吳曉婷，賴榮泉*，顧 鋼，米月娥，韓 夢(mèng)，張 榜，曾文龍

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；2.中國(guó)煙草總公司福建省公司，福州 350003；3.福建省煙草公司龍巖市公司，龍巖 364000）

煙蚜Myzuspersicae(Sulzer)又叫桃蚜，是煙草生產(chǎn)上的一種重要害蟲，在我國(guó)各大煙區(qū)均有發(fā)生[1]。煙蚜寄主范圍廣、繁殖速度快、數(shù)量多，可通過吸取煙株汁液直接為害煙株，還可通過分泌蜜露，誘發(fā)煤污病和傳播多種煙草病毒病間接為害煙株[2]。在煙草生產(chǎn)上，化學(xué)防治由于見效快、效果好，因此成為煙農(nóng)控制煙蚜最常用的手段。但長(zhǎng)期不合理利用化學(xué)農(nóng)藥防治煙蚜，容易造成農(nóng)藥殘留、煙蚜產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境污染嚴(yán)峻等問題[3]。由于粘黃板等物理防治效果不穩(wěn)定，且成本較高，因此不利于大面積推廣[4]。利用天敵煙蚜繭蜂防治煙蚜雖有一定效果，但生產(chǎn)上不能完全僅依靠天敵來防治煙蚜。近年來，人們通過從植物中提取具有較好殺蟲活性的物質(zhì)來防治農(nóng)林害蟲已成為研究的熱點(diǎn)，本文旨在開發(fā)一個(gè)新型殺蟲劑。這種殺蟲劑對(duì)煙蚜的防治具有重要的意義。

近年來，植物根系分泌物在植物病蟲害防治中的研究和應(yīng)用越來越受人們的重視[5]。大蒜Allium sativumL.為百合科蔥屬植物，種質(zhì)資源豐富，我國(guó)大蒜種植面積占全球栽培面積的三分之二[6]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，大蒜是公認(rèn)的良好前茬作物，一些作物與大蒜輪作、間作或套種可減輕病蟲害的發(fā)生[7-10]。鄭素慧等[11]發(fā)現(xiàn)大蒜精油對(duì)印度谷螟Plodiainterterpunctella幼蟲的羽化抑制作用顯著。謝楓等[12]發(fā)現(xiàn)，50%大蒜精油對(duì)灰茶尺蠖EctropisgrisescensWarren具有較好的防效。張強(qiáng)等[13]研究表明，大蒜精油對(duì)桃蚜Myzuspersicae(Sulzer)有較強(qiáng)的毒殺作用，可有效控制桃蚜。徐向龍[14]曾報(bào)道，可利用大蒜與白菜間作來控制蚜蟲，減少蚜蟲的發(fā)生數(shù)量。大蒜乙醇抽提物對(duì)煙蚜和斜紋夜蛾SpodopteralituraFabricius 3齡幼蟲有一定的拒食與毒殺作用、對(duì)煙蚜和煙粉虱Bemisiatabaci有較明顯的干擾作用[15,16]。雖然煙田套種大蒜煙蚜種群數(shù)量顯著降低且發(fā)生也較遲[10,17]，但其控制機(jī)制除了煙-蒜生態(tài)系統(tǒng)多樣性及大蒜地上部揮發(fā)物等對(duì)煙蚜有驅(qū)避、忌避等作用外[8,18]，大蒜根系分泌物等地下部分對(duì)煙蚜是否也有忌避、觸殺等作用呢？這方面研究目前未見有報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)通過收集大蒜根系分泌物、分析鑒定其成份，測(cè)定了大蒜根系分泌物粗提物及其4種成份對(duì)煙蚜的忌避、觸殺等生物活性，鑒定了具有明顯效果的驅(qū)蟲活性物質(zhì)，進(jìn)而明確大蒜根系分泌物及其成份對(duì)煙蚜的作用，以期為利用大蒜根系分泌物控制煙蚜或研制植物保護(hù)劑提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙草品種：紅花大金元，福建省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所南平分所提供。

無翅煙蚜：采自長(zhǎng)汀縣煙草公司科技園，并在福建農(nóng)林大學(xué)科技園田間實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)2～3代后試驗(yàn)。

試劑：99.5%鄰苯二甲酸二丁酯，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；98.0% 2,6-二異丙基苯酚，上海麥克林生化科技有限公司；85.0%二烯丙基二硫，上海麥克林生化科技有限公司；AR，2,6-二叔丁基對(duì)甲酚，上海麥克林生化科技有限公司；99.5%丙酮，西隴科學(xué)股份有限公司；99.5%甲醇，西隴科學(xué)股份有限公司。

儀器材料：Agilent 7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS），美國(guó)安捷倫公司；MRC-250B-LED人工氣候箱，寧波普朗特儀器有限公司；AUY120電子天平，日本島津公司；OLYMPUS BX43生物顯微鏡，福建遠(yuǎn)明生物科技有限公司；MLS-3781L-PC滅菌鍋，日本Panasonic公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；PDE0003微量點(diǎn)滴儀，上海瑾瑜科學(xué)儀器有限公司；品氏泥炭基質(zhì)，丹麥品氏托普公司；塑料瓶（瓶口直徑95 mm，瓶底直徑80 mm，高85 mm，容積450 mL）等。

1.2 大蒜根系分泌物收集

參考周艷麗等[19]和劉素慧等[20]方法。采用固體瓊脂培養(yǎng)法，獲得含有大蒜根系分泌物的培養(yǎng)基[21]。

1.3 大蒜根系分泌物粗提物對(duì)煙蚜的生物活性測(cè)定

1.3.1 大蒜根系分泌物粗提物對(duì)煙蚜的忌避活性測(cè)定 參考蔣恩順等[22]和商顯坤等[23]的方法。利用葉片涂抹法，將已濃縮好的大蒜根系分泌物粗提物用50%甲醇水溶液分別稀釋為0.25，0.50，1.00，2.00和4.00 g/mL。將新鮮的煙葉沿中間葉脈剪成2半長(zhǎng)方形葉碟（長(zhǎng)×寬＝4 cm×2 cm），用毛筆刷將1 mL不同濃度的大蒜根系分泌物粗提物均勻地涂抹在一半葉碟正反兩面，另一半葉碟用1 mL 50%甲醇水溶液稀釋過的不種蒜瓣粗提物混合液涂抹（對(duì)照），陰干后，置于保濕煙草葉片的培養(yǎng)皿中。每培養(yǎng)皿中放置1片2半葉碟，每皿中處理和對(duì)照各1半煙葉（2半葉碟）。將試驗(yàn)前已饑餓4 h的4齡煙蚜接入培養(yǎng)皿中（2半煙葉中間）。每皿接入30頭煙蚜，培養(yǎng)皿用保鮮膜封口，并用針扎50個(gè)通氣孔，每處理或?qū)φ罩貜?fù)3次。放置在25 ℃的溫室內(nèi)，于12、24、48 h后檢查各培養(yǎng)皿中煙葉上煙蚜棲息數(shù)量。忌避率（%）＝（對(duì)照葉片棲息蟲數(shù)—處理葉片棲息蟲數(shù)）/（對(duì)照葉片棲息蟲數(shù)＋處理葉片棲息蟲數(shù)）×100。

1.3.2 大蒜根系分泌物粗提物對(duì)煙蚜的觸殺活性測(cè)定 參考蔣恩順等[22]和張敏等[24]的方法。采用點(diǎn)滴法，大蒜根系分泌物粗提物用50%甲醇水溶液分別稀釋為0.25，0.50，1.00，2.00和4.00 g/mL。用微量點(diǎn)滴儀分別在煙蚜的前胸背板處點(diǎn)滴1 μL不同濃度的大蒜根系分泌物粗提物。每處理30頭4齡無翅煙蚜，每個(gè)處理重復(fù)3次，以50%甲醇水溶液稀釋過的不種蒜瓣粗提物混合液為對(duì)照。處理后將煙蚜接入帶有保濕的煙草葉片培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿用保鮮膜封口，并用針扎50個(gè)通氣孔。放置在25 ℃的溫室內(nèi)，分別在12、24、48 h后檢查煙蚜存活情況。用毛筆刷輕觸煙蚜的足和觸角，若無反應(yīng)即為死亡。死亡率（%）＝死亡蟲數(shù)/（活蟲數(shù)＋死亡蟲數(shù)）×100；校正死亡率（%）＝（處理死亡率—對(duì)照死亡率）/（1—對(duì)照死亡率）×100。

根據(jù)公式分別計(jì)算其死亡率、校正死亡率。

1.4 大蒜根系分泌物四種成份對(duì)煙蚜的生物活性測(cè)定

根據(jù)本課題組對(duì)大蒜根系分泌物成份的分析（吳曉婷等[21]）及周艷麗等[25]和劉素慧等[20]試驗(yàn)，結(jié)合本試驗(yàn)初篩結(jié)果，選取鄰苯二甲酸二丁酯、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、二烯丙基二硫和 2,6-二異丙基苯酚 4種大蒜根系分泌物成份進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.1 大蒜根系分泌物4種成份對(duì)煙蚜的忌避活性測(cè)定 參考蔣恩順等[22]和商顯坤等[23]方法。用50%丙酮將鄰苯二甲酸二丁酯、2,6-二異丙基苯酚、二烯丙基二硫、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚四種標(biāo)準(zhǔn)化合物按體積比1: 1000，1: 500，1: 100，1: 50，1: 10配置成梯度溶液，以50%丙酮水溶液作為對(duì)照。方法同“1.3.1”。根據(jù)公式計(jì)算其忌避率。

1.4.2 大蒜根系分泌物 4種成份對(duì)煙蚜的觸殺活性測(cè)定 參考蔣恩順等[22]和張敏等[24]的方法。采用點(diǎn)滴法，用50%丙酮將鄰苯二甲酸二丁酯、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、二烯丙基二硫和2,6-二異丙基苯酚4種標(biāo)準(zhǔn)化合物按體積比1:1000，1:500，1:100，1:50，1:10配置成梯度溶液，以50%丙酮水溶液作為對(duì)照。方法同“1.3.2”，分別計(jì)算其死亡率、校正死亡率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2003軟件記錄、整理數(shù)據(jù)和作圖，SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和多重比較（LSD）進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜根系分泌物粗提物對(duì)煙蚜的忌避活性

在同一處理時(shí)間（12、24、48 h）后，煙蚜的忌避率隨著大蒜根系分泌物處理濃度的升高而增大，且差異均達(dá)極顯著（12 h：F5,12＝29.161，P＝0.000；24 h：F5,12＝52.487，P＝0.000；48 h：F5,12＝37.703，P＝0.000）。大蒜根系分泌物為4 g/mL時(shí)，處理12 h、24 h和48 h后，大蒜根系分泌物對(duì)煙蚜的忌避率分別為80.56%、79.89%和75.93%，忌避活性較好；當(dāng)濃度為0.25 g/mL時(shí)，大蒜根系分泌物對(duì)煙蚜的忌避率分別為8.02%、14.69%和19.17%，忌避活性相對(duì)較差。除0.25 g/mL外，同一大蒜根系分泌物濃度下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，大蒜根系分泌物對(duì)煙蚜的忌避率總體呈下降趨勢(shì)（圖1）。

圖1 大蒜根系分泌物粗提物對(duì)煙蚜的忌避活性Fig.1 Deterrent activity of garlic root exudates against M.persicae

2.2 大蒜根系分泌物粗提物對(duì)煙蚜的觸殺活性

大蒜根系分泌物粗提物對(duì)煙蚜具有較好的觸殺活性，其死亡率在2.22%～96.67%。在同一處理時(shí)間（12、24、48 h）后，煙蚜的死亡率隨著大蒜根系分泌物濃度增大而增加，當(dāng)大蒜根系分泌物濃度≥1 g/mL時(shí)，其死亡率、校正死亡率與對(duì)照相比差異均顯著。當(dāng)濃度為 4 g/mL時(shí)，12、24、48 h后煙蚜的死亡率分別為93.33%、92.22%和96.67%，且差異均達(dá)極顯著（12 h：F5,12＝55.061，P＝0.000；24 h：F5,12＝65.780，P＝0.000；48 h：F5,12＝48.776，P＝0.000）；其校正死亡率分別為93.10%、92.07%和96.47%，差異均達(dá)極顯著（12 h：F5,12＝54.479，P＝0.000；24 h：F5,12＝70.314，P＝0.000；48 h：F5,12＝44.408，P＝0.000）（圖 2）。

圖2 大蒜根系分泌物粗提物對(duì)煙蚜的觸殺活性Fig.2 Toxic activity of garlic root exudates against M.persicae

2.3 大蒜根系分泌物四種成份對(duì)煙蚜的忌避活性

大蒜根系分泌物四種成份，鄰苯二甲酸二丁酯、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、二烯丙基二硫和2,6-二異丙基苯酚對(duì)煙蚜均有不同程度的忌避活性。四種成份處理煙蚜后，發(fā)現(xiàn)以 2,6-二異丙基苯酚的忌避活性較好，不同時(shí)間段內(nèi)差異均極顯著（12 h：F5,12＝122.623，P＝0.000；24 h：F5,12＝145.594，P＝0.000；48 h：F5,12＝92.136，P＝0.000），除 12 h 1:1000的處理對(duì)煙蚜有吸引作用外，其他處理對(duì)煙蚜的忌避率在24.84%～100.00%，忌避活性隨2,6-二異丙基苯酚濃度的增加而增大。其中，濃度為1:50和1:10的2,6-二異丙基苯酚對(duì)煙蚜的忌避活性較好，其對(duì)煙蚜的忌避率為 93.65%～100.00%，而 1:10濃度處理下，煙葉皺縮腐爛，引起藥害。其次依次為二烯丙基二硫、鄰苯二甲酸二丁酯，其忌避率分別為 20.31%～100.00%和 6.73%～85.47%。2,6-二叔丁基對(duì)甲酚的忌避活性較差，忌避率為7.23%～53.41%，處理12、24、48 h后差異均極顯著（12 h：F5,12＝7.291，P＝0.001；24 h：F5,12＝6.174，P＝0.005；48 h：F5,12＝5.774，P＝0.000）。在同一濃度不同處理時(shí)間下，除鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)煙蚜的忌避率呈下降趨勢(shì)外，其他三種成份總體呈上升趨勢(shì)?？傮w上，這4種大蒜根系分泌物成份對(duì)煙蚜的忌避活性由強(qiáng)至弱順序?yàn)?,6-二異丙基苯酚，二烯丙基二硫，鄰苯二甲酸二丁酯，2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（表1）。

表1 大蒜根系分泌物四種成份對(duì)煙蚜的忌避活性Table 1 Deterrent activity of the four components of garlic root exudates against M.persicae

2.4 大蒜根系分泌物四種成份對(duì)煙蚜的觸殺活性

大蒜根系分泌物四種成份，鄰苯二甲酸二丁酯、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、二烯丙基二硫和 2,6-二異丙基苯酚對(duì)煙蚜均有不同程度的觸殺活性，其持續(xù)活性較好。四種成份對(duì)煙蚜的觸殺活性均達(dá)顯著差異。在同一時(shí)間不同濃度處理下，死亡率均隨物質(zhì)濃度增加而增大，在同一濃度不同時(shí)間內(nèi)，煙蚜的死亡率隨著時(shí)間增加而逐漸增大。對(duì)煙蚜具有較好觸殺活性的是鄰苯二甲酸二丁酯和 2,6-二異丙基苯酚，二者濃度≥1:100，處理48 h后，發(fā)現(xiàn)煙蚜的死亡率均在83.33%～92.22%，且差異達(dá)極顯著（P＝0.000），其校正死亡率也在79.48%～90.61%，差異極顯著（P＝0.000）。其次為2,6-二叔丁基對(duì)甲酚和二烯丙基二硫，二者在濃度≥1:100，處理煙蚜48 h后，其死亡率均在47.78%～90.00%，與對(duì)照差異達(dá)極顯著（P＝0.000），其校正死亡率均在36.63%～88.43%，差異極顯著（P＝0.000）?？傮w上，這4種大蒜根系分泌物成份對(duì)煙蚜的觸殺活性由強(qiáng)至弱順序?yàn)?,6-二異丙基苯酚，鄰苯二甲酸二丁酯，2,6-二叔丁基對(duì)甲酚，二烯丙基二硫（表2）。

表2 大蒜根系分泌物四種成份對(duì)煙蚜的觸殺活性Table 2 Toxic activity of the four components of garlic root exudates against M.persicae

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明大蒜根系分泌物及其4種成份均對(duì)煙蚜有顯著的觸殺或忌避活性。其中，當(dāng)大蒜根系分泌物粗提物為4 g/mL時(shí)，粗提物對(duì)煙蚜有較好的忌避活性、觸殺活性。這與賴榮泉和尤民生[16]報(bào)道的結(jié)果相一致。姬靜華等[26]發(fā)現(xiàn)大蒜植株和蒜瓣中的大蒜素對(duì)福壽螺具有抑制取食為害，甚至毒殺的效果。賴榮泉和尤民生[16]報(bào)道了大蒜乙醇抽提物對(duì)煙蚜拒食活性和觸殺活性有顯著的作用，大蒜地上部分莖葉或地下部蒜瓣等提取物均對(duì)煙蚜或其他蟲害有一定的拒食活性和觸殺作用。本文試驗(yàn)結(jié)果也說明大蒜地下部分即根系分泌物對(duì)煙蚜有明顯的忌避、觸殺作用。

經(jīng)對(duì)大蒜根系分泌物分離、成份鑒定（吳曉婷等[21]）及測(cè)定其4種成份對(duì)煙蚜的生物活性發(fā)現(xiàn)：大蒜根系分泌物4種成份對(duì)煙蚜也有顯著的忌避和觸殺作用。其中，2,6-二異丙基苯酚對(duì)煙蚜的忌避活性較好；鄰苯二甲酸二丁酯和2,6-二異丙基苯酚對(duì)煙蚜觸殺活性較好。董志堅(jiān)等[27]也報(bào)道大蒜精油對(duì)煙蚜有較好的毒殺活性。這說明大蒜根系分泌物中某些成份對(duì)煙蚜具有較高的忌避、觸殺作用，也說明大蒜根系分泌物主要成份與地上部分提取物、大蒜精油相似均對(duì)煙蚜有明顯的忌避、觸殺作用，但它們起作用的物質(zhì)或成份是否相似，有待進(jìn)一步的研究。

此外，我們發(fā)現(xiàn)大蒜根系分泌物4種成份中以2,6-二異丙基苯酚對(duì)煙蚜的忌避活性和觸殺活性最強(qiáng)，但關(guān)于其生理生化機(jī)制，有待進(jìn)一步的研究。另外，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2,6-二異丙基苯酚在1: 10濃度下，煙葉皺縮腐爛，引起藥害，而 1:100濃度下，2,6-二異丙基苯酚可明顯提高對(duì)煙蚜的忌避率和死亡率。因此，本文研究結(jié)果可為研制含大蒜根系分泌物或其成份的植物保護(hù)劑和間作、套種大蒜等綠色防控措施防控?zé)熝撂峁┛茖W(xué)參考。