劉曉藝，周玉巖，過利敏，郝光飛,

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056107；2.河北省食品藥品醫(yī)療器械檢驗研究中心，河北石家莊 050299；3.新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆烏魯木齊 830091）

紅花（Carthamus tinctoriusL.）為菊科紅花屬，為新疆地區(qū)代表作物之一。紅花籽為紅花的種子，氣香性溫，功能與花相同，都具有防治心腦血管疾病、降低血壓等藥用價值，富含油脂、蛋白質、維生素與礦物質等營養(yǎng)成分[1?3]。紅花籽油中亞油酸含量高達75%～85%，在低溫或受熱條件下油質穩(wěn)定[4?5]。紅花籽榨油后籽粕中富含蛋白質，同樣具有很高的營養(yǎng)價值，其氨基酸種類齊全且比例適宜，疏水性及耐熱性氨基酸含量高達40%，可作為補充氨基酸和制備生物活性肽的優(yōu)質蛋白原料[6]。目前，食源性優(yōu)質蛋白已成為研究熱點，越來越多新型功能肽被開發(fā)利用，如沙棘籽蛋白、西瓜籽蛋白及菠蘿蜜籽蛋白等[7?9]。與其他植物蛋白相比，紅花籽蛋白不僅資源更加豐富，還具有一定的加工特性，乳化性及發(fā)泡性與大豆蛋白相似，但在酸性及中性環(huán)境中優(yōu)于大豆蛋白[6,10]。在蛋白酶解多肽生物活性方面，紅花籽蛋白經(jīng)單酶水解后得到具有抗氧化活性的多肽，證實了其制備抗氧化肽的可行性[11]。

多肽作為蛋白質的降解衍生物，更容易被人體吸收利用，在較小濃度下具有較強的生物活性，其性質與蛋白質類似，容易受到環(huán)境因素影響，如在食品加工過程中（如高溫）或機體胃腸消化階段，多肽可能會因氧化、脫酰胺或環(huán)化等作用而發(fā)生降解，導致活性下降甚至消失，此外，常見的食品原輔料及金屬離子也可能會與多肽發(fā)生作用影響活性。因此，研究紅花籽抗氧化肽穩(wěn)定發(fā)揮活性作用的環(huán)境條件可保證其在加工過程中的穩(wěn)定性，為產(chǎn)品的開發(fā)及工業(yè)化應用提供參考[12]。目前，大部分對紅花籽多肽的研究主要在制備工藝、分離純化及功能構效等方面，對其生物活性的穩(wěn)定性方面研究較少[13]，近年來，已發(fā)現(xiàn)杏鮑菇多肽、菜籽肽在高溫、強酸強堿環(huán)境下會失活[14?15]，但關于紅花籽抗氧化肽在加工、貯藏應用及胃腸消化等環(huán)境中活性穩(wěn)定性研究尚淺，因此，有必要對紅花籽抗氧化肽穩(wěn)定性研究，保證多肽產(chǎn)品能穩(wěn)定發(fā)揮抗氧化效果。

由于紅花籽與籽粕蛋白氨基酸含量及成分等相差甚微[6]，考慮紅花籽的綜合利用，減少營養(yǎng)物質浪費，本試驗以脫殼紅花籽粕為原料，提取蛋白質后通過復合酶解法制備紅花籽抗氧化肽并超濾分離，研究不同分子量多肽在食品加工、貯藏過程及模擬胃腸消化等環(huán)境因素中抗氧化活性的穩(wěn)定性，旨在篩選得到抗氧化活性及穩(wěn)定性較高的多肽組分，得出抗氧化活性穩(wěn)定的加工應用條件，為紅花籽抗氧化肽的產(chǎn)品開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫殼紅花籽粕 新疆伊犁州察布查爾縣雅其娜農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；堿性蛋白酶（75000 U/g）、中性蛋白酶（64000 U/g）、胰蛋白酶（25000 U/g）、胃蛋白酶（3000 U/g） 北京博奧拓達科技有限公司；DPPH、鄰苯三酚、水楊酸 上海阿拉丁公司；NaCl、檸檬酸、蔗糖、葡萄糖、山梨酸鉀、苯甲酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1000A 高速萬能粉碎機 永康市太陽機電有限公司；PHJ-3F pH 計 天津賽得利斯實驗有限公司；JA1003 電子天平 上海精科天平；581R 高速冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；UV1901 紫外可見分光光度計 杭州艾普儀器設備有限公司；DK-98-1 電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特；SCIENTZ-10ND 冷凍干燥機 寧波新芝生物公司；ZJMP10-002 超濾系統(tǒng)美國Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅花籽蛋白的提取 脫殼紅花籽粕粉碎機粉碎過80 目篩，1:5（W/V）正己烷脫脂，攪拌浸提6 h，反復三次，1:10（W/V）比例溶于去離子水，NaOH（1 mol/L）調(diào)pH 至10，攪拌1 h，4000 r/min 冷凍離心10 min，取殘渣進行二次浸提，HCl（1 mol/L）調(diào)上清液pH 至5.5，靜置30 min，4000 r/min 冷凍離心10 min，取沉淀，調(diào)pH 至中性，?80 ℃冷凍干燥后?20 ℃封裝儲藏備用[10]。

1.2.2 紅花籽蛋白復合酶水解 配制底物濃度為5%紅花籽蛋白溶液，采用堿性蛋白酶與中性蛋白酶2:1 復合酶解，酶解溫度50 ℃，酶解2 h，酶添加量7000 U/g，酶解過程用NaOH 維持pH 為8 不變。以反應過程中NaOH 的消耗量計算水解度（DH），控制水解程度[16]，反應完全后，100 ℃滅酶10 min，調(diào)溶液pH 至中性，3500 r/min 離心10 min，得到紅花籽蛋白酶解液，測定抗氧化活性，上清液冷凍干燥備用[17]。

1.2.3 紅花籽蛋白酶解產(chǎn)物超濾分離 將紅花籽蛋白酶解產(chǎn)物復溶于去離子水中，調(diào)pH 為7，0.45 μL微孔濾膜過濾，選擇3、5、10 kDa 超濾膜，調(diào)節(jié)超濾模板進口壓力為0.2 Mpa，出口壓力不高于0.03 Mpa，常溫超濾，收集所得組分SSPH-Ⅰ（＜3 kDa）、SSPH-Ⅱ（3～5 kDa）、SSPH-Ⅲ（5～10 kDa）和SSPH-Ⅳ（＞10 kDa）多肽溶液，分別測定各組分體外抗氧化活性后冷凍干燥，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 紅花籽蛋白多肽抗氧化穩(wěn)定性研究

1.2.4.1 溫度對紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 配制濃度為2 mg/mL 不同分子量多肽液，分別在水浴條件60、70、80、90、100、121 ℃保溫處理2 h，取樣后冰水浴迅速冷卻至室溫進行測定，以各組室溫條件抗氧化活性為處理前參照，計算清除能力維持率[14]。

1.2.4.2 pH 對紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 將多肽樣品分別溶于pH 為3、4、5、6、7、8、9、10、11 的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L）中，配成質量濃度為200 μg/mL 溶液，用HCl 和NaOH（1 mol/L）分別調(diào)節(jié)pH，在室溫下靜置2 h，以去離子水配制肽溶液為參照，計算清除能力維持率[14]。

1.2.4.3 食品原輔料對紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性影響 配制濃度為2 mg/mL 不同分子量多肽液，分別添加NaCl、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸、防腐劑山梨酸鉀及苯甲酸鈉。其中，NaCl、蔗糖和葡萄糖溶液的濃度為2、4、6、8、10 g/100 mL，檸檬酸和防腐劑的濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 g/100 mL，添加蔗糖和葡萄糖組分在100 ℃下放置20 min，其他在室溫下靜置反應2 h，以未添加以上食品原輔料肽樣品為參照，計算清除能力維持率[15,18]。

1.2.4.4 金屬離子對紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 配制濃度為2 mg/mL 不同分子量的多肽液，分別加入含有K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+的金屬鹽，使溶液中的金屬離子質量濃度為250 μg/mL，在室溫下靜置2 h，以未添加以上金屬鹽的肽樣品為參照，計算清除能力維持率[15]。

1.2.4.5 體外模擬消化對紅花籽蛋白及不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 制備模擬胃液及腸液后，分別取紅花籽蛋白（SSP）及分離后的多肽2 mg/mL，調(diào)pH 至2，控制溫度37 ℃，加入5 mL 人工胃液混勻，37 ℃水浴振蕩2 h，100 ℃水浴加熱10 min終止反應，冷卻后5000 r/min 離心15 min。胃模擬處理2 h 后NaOH 調(diào)pH 為8，加入5 mL 人工腸液，37 ℃水浴反應3 h，每1 h 取樣，沸水浴加熱10 min終止反應，冷卻后5000 r/min 離心15 min，以紅花籽蛋白為對照，分別計算胃消化、腸消化上清液自由基清除率[19]。

1.2.5 體外抗氧化活性和維持率的測定

1.2.5.1 體外抗氧化活性的測定 DPPH 自由基清除率參考MULLA 等[20]的方法并稍加改動，水楊酸法測定·OH 清除率參考胡磊[21]的方法稍加改動，鄰苯三酚法測定O2?·清除率參考LU 等[22]的方法并稍加改動。

1.2.5.2 抗氧化活性維持率的測定 為了更直觀表達紅花籽多肽抗氧化穩(wěn)定性，各組分別測定處理前、后的DPPH 自由基、O2?·及·OH 清除率，方法參考1.2.5.1，比值定義為能力維持率，各自由基清除率分別以處理前樣品活性為參照，計算公式如下：

式中：A0、A1分別表示處理前、后多肽DPPH自由基清除率；A2、A3表示處理前、后多肽O2?·清除率；A4、A5表示處理前、后多肽·OH 清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組做三次平行試驗，采用Excel 對試驗數(shù)據(jù)進行整理，SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，結果用“平均值±標準差”表示，使用Origin 8.5 繪圖。

2 結果與分析

2.1 紅花籽蛋白酶解產(chǎn)物及不同分子量多肽抗氧化活性測定

測定酶解產(chǎn)物及各超濾組分DPPH 自由基、O2?·及·OH 自由基清除率以評價不同組分的抗氧化活性。分離后的紅花籽蛋白多肽SSPH-Ⅰ、SSPH-Ⅱ組抗氧化活性顯著高于酶解產(chǎn)物（P＜0.05），SSPH-Ⅲ、SSPH-Ⅳ組抗氧化活性對比分離前顯著降低（P＜0.05）（見圖1），多肽的抗氧化活性與分子量大小、氨基酸組成種類及排列順序有關[23]，超濾分離后，分子量較小的紅花籽多肽抗氧化活性顯著高于酶解產(chǎn)物和分子量較大多肽（P＜0.05），這可能是因為超濾分子量小的多肽具有較小的空間位阻，可以作為更好的電子供體，與自由基發(fā)生反應，將其轉化為更穩(wěn)定的最終產(chǎn)物，這與桃仁、玉米及紫蘇籽等大部分植物蛋白肽研究結果相同，同樣發(fā)現(xiàn)分子量較小的多肽自由基清除率較高[24?26]。因此，只對初步分離后SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ的抗氧化活性穩(wěn)定性進行研究。

圖1 紅花籽蛋白酶解產(chǎn)物及不同分子量多肽抗氧化活性測定Fig.1 Determination of antioxidant activity of different molecular weight polypeptides and proteolytic products of safflower seed

2.2 紅花籽蛋白抗氧化肽活性穩(wěn)定性研究

2.2.1 溫度對紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 溫度升高對SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ多肽組分DPPH 自由基、O2?·及·OH 清除率的影響并不明顯（圖2），SSPH-Ⅱ組O2?·和·OH 清除能力維持率雖在100 ℃時出現(xiàn)波動，但121 ℃時各自由基清除能力維持率最低仍維持93%左右。SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ抗氧化活性對溫度的敏感度都較低，這與玉米肽在高溫環(huán)境下仍能保持抗氧化活性相似[25]。這可能是因為肽段的分子量較小，在不超過某個特定溫度的條件下，肽的結構變性較少，也可能是因為，肽的結構較簡單，沒有受高溫分解發(fā)生不可逆變性，且紅花籽蛋白耐熱性氨基酸含量高，紅花籽多肽可能含有如Pro 等能表現(xiàn)出抗熱、抗鹽的氨基酸基團[9,27]。因此，在熱穩(wěn)定性測定中，SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ的抗氧化活性受高溫影響較小。

圖2 溫度對SSPH-Ⅰ（a）和SSPH-Ⅱ（b）抗氧化活性的影響Fig.2 Effects of temperatures on antioxidant activities of SSPH-Ⅰ (a) and SSPH-Ⅱ (b)

2.2.2 pH 對紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 不同pH 環(huán)境下，SSPH-Ⅰ、SSPH-Ⅱ各自由基清除能力維持率具有顯著性差異（P＜0.05），在強酸強堿環(huán)境下，兩者DPPH 自由基、O2?·及·OH 清除能力維持率都顯著降低（P＜0.05），只維持在40%左右，而pH 在6～8 時，SSPH-Ⅰ及SSPH-Ⅱ的各自由基清除能力維持率最高達到98%左右（見圖3）。這是因為在強酸強堿環(huán)境下，紅花籽抗氧化肽SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ發(fā)生外消旋或脫酰胺反應，其含有的L-型氨基酸部分轉化為D-型氨基酸，形成D-和L-型多肽混合物，引起了化合物極性、空間位置等結構性質的改變，當在強堿性條件下還可能會消耗紅花籽多肽提供清除自由基效果的氫供體上的氫，影響多肽帶電荷性質，導致活性下降[28]，這與元寶楓籽抗氧化肽在過酸過堿環(huán)境中活性顯著下降得到的結果一致[29]，因此，弱酸弱堿環(huán)境對紅花籽抗氧化肽活性影響較小。

圖3 pH 對SSPH-Ⅰ（a）和SSPH-Ⅱ（b）抗氧化活性的影響Fig.3 Effects of pH on antioxidant activity of SSPH-Ⅰ(a) and SSPH-Ⅱ (b)

2.2.3 食品原輔料對紅花籽蛋白不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

2.2.3.1 NaCl 對紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 添加不同濃度NaCl 對紅花籽抗氧化肽SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ兩組分的DPPH 自由基、O2?·及·OH 的清除率維持率影響不明顯（見圖4），SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ的自由基清除能力維持率隨著NaCl濃度的增加，呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，當NaCl 濃度為10 g/100 mL 時，SSPH-Ⅰ各自由基清除能力維持率分別增加至108%、107%、105%；SSPH-Ⅱ各自由基清除能力維持率分別增加至105%、106%、104%左右，這可能是因為加入NaCl 后，離子化的Na+和Cl?會打破肽的電荷平衡，使溶液體系中的離子強度發(fā)生變化，增強自由基清除能力，這與紫花蕓豆和魚膠原蛋白肽研究得到的結果相似[30?31]。由此可見，一定濃度的NaCl 可以對多肽抗氧化活性產(chǎn)生增效協(xié)同作用。

圖4 NaCl 對SSPH-Ⅰ（a）和SSPH-Ⅱ（b）抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of NaCl on antioxidant activity of SSPH-Ⅰ（a）and SSPH-Ⅱ（b）

2.2.3.2 蔗糖和葡萄糖對紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 添加蔗糖和葡萄糖對紅花籽抗氧化肽（SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ）活性的影響如圖5 所示，蔗糖含量在2～10 g/100 mL 范圍內(nèi)時，SSPH-Ⅰ三種自由基清除能力維持率均保持在95%以上，SSPH-Ⅱ三種自由基清除能力維持率保持在93%以上，兩種分子量多肽的抗氧化活性均未見明顯變化。葡萄糖含量在2～10 g/100 mL 范圍時，SSPH-Ⅰ三種自由基清除能力維持率相比添加蔗糖明顯上升，最高濃度下增加至106%，SSPH-Ⅱ的三種自由基清除能力維持率也有所上升，最高濃度下增加至104%（見圖5）。葡萄糖對紅花籽抗氧化肽活性的影響大于蔗糖，可能是因為100 ℃加熱條件下，葡萄糖加入后發(fā)生美拉德反應，生成醛、酮等還原性物質在一定程度上提高了抗氧化能力，而蔗糖不屬于還原糖，不與多肽發(fā)生反應，證實了高溫下還原糖與多肽結合產(chǎn)生某些物質能增強抗氧化活性這一結論，且與芝麻多肽美拉德反應后抗氧化活性提高得到的結果相似[32]。因此，在試驗濃度范圍內(nèi)，葡萄糖的添加能增強SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ的抗氧化活性，添加蔗糖對其活性影響不大。

圖5 蔗糖和葡萄糖對SSPH-Ⅰ（a、c）和SSPH-Ⅱ（b、d）抗氧化活性的影響Fig.5 Effects of sucrose and glucose on antioxidant activities of SSPH-I（a,c）and SSPH-II（b,d）

2.2.3.3 檸檬酸對紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 在紅花籽抗氧化肽（SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ）中添加一定濃度的檸檬酸，能夠提升SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ自由基清除能力。一定濃度范圍內(nèi)，檸檬酸的濃度越高，SSPH-Ⅰ的各自由基清除活性越高，當濃度為0.2 g/100 mL 時，各自由基維持率提高了3%～5%（圖6a），這可能是因為檸檬酸中的羧基或羥基可能會與肽鏈上的某些氨基酸殘基結合成為供氫體，從而增加自由基清除率。檸檬酸濃度對SSPH-Ⅱ各自由基清除率影響較小，這可能是由于檸檬酸分子的羥基結構對抗氧化劑起到穩(wěn)定的作用，故當濃度最大時，各維持率接近100%（圖6b），與菜籽肽添加檸檬酸后活性穩(wěn)定結果一致[15]。檸檬酸溶液雖然呈酸性，但試驗中的濃度范圍對于體系pH 影響較小，可忽略不計。因此，檸檬酸有助于提升SSPH-Ⅰ自由基清除能力，對SSPH-Ⅱ活性無明顯影響。

圖6 檸檬酸對SSPH-Ⅰ（a）和SSPH-Ⅱ（b）抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of citric acid on antioxidant activity of SSPH-Ⅰ（a）and SSPH-Ⅱ（b）

2.2.3.4 防腐劑對紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 防腐劑是食品加工過程中常用的食品添加劑。兩種常見防腐劑山梨酸鉀和苯甲酸鈉添加后對SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ的活性穩(wěn)定性影響較?。ㄒ妶D7）。添加一定濃度山梨酸鉀后，如圖7a、b 所示，SSPH-Ⅰ活性維持率出現(xiàn)先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢，SSPH-Ⅱ活性維持率呈緩慢下降趨勢；添加一定苯甲酸鈉后（圖7c、d），SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ活性維持率都呈現(xiàn)下降趨勢，在兩種防腐劑添加濃度達到最大時，SSPH-Ⅰ各自由基維持率最低達到85%以上，SSPH-Ⅱ各自由基維持率最低在83%以上。因此，在規(guī)定使用濃度范圍內(nèi)，兩者不會對SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ自由基清除能力造成嚴重干擾，紅花籽抗氧化肽依然能保持較好的抗氧化功效，這與小米醇溶蛋白肽防腐劑對其穩(wěn)定性影響的研究結果相似[33]。

圖7 山梨酸鉀和苯甲酸鈉對SSPH-Ⅰ（a、c）和SSPH-Ⅱ（b、d）抗氧化活性的影響Fig.7 Effects of potassium sorbate and sodium benzoate on antioxidant activities of SSPH-Ⅰ（a,c）and SSPH-Ⅱ（b,d）

2.2.4 金屬離子對紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 食品在加工、儲藏和運輸中不可避免地要接觸各種金屬容器，不同金屬離子對紅花籽抗氧化肽（SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ）活性影響差異顯著（P＜0.05），添加金屬離子后SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ自由基清除能力維持率顯著下降（P＜0.05），不同金屬離子對SSPH-Ⅰ影響排序為Cu2+＞Zn2+＞K+＞Mg2+＞Ca2+，添加Cu2+后，各活性維持率僅在55%、54%、55%左右。金屬離子對SSPH-Ⅱ影響排序為Zn2+＞Cu2+＞K+＞Mg2+＞Ca2+，添加Zn2+后，各活性維持率僅在52%、53%、52%左右（見表1）。這可能是因為其破壞了多肽之間的特殊化學力作用，導致溶解度降低、疏水基團外露等性質改變[34]。因此，在加工應用過程中應避免與Cu2+、Zn2+等金屬離子接觸，保持抗氧化活性穩(wěn)定。

表1 不同金屬離子對紅花籽不同分子量多肽活性穩(wěn)定性影響Table 1 Effects of different metal ions on the activity and stability of polypeptides with different molecular weights in safflower seed

2.2.5 體外模擬胃腸消化對紅花籽蛋白及不同分子量多肽抗氧化活性影響 紅花籽蛋白及不同分子量多肽經(jīng)體外模擬胃腸消化后三種自由基清除率差異較大（圖8）?？傮w來看，消化各個階段的SSP 抗氧化活性顯著低于酶解分離后的多肽（P＜0.05），且胃消化對自由基清除活性影響顯著小于腸消化（P＜0.05）；SSPH-Ⅰ在胃消化2 h 前、后各自由基清除能力無顯著差異（P＞0.05）；腸消化3 h 后各自由清除能力顯著下降（P＜0.05），但維持率仍在80%以上。SSPH-Ⅱ在胃消化后各自由基清除率對比消化前顯著下降，腸消化后下降更為顯著（P＜0.05），三種自由基維持率最高僅為77%，這與菠蘿蜜籽抗氧化肽胃腸消化得到的結果相似，在胃腸消化一段時間后活性下降[9]。這可能是因為SSPH-Ⅰ分子量較小，結構簡單，酶解位點酶切完全，在消化過程中結構沒有被破壞，活性較穩(wěn)定，對胃腸消化酶具有一定耐受度；而SSPH-Ⅱ抗氧化活性顯著下降，是由于SSPH-Ⅱ肽鏈長度與結構較為復雜，更多的疏水基團被酶解反應破壞，氨基酸排列順序及結構發(fā)生改變，抗氧化活性降低，也可能是因為其在模擬腸道消化過程中對環(huán)境變化較敏感，結構發(fā)生變化，導致抗氧化活性降低[9,35?36]。綜合來看，SSPH-Ⅰ（＜3 kDa）對體模擬胃腸消化有更強的耐受性。

圖8 紅花籽蛋白及不同分子量多肽體外模擬消化抗氧化活性變化Fig.8 Antioxidant activity of safflower seed protein and different molecular weight polypeptides during simulated digestion in vitro

3 結論

本試驗研究了加工、貯藏及模擬胃腸消化等環(huán)境因素對不同分子量紅花籽抗氧化肽穩(wěn)定性的影響。紅花籽蛋白復合酶水解后對酶解產(chǎn)物超濾分離，分離后SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ抗氧化活性顯著上升（P＜0.05），以DPPH 自由基、O2?·及·OH 清除能力維持率為指標，考察不同分子量抗氧化肽活性穩(wěn)定性，篩選得到了抗氧化穩(wěn)定性高的多肽組分（＜3 kDa），在高溫、弱酸弱堿環(huán)境下能保持抗氧化活性穩(wěn)定，添加一定濃度NaCl、檸檬酸和葡萄糖對SSPH-Ⅰ抗氧化活性具有增效協(xié)同作用，蔗糖、防腐劑對其抗氧化活性影響不明顯，常見金屬離子對紅花籽抗氧化肽的穩(wěn)定性影響不一，在應用過程中避免與Cu2+、Zn2+等金屬離子接觸，經(jīng)模擬胃腸消化，SSPH-Ⅰ在模擬胃消化時活性較穩(wěn)定，在模擬腸消化時活性下降顯著（P＜0.05），但維持率仍在80%以上。本文初步得到＜3 kDa 分子量紅花籽抗氧化肽活性較強且在常見加工過程及模擬胃腸消化環(huán)境影響下活性較穩(wěn)定，后續(xù)可對其進一步純化，研究體內(nèi)活性發(fā)揮效果，為新型抗氧化肽功能性產(chǎn)品的開發(fā)與工業(yè)化應用提供理論依據(jù)，促進紅花產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟與發(fā)展。