王 麗，李 雪，劉光憲, ，程文龍，張 耀，王國慶，茅賽賽

（1.江西省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江西南昌 330200；2.國家紅壤改良工程技術研究中心，江西南昌 330200；3.吉安井岡農業(yè)生物科技有限公司，江西吉安 343099；4.拓誠農業(yè)科技有限公司，江西興國 360732）

蘆筍具有較高的營養(yǎng)和藥用價值，被譽為“蔬菜之王”[1]。在我國，蘆筍主要以鮮銷為主，精深加工比例較小。近年來，隨著加工技術水平的提升，蘆筍加工從傳統(tǒng)食品向營養(yǎng)保健食品轉型升級。加工產品由傳統(tǒng)的酸味蘆筍罐頭[2]、蘆筍混合發(fā)酵酒[3]、蘆筍茶[4]、蘆筍面條等向蘆筍黑米酒[5]、蘆筍酸乳[6]、蘆筍發(fā)酵香腸[7]等多種新型產品轉變。在蘆筍產業(yè)發(fā)展中，除了應重視豐富加工產品種類外，還需為副產物的綜合利用尋找新的出路。在蘆筍采收、加工過程中，產生的小筍、切斷筍、蘆筍老莖等副產物產量較大。這些副產物含有豐富的游離氨基酸[8]、皂苷類化合物[9?10]、多糖[11?12]等，并具抗癌、提高免疫力、降血糖血脂、抗衰老和抗疲勞等功效[13?14]。

當前，部分學者開展了以可食用部分蘆筍為主的皂苷類化合物、多糖等功能性成分的提取與優(yōu)化[10,12,15]研究工作，而蘆筍副產物的加工及高值化利用研究較少，副產物基本上被丟棄，綜合利用率不高，從而導致資源浪費及嚴重的環(huán)境污染[16]。因此，深入研究與開發(fā)蘆筍副產物資源顯得尤為重要。

果酒中的揮發(fā)性風味物質對其品質有著重要影響，目前針對果酒的研究主要集中在單一的水果或者兩種水果混合發(fā)酵工藝研究及其揮發(fā)性成分分析，而對蘆筍果酒發(fā)酵研究近乎空白。為了提高蘆筍副產物資源的綜合利用率，延長蘆筍產業(yè)鏈，本研究以蘆筍副產物和獼猴桃為原料，酵母發(fā)酵釀制蘆筍獼猴桃復合果酒，對其發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質進行分析鑒定及變化規(guī)律研究，并探索出不同發(fā)酵階段特征香氣物質的差異性，旨在為蘆筍獼猴桃復合果酒的開發(fā)提供理論參考，為蘆筍副產物的精深加工提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆筍副產物 南昌祿祺實業(yè)有限公司；江山徐香獼猴桃 購于南昌華潤萬家澄湖店；高活性釀酒酵母 安琪酵母股份有限公司；果膠酶（40000 U/g）食品級，廈門墨奕懷食品有限公司；焦亞硫酸鉀 食品級，煙臺帝伯仕自釀機有限公司；水溶性殼聚糖食品級，浙江一諾生物科技有限公司；苯乙酸異戊酯色譜純，Sigma 公司。

7890A-5975C 氣相色譜質譜聯(lián)用儀 美國Agilent 公司；57330-U 固相微萃取裝置、50/30 μm 57348-U 固相微萃取針 美國Supelco 公司；08-2T 恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆筍獼猴桃復合果酒制作工藝

1.2.2 工藝操作要點 蘆筍、獼猴桃混合原汁制備：獼猴桃含有大量的抗氧化物質，在發(fā)酵過程起到一定的護色作用，且獼猴桃果汁和蘆筍汁兩者顏色較為相近，混合發(fā)酵后對蘆筍獼猴桃復合果酒的顏色影響較小。為此，本文以新鮮的小筍、切斷筍、老莖等蘆筍副產物和獼猴桃為原料，分別清洗干凈，瀝干水分，蘆筍副產物用螺旋高速壓榨機進行壓榨，獼猴桃去皮切分后用料理機破碎榨汁，按照蘆筍汁:獼猴桃汁=3:1 比例混合，加入100 mg/L 焦亞硫酸鉀和0.2‰果膠酶酶解2 h，并裝入滅菌的5 L 玻璃泡菜壇內。

調整成分：參考丁立孝等[17]方法，將蘆筍、獼猴桃混合原汁的糖度用白砂糖調整至22%，pH 用檸檬酸調至4.5。

主發(fā)酵：在發(fā)酵體系中添加0.04%活化后的酵母，水封，在25～28 ℃下發(fā)酵，隔天攪拌1 次。當無氣體產生，可溶性固形物含量基本不變且用比重計測量讀數(shù)小于1.0 時，表示主發(fā)酵結束[18]，發(fā)酵時間為7 d。

后發(fā)酵：采用虹吸法將主發(fā)酵結束后的上層酒液轉入另一個滅菌的玻璃泡菜壇內，水封，15 ℃靜置發(fā)酵8 d。

陳釀：在后發(fā)酵結束后的酒液中添加1.5 g/L 的殼聚糖進行澄清48 h。采用虹吸法將上層酒液轉入另一個滅菌的2.5 L 自動排氣密封罐，5 ℃存放15 d。

1.2.3 揮發(fā)性香味物質SPME-GC-MS 分析

1.2.3.1 樣品制備 取10 mL 樣品置于20 mL 萃取瓶中，加入20 μL 5 mg/mL 的苯乙酸異戊酯作內標，密封，置于60 ℃水浴中，磁力攪拌速度500 r/min，平衡20 min 后，將活化后的萃取頭插入樣品頂空部分，萃取30 min，于250 ℃解吸5 min 后進行GC-MS數(shù)據(jù)采集與檢測。

1.2.3.2 GC-MS 條件 GC 條件：進樣口溫度250 ℃，氣質接口溫度250 ℃，載氣流速1.5 mL/min。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升溫到100 ℃保持2 min 后；以4 ℃/min 升溫到140 ℃保持1 min 后；以4 ℃/min 升溫到180 ℃保持2 min后；以5 ℃/min 升溫到250 ℃保持5 min。

MS 條件：EI 源，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電離能量70 eV，掃描范圍35～550 Da。

1.2.3.3 定性定量方法 將樣品中揮發(fā)性香味物質的測定結果與WILEY8.0 和NIST2014 中的譜庫進行對比分析，僅保留正反匹配度大于80%的物質（最大的匹配度為100%）。以5 mg/mL 苯乙酸異戊酯為內標物對樣品中揮發(fā)性香味物質進行定量分析，計算公式如下：

式中：Cx和Ax分別為待測揮發(fā)性化合物的濃度（μg/L）和峰面積，m 和A 分別為加入內標物的質量（μg）和峰面積，V 為樣品的體積（L）。

1.2.3.4 主體揮發(fā)性香味物質的OAV 分析 通過OAV 對不同發(fā)酵階段蘆筍獼猴桃復合果酒的主體揮發(fā)性香味物質進行分析與評價，計算公式如下：

式中：Ci為某種揮發(fā)性香味物質的含量（μg/L）；OTi為該化合物的嗅覺閾值（μg/L）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 18.0 和Excel 2010 軟件進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段蘆筍獼猴桃復合果酒中揮發(fā)性香氣物質分析

采用SPEM-GC-MS 技術對蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性香味物質進行分析鑒定，由表1 可知，共檢測出78 種揮發(fā)性香氣物質，包括37 種酯類、20 種羰基類、12 種醇類、5 種烷烴類、2 種酚類、1 種萜烯類和1 種酸類。

表1 蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣成分及含量Table 1 Volatile aroma components and content of asparagus-kiwifruit wine during fermentation

續(xù)表1

續(xù)表1

由表2 可知，發(fā)酵前期（1 d）、發(fā)酵中期（4 d）、發(fā)酵后期（7 d）、后發(fā)酵（15 d）、陳釀期（30 d）樣品中分別檢測出51、38、24、21 和26 種揮發(fā)性香味物質，總質量濃度分別為1882.559、11199.326、6786.553、4933.908、5712.280 μg/L。在蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵期間，揮發(fā)性香氣物質的種類是逐漸下降并趨于平穩(wěn)的狀態(tài)，質量濃度是呈先上升后下降并趨于平穩(wěn)的狀態(tài)。在整個發(fā)酵階段中，含量較高的揮發(fā)性香氣物質均為酯類和醇類，它們對蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵過程中整體香氣具有重大的貢獻。該結果與有關獼猴桃酒揮發(fā)性香氣物質的研究一致[20,25]。

表2 蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣物質的種類及含量Table 2 Volatile aroma types and content of asparagus-kiwifruit wine during fermentation

2.1.1 各發(fā)酵階段的蘆筍獼猴桃復合果酒中酯類物質分析 酯類是構成發(fā)酵酒香氣骨架的主要成分，也是作為評價發(fā)酵酒的重要指標之一，其主要來源于釀酒酵母的發(fā)酵產物及高級醇、脂肪酸在酶催化下發(fā)生酯化反應[26?27]；并能賦予水果和花香味，對增加酒體風味的多樣性和愉悅性具有積極的作用[28]。在以紅心火龍果[21]、獼猴桃[25]、葡萄[28]等為原料所釀造的果酒均體現(xiàn)出酯類對酒體風味的有著重要貢獻。

結果顯示，酯類是蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵過程中種類最多的揮發(fā)性香味物質。在蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵階段的5 個樣品中分別檢測出20、27、15、13 和17 種酯類揮發(fā)性香味物質，總質量濃度分別為653.284、6781.996、2275.226、1546.319 μg/L 和2132.338 μg/L。酯類的含量變化呈先上升后下降并趨于平衡，這是由于酵母菌進入發(fā)酵后期之后，其活力變弱，因此與發(fā)酵中期相比，酒中的酯類含量有所下降[26]。由于蘆筍獼猴桃復合果酒中乙醇含量較高，在其發(fā)酵過程中，乙酯含量在總酯中所占比例相對較大，分別為54.72%、79.20%、72.92%、76.60%、70.14%，乙酯含量占比呈現(xiàn)先上升后趨于穩(wěn)定狀態(tài)，這與酒中乙醇濃度隨著發(fā)酵進行趨于平衡有關。

乙酸異戊酯、己酸乙酯、苯乙酸甲酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯和癸酸乙酯為整個發(fā)酵階段中共有的酯類化合物。在發(fā)酵中期，癸酸乙酯（1658.164 μg/L）、辛酸乙酯（1429.724 μg/L）、乙酸異戊酯（1150.851 μg/L）和己酸乙酯（516.763 μg/L）的含量均高于其它發(fā)酵階段；在發(fā)酵前期，苯乙酸乙酯（87.149 μg/L）和苯乙酸甲酯（47.439 μg/L）的含量均高于其它發(fā)酵階段，并呈現(xiàn)逐漸下降并趨于穩(wěn)定的狀態(tài)。在發(fā)酵前期，主要的酯類是二氫茉莉酮酸甲酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，含量最高的為二氫茉莉酮酸甲酯（132.332 μg/L），但在其它發(fā)酵階段均未檢測出該物質。在發(fā)酵中期、發(fā)酵后期、后發(fā)酵和陳釀期主要的酯類均為癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯及乙酸乙酯，這些酯類化合物賦予了蘆筍獼猴桃復合果酒果香、花香及甜香[21]。其中，陳釀期中乙酸乙酯、乙酸異戊酯和辛酸乙酯的含量高于后發(fā)酵期。

2.1.2 各發(fā)酵階段的蘆筍獼猴桃復合果酒中醇類物質分析 醇類是酯類化合物的前驅物質，是賦予發(fā)酵酒醇甜和香味的主要來源之一[29]，其種類僅次于酯類。醇類化合物一方面是酵母通過糖分解代謝或脫羧反應而形成的代謝產物，另一方面是蘆筍原料中蛋白質分解或微生物菌體蛋白水解成氨基酸，在發(fā)酵過程中，氨基酸發(fā)生脫氨、脫羧反應，并降解成各種醇類[30]。在蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵階段的5 個樣品中分別檢測出8、6、6、6 和6 種醇類揮發(fā)性香味物質，總質量濃度分別為670.321、4239.800、4312.885、3334.979 和3536.846 μg/L，醇類的含量變化呈現(xiàn)先上升后下降并趨于平衡的狀態(tài)。

異戊醇、異丁醇和苯乙醇為整個發(fā)酵階段中共有的醇類化合物。在發(fā)酵后期，異戊醇（3357.138 μg/L）和異丁醇（497.657 μg/L）的含量最高。在各發(fā)酵階段含量最高醇類均為異戊醇，其屬于高級醇是雜醇油的主要成分，也是葡萄酒中重要的風味物質[31]，具有蘋果白蘭地香味和草香味[32]，在整個發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先上升后下降并趨于穩(wěn)定狀態(tài)。異丁醇是一種具有酒精味和指甲油味的高級醇，其變化規(guī)律與異戊醇類似。在蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵過程中的苯乙基類物質主要為苯乙醇，在發(fā)酵中期含量最高（573.196 μg/L），它是莽草酸的衍生物，賦予酒濃郁的薔薇香、玫瑰花香、茉莉花香等多種花香和果香[33]。有相關報道顯示：異戊醇和苯乙醇是櫻桃果酒[20,25]和獼猴桃果酒[34]主要醇類物質。2,3-丁二醇在發(fā)酵前期未檢測到，其中發(fā)酵中期的含量最高（628.089 μg/L），呈現(xiàn)先下降后緩慢上升的趨勢，陳釀期的含量高于發(fā)酵后期和后發(fā)酵期。2,3-丁二醇具有黃油和奶油味，但閾值較大，對風味影響較小[19]。

2.1.3 各發(fā)酵階段的蘆筍獼猴桃復合果酒中其它香味物質分析 酸類化合物屬于酵母發(fā)酵的次級代謝產物，可與醇類化合物反應生成酯類，因其閾值較高，對酒的風味貢獻起到助香、協(xié)調和平衡的輔助作用[22]。結果顯示，僅在蘆筍獼猴桃復合果酒的發(fā)酵中期檢測到104.267 μg/L 的乙酸，乙酸在低濃度時具有濃郁的、令人愉快的醋香味，對酒的口感及風味有較好的修飾作用。在其它發(fā)酵階段均未檢測到酸類化合物。

羰基類化合物可通過醇類氧化形成，但多數(shù)是微生物發(fā)酵的代謝產物之一，其賦予酒水果香味。結果顯示，在發(fā)酵前期、發(fā)酵中期及發(fā)酵后期分別檢測到19、2 和1 種羰基類化合物，總質量濃度分別為484.644、15.927 和154.173 μg/L。羰基類化合物主要產生于發(fā)酵前期，可能是由于前期微生物代謝活躍，產生的種類及量較多。但這類物質的化學性質較為活潑，是一種不穩(wěn)定的中間化合物，會在發(fā)酵過程中進一步發(fā)生氧化形成羧酸類化合物，使其含量降低[35]。為此，在后發(fā)酵及陳釀期均未檢測到羰基類化合物。己醛是具有生青味的物質，僅在發(fā)酵前期中檢測出，且是發(fā)酵前期含量（125.797 μg/L）最高的羰基類化合物。有研究表明己醛是紅心火龍果汁中特征香氣物質，但其釀制的果酒中并未含有該種化合物[21]。

較高濃度的苯酚類化合物能賦予酒類似藥味的香氣[36]。在蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵階段的5 個樣品中共檢測出2 種苯酚類物質，在整個發(fā)酵階段均檢測到2,4-二叔丁基苯酚，其具有濃郁的果香味，在發(fā)酵前期含量最高（44.221 μg/L）。此外，2,6-二叔丁基對甲酚僅存在于陳釀期。在整個發(fā)酵階段檢測到2 種烷烴類化合物，其中環(huán)庚烷僅在發(fā)酵前期存在，而檸檬烯存在于整個發(fā)酵階段，其具有濃郁的檸檬和花香味，在發(fā)酵前期含量最高（22.741 μg/L）。雖然苯酚類和烷烴類化合物的種類和含量均較低，閾值較高，對風味貢獻較低，但它們具有較為明顯的香氣特征，對蘆筍獼猴桃復合果酒的主體香氣具有一定的修飾作用。

萜烯類化合物通常是以糖苷的形式存在于果肉中，在微生物發(fā)酵過程中，經酶解作用下釋放出來，形成游離狀態(tài)且具有揮發(fā)性的風味物質。該類化合物閾值較低，且具有水果和花香味，即使在低濃度下對酒的風味仍有著較大貢獻[37]。本實驗中僅在發(fā)酵前期檢測出桉葉油醇（3.566 μg/L），該物質賦予蘆筍獼猴桃復合果酒水果甜香味及薄荷香氣。有研究顯示，桉葉油醇普遍存在于獼猴桃果酒中[20,25]。

2.2 各發(fā)酵階段的蘆筍獼猴桃復合果酒特征香氣分析

酒的主體風味、香氣感官貢獻率與各揮發(fā)性香氣物質的濃度及其閾值密切相關，為進一步了解蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵各階段中主體揮發(fā)性香氣物質成分，采用OAV 法篩選出各發(fā)酵階段的特征香氣物質。OAV＞1 的香氣化合物對酒的風味特征有貢獻，且OAV 值越大，對風味特征貢獻就越大；而OAV＜1 的香氣化合物對酒整體風味起到一定的協(xié)調和修飾作用[38]。

由表3 可知，在蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵過程中，共得到13 種特征香氣物質，包括10 種酯類、2 種醛類和1 種萜烯類。5 個樣品中分別檢測出8、6、4、6 和8 種特征香氣物質。己酸乙酯和辛酸乙酯為5 個樣品中共有的特征香氣物質，其中辛酸乙酯是在各發(fā)酵階段中OAV 值最大的化合物，這些化合物屬于中鏈脂肪酸乙酯，具有濃郁的果香和花香味，因閾值較低，使得OAV 值大，對酒的香氣有著較大貢獻，這說明果香和花香味是蘆筍獼猴桃復合果酒的特征香氣，這與Zhao 等[39]研究結論一致。其次，乙酸異戊酯和2-甲基丁基乙酸酯的OAV 較大，有研究表示[40]，這些化合物是野生獼猴桃酒的特征香氣物質。其中，乙酸異戊酯是發(fā)酵中期、發(fā)酵后期、后發(fā)酵和陳釀期的特征香氣物質；2-甲基丁基乙酸酯是發(fā)酵前期、后發(fā)酵和陳釀期的特征香氣物質。己醛、苯乙醛和桉葉油醇僅在發(fā)酵前期檢測出，也是發(fā)酵前期的主要特征香氣成分，賦予花香、青草和薄荷香。2-甲基丁酸乙酯具有甜水果味，僅在發(fā)酵前期和陳釀期檢測出，雖含量較低，但其閾值為1 μg/L，是發(fā)酵前期和陳釀期的特征香氣物質。異戊酸乙酯僅在陳釀期檢測出，屬于陳釀期的特征香氣物質，具有香蕉和甜水果味。癸酸乙酯屬于中鏈脂肪酸乙酯，其閾值較高（200 μg/L），但其含量除在發(fā)酵前期含量較低外，其它階段含量均較高，且OAV 值＞1，賦予一定的果香和脂肪味。因此，在蘆筍獼猴桃復合果酒的不同發(fā)酵階段的特征香氣物質的成分存在一定的差異性。

表3 蘆筍獼猴桃復合果酒發(fā)酵過程中特征香氣成分OAV 分析Table 3 OAV analysis of aroma characteristics of asparagus-kiwifruit wine during fermentation

3 結論

本文主要研究了蘆筍獼猴桃復合果酒在發(fā)酵前期、發(fā)酵中期、發(fā)酵后期、后發(fā)酵、陳釀期中揮發(fā)性香味物質的變化規(guī)律。在發(fā)酵期間，共檢測出78 種揮發(fā)性香氣物質，其種類是逐漸下降并趨于平穩(wěn)的狀態(tài)，其質量濃度呈先上升后下降并趨于平穩(wěn)的狀態(tài)。各發(fā)酵階段中含量較高的揮發(fā)性香氣物質均為酯類和醇類，該類化合物對酒的整體香氣具有重大貢獻。

從OAV 法鑒定出13 種特征香氣物質，主要為酯類化合物，其中整個發(fā)酵階段中共有的特征香氣物質為己酸乙酯和辛酸乙酯，賦予了蘆筍獼猴桃復合果酒濃郁的果香和花香的特征香氣。結果表明不同發(fā)酵階段的特征香氣物質成分存在一定的差異性，產生差異性的內在機理還需進一步研究。該研究一方面能為蘆筍獼猴桃復合果酒的品質分析提供理論參考，另一方面也為蘆筍副產物高值化綜合利用提供新的途徑。