焦春偉，鐘 靜，黃海勇，梁慧嘉，鄭嬌吉，陳家明，謝意珍,

（1.廣東粵微生物科技有限公司，廣東肇慶 512000；2.廣東粵微食用菌技術有限公司，廣東廣州 510525；3.廣東南粵藥業(yè)有限公司，廣東廣州 510530）

咳嗽是健康人體清除呼吸道異物和過量支氣管分泌物的生理防御機制，在宿主防御中具有一定有益作用[1]。然而，持續(xù)性的咳嗽會導致機體衰弱，提高慢阻肺、哮喘及呼吸衰竭等疾病的發(fā)病率，嚴重影響患者身心健康和生活質量[2]。

化橘紅，即化州橘紅，是化州柚（Citrus grandisTomentosa）或柚（Citrus grandis（L.）Osbeck）的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，含柚皮素、芹黃素及橙皮苷等活性成分[3]。蛹蟲草（Cordyceps militarisL.Link），又被稱為北冬蟲夏草，含蟲草酸、蟲草素等活性成分[4]。臨床調查研究顯示，多個止咳平喘中醫(yī)驗方中含化橘紅與蛹蟲草兩種成分，其中化橘紅在驗方中發(fā)揮“化痰降氣”功效；蛹蟲草在驗方中發(fā)揮“益腎”作用[5?7]。同時，藥理試驗研究表明化橘紅具有治療咳嗽、咳痰及流涕等活性[8]；蛹蟲草具有抗炎、緩解氣管敏感及降低咳嗽反射等活性[9]?？忍蹬c炎癥是咳嗽的兩大主要特征，化橘紅與蛹蟲草分別對兩種特征具有緩解作用，截止目前，暫未見兩種原料復配的功能和機制研究報道。

基于中藥成分多、作用靶點多和作用途徑復雜等特點，本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法研究復方止咳的的物質基礎和作用機制，為進一步開發(fā)化橘紅-蛹蟲草復方功能產(chǎn)品和保健食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

化橘紅水提物和蛹蟲草水提物 均由廣東粵微食用菌技術有限公司提供，兩種水提物按1:1 的比例進行混合，實驗時使用純化水稀釋至所需濃度；TNF-α、IL-1α和IL-1β的ELISA 檢測試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；SPF 級健康成年昆明小鼠70 只，雌雄各半，體質量14～18 g 購自南方醫(yī)科大學（許可證號：SCXK（粵）2016-0041），飼養(yǎng)于廣東省微生物研究所動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度18～29 ℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h 明暗交替，自由攝食和飲水。動物經(jīng)適應性飼養(yǎng)1 周后開始實驗。

402B 超聲霧化器 江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司；BS200S 分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；JJ1000 型電子天平 江蘇常熟市雙杰測試儀器廠；ML-1600 平板顯微鏡 武漢塞維爾生物技術有限公司；L535R 臺式離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；Infinite M200 Pro 多功能酶標儀 瑞士Tecan 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠氨水引咳試驗 參考謝偉娜等[10?11]研究對昆明小鼠進行引咳篩選試驗，噴霧為濃氨水，噴霧時間2.5 min，測定小鼠10 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)，剔除10 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)＜10 次的小鼠。將測試合格的48 只小鼠隨機分成四組，每組12 只（雌雄各半），分別是空白對照組、模型組、復方低劑量組、高劑量組。本試驗從生產(chǎn)運用角度出發(fā)，考慮產(chǎn)品加工工藝、市售片劑、粉劑規(guī)格、產(chǎn)品提取物含量等多個因素，并參考《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》，確定復方低劑量與高劑量分別為200 mg/kg/d 和400 mg/kg/d。各組小鼠每日按0.1 mL/10 g 體積進行灌胃給藥，空白組和模型組小鼠灌胃純水，復方低劑量組與復方高劑量組小鼠灌胃對應劑量的提取物溶液，每日灌胃1 次，連續(xù)給藥7 d。在末次給藥1 h 后，將小鼠放入引咳儀器中，按上法，噴霧2.5 min，測定小鼠10 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。

1.2.2 血清指標檢測 小鼠咳嗽試驗檢測結束后，對小鼠進行摘眼球取血。血樣室溫靜置分層后，在設置為4 ℃，3000 r/min 的離心機中離心10 min，小心吸出上層血清。采用ELISA 試劑盒檢測各組小鼠血清中TNF-α、IL-1α和IL-1β的含量。

1.2.3 活性成分及對應靶點收集 在TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中檢索搜集化橘紅的化學成分信息，篩選出OB≥20%和DL≥0.1 的化合物。在CNKI 與Web of Science 文獻數(shù)據(jù)庫中以化橘紅和蛹蟲草作為關鍵詞進行搜索，查找與咳嗽相關藥理作用的活性成分，匯總后得到復方的主要活性成分。隨后在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲得化橘紅候選化合物對應的潛在靶標。在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取蛹蟲草主要化學成分的SMILES 信息用于化合物的靶點預測。將候選化合物的SMILES 導入到Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）與 Pharm-Mapper（http://www.Lilab-ecust.cn/pharmmapper/）數(shù)據(jù)庫，物種選“Homosapiens”，收集并整理出“Probability”＞0 的潛在靶點。將獲得的靶點名稱導入到Uniprot數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/），其中物種被選為“homo sapiens”，可將靶標名稱進行格式轉換，獲得對應的Gene name。

1.2.4 咳嗽相關靶點收集 在Genecards（http://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中以“cough”為關鍵詞，檢索獲得咳嗽相關靶點。以相關性評分＞1.8 分作為篩選條件，獲得與咳嗽相關性較高的疾病靶點。

1.2.5 “復方-靶點-咳嗽”網(wǎng)絡構建 將咳嗽疾病靶點、化橘紅-蛹蟲草復方活性成分及其對應靶點導入Cytoscape 軟件，構建“復方-靶點-咳嗽”網(wǎng)絡，并對網(wǎng)絡進行拓撲分析。

1.2.6 PPI 網(wǎng)絡構建 繪制韋恩圖（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲得化橘紅-蛹蟲草復方治療咳嗽的相關靶點。應用String 平臺對篩選出的交集靶點構建蛋白作用網(wǎng)絡。設置靶點間相互作用分值大于0.9，即得蛋白相互作用網(wǎng)絡。然后將得到的蛋白網(wǎng)絡導入Cytoscape3.6.0 軟件中，根據(jù)得分值和節(jié)點度值設定對應節(jié)點和邊的顏色和粗細大小進行調節(jié)。

1.2.7 GO 與KEGG 富集分析 運用Metascape 對復方與咳嗽交集靶點進行GO 與KEGG 富集分析，按P值大小排序，篩選P值最小的前10 條GO 條目與信號通路，用于繪制氣泡圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，本文中的定量參數(shù)以均數(shù)±標準差（）的形式表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示組間差異顯著，P＜0.01 表示組間差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 化橘紅-蛹蟲草復方對咳嗽次數(shù)的影響

本試驗構建了氨水引咳模型，通過測定給藥前后10 min 內(nèi)模型動物的咳嗽次數(shù)對比分析復方對咳嗽的改善作用。試驗期間，空白組老鼠均未咳嗽，與模型組差異顯著（P＜0.05）。由表1 可知，給藥前10 min 內(nèi)，三組小鼠咳嗽次數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）；而給藥后，復方低、高劑量組小鼠的咳嗽次數(shù)較模型組均極顯著下降（P均＜0.001），說明化橘紅-蛹蟲草復方低、高劑量組對氨水引起小鼠的咳嗽均有一定改善作用。已有研究表明，蛹蟲草對慢性支氣管炎具有良好治療作用，能明顯減輕患者咳嗽、咳痰及喘息等不良癥狀[12?13]。此外，侯秀娟等[14]研究發(fā)現(xiàn)化橘紅提取物能明顯延長濃氨水刺激引起的咳嗽潛伏期，減少2 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)。以上結果與本研究結果相似，說明本復方能夠一定程度減少咳嗽次數(shù)。

表1 化橘紅-蛹蟲草復方對小鼠咳嗽次數(shù)的影響（n=10）Table 1 The effect of Citri grandis Exocarpium-Cordyceps militaris compound on the number of cough in mice (n=10)

2.2 對小鼠血清炎癥因子水平的影響

由圖1 的ELISA 測定結果可知，與空白組對比，模型組小鼠的TNF-α、IL-1α和IL-1β水平均顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，復方低劑量組小鼠血清TNF-α、IL-1α及IL-1β水平均降低；復方高劑量組小鼠血清TNF-α與IL-1β水平顯著降低（P＜0.05），IL-1α水平極顯著降低（P＜0.01）。炎癥是咳嗽的重要病理特征之一，其產(chǎn)生會導致氣道狹窄，呼吸功能低下，誘發(fā)咳嗽[15]。因此，植物提取物的抗炎活性對咳嗽的緩解具有一定的促進作用[16?17]。王春燕等[18]，王紅霞等[19]研究顯示，咳嗽小鼠血清炎癥因子水平顯著高于健康小鼠，補充百合、生地黃、沙參等復方提取物或柚皮素等天然成分后，炎癥因子水平明顯降低，同時咳嗽得到緩解。上述結果表明，化橘紅-蛹蟲草復方對咳嗽模型小鼠血清炎癥因子水平升高現(xiàn)象具有一定抑制作用。

圖1 化橘紅-蛹蟲草復方對小鼠血清炎癥因子水平的影響（n=10）Fig.1 The effect of Citri grandis Exocarpium-Cordyceps militaris compound on the levels of serum inflammatory factors in mice (n=10)

2.3 化橘紅-蛹蟲草復方活性成分與靶點篩選

在明確化橘紅-蛹蟲草復方具有一定止咳活性的基礎上，運用網(wǎng)絡藥理學進一步研究該復方發(fā)揮止咳活性的作用機制。首先，運用多個在線數(shù)據(jù)庫和現(xiàn)有文獻收集復方的活性成分及其對應靶點。在TCMSP數(shù)據(jù)庫與文獻檢索共收集到化橘紅活性成分44 種，以OB≥20%和DL≥0.10 為篩選條件初篩后，獲得化橘紅活性成分17 種，除去3 種沒有靶點的化合物，得到14 種化橘紅活性成分。此外，柚皮苷做為化橘紅的主要組成成分，雖然其OB 值和DL 值不滿足篩選條件，但已有文獻報道證明柚皮苷具有止咳作用，故直接將其納入分析，最終共獲得15 種化橘紅活性成分，對應靶點139 個。通過文獻檢索確定蛹蟲草的有效成分為蟲草素和蟲草酸，從Swiss Target Prediction 和PharmMapper 數(shù)據(jù)庫中篩選得到83 個蟲草素靶標和88 個蟲草酸靶標。具體結果如表2所述。

表2 化橘紅-蛹蟲草復方活性成分與靶點信息Table 2 Active compositions and potential targets of Citri grandis Exocarpium-Cordyceps militaris compound

2.4 化橘紅-蛹蟲草治療咳嗽潛在靶點分析

通過Genecards 數(shù)據(jù)庫共獲得699 個咳嗽相關靶點。Venn 圖顯示（如圖2），將咳嗽對應靶點與化橘紅-蛹蟲草活性成分對應的265 個靶點取交集后，共獲得78 個交集靶點，提示復方對咳嗽的治療作用與其對78 個交集靶點的調控有關。

圖2 化橘紅-蛹蟲草復方靶點與咳嗽相關靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of Citri grandis Exocarpium-Cordyceps militaris compound targets and cough related targets

2.5 “復方-靶點-咳嗽”網(wǎng)絡分析

運用Cytoscape 軟件構建“復方-靶點-咳嗽”網(wǎng)絡，建立活性成分、潛在靶點及疾病三者之間的聯(lián)系。結果如圖3 所示，其中黃色節(jié)點代表活性成分，綠色節(jié)點代表疾病靶點，共包括95 個節(jié)點（17 個活性成分節(jié)點，78 個疾病節(jié)點）和164 條邊。從活性成分角度分析（如表3 所述），通過Degree、Betweenness Centrality 及Closeness Centrality 值排序，發(fā)現(xiàn)排名前5 的活性成分為蟲草酸（D-Mannitol）、蟲草素（Cordycepin）、芹菜素（Apigenin）、β-谷甾醇（Betasitosterol）、柚皮素（Naringenin）。從靶點角度分析，排名前4 的靶點為PTGS2、PTGS1、SCN5A 及ADRB2，分別與15、13、11、8 種化合物發(fā)生相互作用?！皬头?靶點-咳嗽”網(wǎng)絡中有17 種有效成分作用于78 個靶點，說明復方治療咳嗽具有多成分、多靶點的作用特點。柚皮素的止咳活性已被多篇研究報道，該成分能顯著延長枸櫞酸引咳豚鼠的咳嗽潛伏期，并能顯著減少豚鼠咳嗽次數(shù)[20?21]，其作用機制可能與該成分通過抑制NF-κB 活性與抑制CD4 T 細胞產(chǎn)生Th2 細胞因子兩種途徑，來減輕氣道炎癥因子與粘液產(chǎn)生有關[22?23]。蟲草素、芹菜素及β-谷甾醇三種物質未被證明其對咳嗽次數(shù)具有直接抑制作用，但這三種成分能有效調節(jié)炎癥因子與細胞因子水平，緩解氣道炎癥[24?26]。這對后期開展天然成分止咳活性研究提供了理論參考。

表3 “復方-靶點-咳嗽”網(wǎng)絡拓撲分析Table 3 Network topology analysis of “Compound-targets-cough”

圖3 “復方-靶點-咳嗽”網(wǎng)絡圖Fig.3 Network of “Compound-targets-cough”

2.6 PPI 網(wǎng)絡分析

蛋白質交互作用網(wǎng)絡（Protein-protein interaction network，PPI）是以蛋白質為節(jié)點，不同蛋白間的交互作用為邊所構成的網(wǎng)絡，對分析蛋白質功能和關系具有重要意義[27]。本研究中，將得到的78 個交集靶點上傳至String 數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo sapiens”構建PPI 網(wǎng)絡（設置最低交互作用得分為0.90，隱藏網(wǎng)絡中獨立的節(jié)點）。將得到的蛋白交互作用網(wǎng)絡圖導入Cytoscape 軟件進行可視化處理后得到圖4。圖中節(jié)點大小與顏色深淺代表節(jié)點度值，即節(jié)點越大，顏色越深，則節(jié)點對應的degree 值越大。分析結果顯示，該網(wǎng)絡的平均節(jié)點度值為7.75，聚類系數(shù)為0.52。交互網(wǎng)絡中degree 值排名前5 的靶點分別是JUN、IL6、MAPK3、TNF 和MAPK1，提示這幾個靶點是交集靶點相互作用網(wǎng)絡中的核心靶點。JUN 是炎癥基因的主要激活劑，能夠直接影響IL-1β、IL-6 及TNF-α等細胞因子的表達[28]，大量的細胞因子，會激活MAPKs，引起氣道與肺部炎癥。TNF 是在炎癥大鼠模型體內(nèi)早期表達的炎癥細胞因子，而IL6 可能對炎癥的進一步發(fā)展有促進作用[29]。

圖4 PPI 網(wǎng)絡圖Fig.4 PPI network diagram

2.7 GO 與KEGG 富集分析

運用Metascape 對交集靶點進行KEGG 與GO富集分析，核心過程如圖5 所述。GO 富集分析結果顯示，化橘紅-蛹蟲草復方治療咳嗽共涉及575個GO 條目，包括生物學過程（biological processes，BP）424 條，分子功能（molecular function，MF）89 條及細胞組成（cellular component，CC）62 條，核心條目包括對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、細胞質囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）及細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）等。KEGG 富集分析結果顯示，該復方治療咳嗽共涉及272 條信號通路，核心信號通路包括IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）及TNF 信號傳導途徑（TNF signaling pathway）及AGE-RAGE 糖尿病并發(fā)癥途徑（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等。臨床調查研究顯示，慢性氣道炎癥患者中存在IL-17 信號通路基因表達異?，F(xiàn)象，該通路能夠通過促進氣道平滑肌收縮驅動氣道高反應性，促進中性粒細胞引發(fā)肺部炎癥，對多種炎癥性疾病都存在廣泛的影響[30]。TNF 信號通路由多種誘導細胞內(nèi)信號通路的細胞因子組成，能夠直接影響機體炎癥、免疫、細胞凋亡及存活等[31]。AGE-RAGE 糖尿病并發(fā)癥途徑由機體中晚期糖基化終末產(chǎn)物與其受體RAGE 相互作用而激活，引起多種細胞內(nèi)信號通路激活，如包括NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPKs，然后導致NF-κB 活性[32]。NF-κB 能夠促進多種促炎細胞因子，如IL-1β、IL-6 及TNF-α的表達，從而誘發(fā)機體炎癥[33]。KEGG 富集分析結果顯示，化橘紅-蛹蟲草復方治療咳嗽作用機制中涉及對多條炎癥相關信號通路的調控，說明該復方的止咳活性可能與其通過多種途徑改善機體炎癥相關。

圖5 KEGG 與GO 富集分析核心生物過程Fig.5 KEGG and GO enrichment analysis of core biological processes

3 結論

本研究結果表明，化橘紅-蛹蟲草復方能顯著減少引咳模型小鼠咳嗽次數(shù)，調節(jié)機體炎癥因子水平異常，展現(xiàn)出良好的止咳活性。在此基礎上，通過網(wǎng)絡藥理學對其止咳作用機制進行分析發(fā)現(xiàn)，化橘紅-蛹蟲草復方的止咳活性源于多種活性成分對多靶點、多通路綜合作用的結果，其中蟲草酸、蟲草素、芹菜素、β-谷甾醇及柚皮素是其重要的物質基礎。該結論為化橘紅-蛹蟲草復方止咳作用機制研究提供了一定的理論依據(jù)，后續(xù)可繼續(xù)開展相關試驗對活性成分、核心靶點及通路進行驗證，以揭示該復方止咳的分子機制，推動相關保健食品的研發(fā)。