以檢測病原菌的有無，但無法進行精確定量。而實時熒光定量PCR 能夠準確對檢測潛伏的病原菌并進行定量[24]，靈敏度高，在植物病害流行研究中廣泛使用[25]。qPCR 技術(shù)也被用于根腫病的病害研究上，運用此技術(shù)能夠檢測不同抗病性寄主（甘藍型油菜ECD02、白菜ECD05 和ECD13、甘藍ECD15 以及兩個油菜品種P2008-6 和P2008-10）和非寄主小麥在接種后不同時期根內(nèi)的根腫菌含量，結(jié)果表示最早可以在接種后第5 d 對寄主根內(nèi)根腫菌精確定量[26]。本實驗在接種后第7 d的抗、感品種中檢測到的根腫菌含量為107fg/g 和108fg/g，感病蘿卜的根內(nèi)含菌量極顯著高于抗病蘿卜，可用于鑒別抗病和感病蘿卜，推測油菜相關(guān)的根腫病研究中，也可用此方法進行材料鑒定，提早預防。抗病品種根內(nèi)含菌量先上升后下降，而感病品種中根內(nèi)含菌量上升，與表型觀察的結(jié)果一致。此外，與Cao 等[26]檢測高抗寄主和高感寄主根中的含菌量時的結(jié)果一致。寄主體內(nèi)含菌量的測定，不僅可以監(jiān)測根腫菌在寄主體內(nèi)的動態(tài)變化，并且為蘿卜和油菜等十字花科作物的生產(chǎn)上根腫病早期診斷和預測提供研究基礎(chǔ)。

圖5 抗、感蘿卜品種在接種根腫菌后不同時間根部防御酶活性Fig.5 Defensive enzyme activities in roots of two radish varieties at different times after inoculation

植物識別到病原菌入侵后，能夠激活植物體內(nèi)抗病反應，其中包括產(chǎn)生氧爆發(fā)引起細胞程序性死亡。氧爆發(fā)產(chǎn)生的活性氧對植物信號傳導及調(diào)節(jié)多種細胞過程都有重要作用[27]，但過多的活性氧不被清除，則會毒害細胞。植物為了阻止此現(xiàn)象，建立了抗氧化保護系統(tǒng)，其中就包括POD、SOD和CAT等防御酶系[28]。SOD 在清除自由基上發(fā)揮作用，而CAT 和POD 則是清除植物組織中過多的H2O2，幫助H2O2分解成氧氣和水，增強植物抗逆水平。CAT 能通過催化分解氧爆發(fā)產(chǎn)生過量的H2O2產(chǎn)生水和氧氣，減輕氧化傷害，增強植物的抗逆水平。對不同抗枯萎病類型的棉花品種中POD 和SOD 活性的研究結(jié)果表示，在田間發(fā)病條件下，感病品種中SOD和POD 活性最高，而抗病品種最低，說明可以用酶活性差異來鑒別棉花品種的抗病類型[29]。兩個抗感性不同的蘿卜品種受根腫菌休眠孢子侵染之后，抗病蘿卜接菌后的POD 活性和SOD 活性均高于感病蘿卜，與Xu等[30]在易感蚜小麥中與抗病相關(guān)酶變化的研究結(jié)果中POD 的變化一致。POD 與植物抗病性有關(guān)，可能是因為其與木質(zhì)素合成有關(guān)，木質(zhì)素含量可以影響細胞壁的強度，抵御病原物的入侵[31]。抗病蘿卜的CAT 活性在接種根腫菌后始終低于感病品種蘿卜，推測CAT 活性與抗病性成負相關(guān)，這與山茶花對灰斑病研究結(jié)果一致[32]。植物在逆境脅迫后，具有CAT 活性的相關(guān)蛋白能更夠結(jié)合水楊酸（SA）抑制CAT 活性，H2O2濃度的升高進而激活寄主體內(nèi)一些抗病基因的表達，從而提高植物的抗性[33]。綜上，蘿卜在被根腫菌侵染后，防御酶活性會發(fā)生不同程度的變化。其中，抗病蘿卜根部POD 和SOD活性高于感病品種，而CAT 的活性低于感病品種，表明較高的POD 和SOD 活性和較低的CAT 活性有利于蘿卜對根腫菌的抗性。

圖6 抗、感病蘿卜接種后根內(nèi)可溶性糖含量變化Fig.6 Soluble sugar contents in roots of two radish varieties at different times after inoculation

關(guān)于可溶性糖與抗病性之間的關(guān)系有兩種說法，一種認為可溶性糖含量和寄主抗病程度沒有直接關(guān)系，不同組分糖在病原與寄主的互作過程中的作用也可能不同[34]；另一種則認為可溶性糖的含量與寄主抗病性有關(guān)，例如黃瓜對霜霉病的抗性被激活后導致可溶糖含量增加[35]，李淼等[36]也認為獼猴桃抗?jié)儾〉钠贩N體內(nèi)可溶糖含量要高于感病品種。本試驗測定的可溶性糖與蘿卜根腫病有一定的相關(guān)性，抗病品種蘿卜接菌后的可溶糖總體上高于感病蘿卜，說明可溶糖含可能參與蘿卜對根腫菌的抗性反應。

病原菌侵染植物后會造成植物一系列變化，植物產(chǎn)生抗病包括抗病信號識別傳遞，酶促反應。采用qPCR 對不同抗感蘿卜根內(nèi)的含菌量測定并結(jié)合表型分型，為十字花科根腫病的早期防治提供理論依據(jù)。根腫菌接種抗感蘿卜后，防御酶系統(tǒng)被破壞，自由基的代謝失衡。對抗感蘿卜生理生化差異分析結(jié)果表示，SOD、POD和CAT以及可溶性糖參與了植物抗病過程，這為蘿卜和根腫菌的互作機理研究提供了研究基礎(chǔ)。此外，油菜接種根腫菌后根部生理生化的變化與蘿卜中是否相似還待進一步研究。目前油菜中沒有發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)優(yōu)異抗性的材料，對篩選到的其它十字花科作物的免疫品種的研究，能夠從新的角度去探究根腫病的抗病機制，對理解油菜抗性喪失和油菜根腫病防治提供新思路。