邱天藝，徐 悅，甄錦程，司 璐，于洪佳，穆玉婷，徐利劍

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

現(xiàn)在地球上已知的真菌已經(jīng)超過14萬種[1]，真菌是重要的天然資源，可以應(yīng)用在抗菌和纖維素降解等領(lǐng)域[2-5]。在森林中有大量的凋落物，凋落物的降解依賴于凋落物真菌及其他微生物，所以森林凋落物也被認(rèn)為是良好的真菌棲息地。在大興安嶺森林凋落物中有著豐富的且未被開發(fā)利用的真菌資源，本研究力求為這些資源的利用打下基礎(chǔ)。

森林凋落物包括植物枯根、樹林下枯死的一年生二年生草本植物和整個森林中樹木干枯的樹枝、敗葉、樹皮和其他繁殖器官[6]。凋落物給真菌提供有機(jī)質(zhì)，真菌可以將有機(jī)質(zhì)分解。大興安嶺地處中國高緯度寒區(qū)，屬于多年凍土帶南部，是中國保存最好、面積最大的原始森林[7]。劉博洋等[8]利用顆粒法在大興安嶺森林凋落物分離了40株真菌，其中有6株為未培養(yǎng)過真菌，有2株真菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有抗細(xì)菌活性，還有2株真菌的提取物具有DPPH清除自由基活性。李澤宇等[9]在大興安嶺地區(qū)多年凍土樣品中分離得到可培養(yǎng)真菌66株，隸屬于55個分類單元，有5株為耐冷真菌，6株表現(xiàn)出抗菌活性，有1株表現(xiàn)出抗氧化活性和纖維素降解活性，并首次發(fā)現(xiàn)了Seltsamia屬真菌具有抗氧化和纖維素降解活性。張哲棟等[10]在大興安嶺地區(qū)中分離了88株真菌，測試了18株ITS相似性≤97%的真菌的抗菌活性，從KNFL008和KNFL040中分離到4個化合物，其中2個化合物是第一次在真菌中分離得到。纖維素是植物的重要組成成分，廣泛分布在自然界中，是地球重要的可再生資源[11]。纖維素作為大分子有機(jī)物經(jīng)過簡單的燃燒，利用率極低同時污染環(huán)境；若有效的將其降解不僅可以能源再利用，還可以減少環(huán)境污染[12-14]。最常被報道的3種可以降解纖維素的真菌分別為：青霉(Penicillium)屬、木霉(Trichoderma)屬和曲霉(Aspergillus)屬，相比之下新發(fā)現(xiàn)的真菌很少被報道纖維素降解活性[9]。

在大興安嶺森林凋落物有著豐富的真菌資源，而且真菌具有抗菌活性和纖維素降解活性，本研究目的在于為大興安嶺真菌資源的利用提供備選菌株。以大興安嶺凋落物為研究對象，嘗試對來自凋落物中的未培養(yǎng)真菌進(jìn)行分離鑒定，篩選出具有抗菌或降解纖維素活性的菌株，并且分離活性真菌的代謝產(chǎn)物，為其進(jìn)一步深入的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 森林凋落物樣品來源于中國東北部大興安嶺林區(qū)（位于53°19′N，124°31′E），該批樣品于2019年9月采集，利用5點(diǎn)采樣法[15]進(jìn)行樣品的采集，將該采集地自下而上分為3層，分別為分解層、半分解層和未分解層[16]，每層深度為3～5 cm。采集后放入提前滅菌的信封中。

1.1.2 試驗試劑 馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)，200 g土豆煮沸20 min濾液，20 g葡萄糖，17 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L；LB液體培養(yǎng)基(LB)，10 g胰蛋白胨，5 g氯化鈉，5 g酵母浸粉，加入蒸餾水定容1 L；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)，200 g土豆煮沸20 min濾液，20 g葡萄糖，加入蒸餾水定容至1 L；LB固體培養(yǎng)基

(LBA)，10 g胰蛋白胨，5 g氯化鈉，5 g酵母浸粉，17 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L；酵母浸提物蔗糖培養(yǎng)基(YES)，150 g蔗糖，20 g酵母浸粉，0.5 g七水硫酸鎂，0.01 g七水硫酸鋅，0.005 g五水硫酸銅，加入蒸餾水定容至1 L。羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(CMC-Na)，15 g羧甲基纖維素鈉，10 g蛋白胨，5 g氯化鈉，5 g酵母浸粉，1 g磷酸二氫鉀，0.2 g七水硫酸鎂，瓊脂20 g，加入蒸餾水定容至1 L。

1.1.3 供試微生物 抗菌活性測試所用微生物為：水稻黃單胞水稻致病變種(Xanthomonas oryzaepv.Oryzae)，青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)和串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 稱取10 g凋落物樣品，粉碎后用無菌水清洗離心3次，再加入30 mL的無菌水混懸，將顆粒懸浮液加入稀釋4倍PDA培養(yǎng)基中；涂布均勻后，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h觀察一次，在體式顯微鏡下挑出萌發(fā)出的真菌菌落，轉(zhuǎn)接到60 mm PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)純化。

1.2.2 真菌分子生物學(xué)初步鑒定 利用CTAB法提取分離得到的真菌總DNA，然后擴(kuò)增其內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)的序列，以 ITS1 和ITS4作為引物，其中PCR擴(kuò)增的體系和條件參見Liang等[17]的方法。ITS序列利用BLAST[Basic Local Alignment Search Tool，(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)]工具與數(shù)據(jù)庫中的菌種序列進(jìn)行比對分析。再利用Mega X軟件對真菌DNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析。利用Clustal W工具進(jìn)行序列比對。測試最優(yōu)模型后，利用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。

1.2.3 菌株的發(fā)酵及其粗提物的制備 將菌絲塊接種于PD液體培養(yǎng)基中，在180 r/min，27℃條件下振蕩培養(yǎng)4天。按照3%的接種量將發(fā)酵液接種于YES+蛭石培養(yǎng)基，在27℃培養(yǎng)箱中靜止放置培養(yǎng)21天。待發(fā)酵結(jié)束后，加入1.5倍體積的乙酸乙酯，浸沒靜止放置12 h。乙酸乙酯濾液減壓濃縮得到提取物，加入1 mL 10%的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，放入4℃冰箱中保存。

1.2.4 抗菌活性測定 抗菌活性篩選均采用打孔藥劑擴(kuò)散法[18]，在合適溫度下，將10 mL測試菌液加入到無菌培養(yǎng)基中，搖勻倒入培養(yǎng)基中，冷卻凝固后，用無菌打孔器均勻的打6個孔。在每個孔中加入10 μL的金霉素（陽性對照）、提取物液或10%DMSO水溶液（溶劑對照）。放入27℃培養(yǎng)箱中，3次重復(fù)。對于抗絲狀真菌活性的篩選，把帶有測試菌液的固體培養(yǎng)基換成無菌的PDA培養(yǎng)基，然后在培養(yǎng)基的正中央接入絲狀真菌，以兩性霉素b為陽性對照。

1.2.5 纖維素活性降解初步篩選 采用剛果紅染色法[19]對真菌的纖維素酶降解活性進(jìn)行了初步篩選。將菌餅接種至羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基正中間，將其置于27℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h后，再倒入15 mL的1 mg/mL剛果紅溶液對CMC-Na培養(yǎng)基染色60 min后倒出染液，并用蒸餾水沖洗，再加入15 mL的1 mol/L NaCl溶液靜置40 min，以達(dá)到脫色的目的。觀察菌落生長情況、水解圈的大小和透明程度，并用D(cm)表示水解圈的直徑，d(cm)表示菌落的直徑，以D/d表示纖維素降解活性的能力大小。

1.2.6 活性物質(zhì)分離 對目標(biāo)菌株進(jìn)行大量發(fā)酵，發(fā)酵體積為2 L，并制備乙酸乙酯提取物，稱取和提取物相同重量的100～200目硅膠與其攪拌均勻，烘干。稱取粗提物20倍重量的200～300目硅膠填裝在正相硅膠柱中，然后干法上樣。使用二氯甲烷和甲醇進(jìn)行梯度洗脫，每個梯度分別洗脫1 L，減壓濃縮后得到正相硅膠柱分離組分。對正相硅膠柱分離組分進(jìn)行活性追蹤。然后，葡聚糖凝膠柱(Sephadex-LH20)分離，洗脫液為二氯甲烷和甲醇1:1。再使用半制備型高效液相制備單體化合物。將單體化合物進(jìn)行核磁共振分析(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，推定化合物的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定分離結(jié)果

本研究一共分離得到76株真菌，經(jīng)過GenBank上的ITS序列比對，發(fā)現(xiàn)76株真菌的最相近菌隸屬于3個門，9個綱，15個目，25個科，59個分類單元。其中有覆蓋率在99%及以上的、相似度在98.5%以下的真菌有21株，見表1。

表1 真菌相似度

續(xù)表1

2.2 菌株提取物活性測試

對21株ITS相似性≤98.5%菌種的乙酸乙酯提取物進(jìn)行抗菌活性測定，其中7株真菌表現(xiàn)出至少對1株測試菌表現(xiàn)出抑菌活性，如表2。通過對比發(fā)現(xiàn)FLF409的提取物對水稻黃單胞水稻致病變種和青枯勞爾氏菌都有較強(qiáng)的活性；因此，選擇FLF409進(jìn)行高效液相色譜分析進(jìn)行單體化合物的分離與純化。

表2 菌種粗提物抗菌活性篩選

2.3 真菌纖維素降解活性初篩

利用剛果紅染色法對分離得到的21株新型真菌進(jìn)行降解纖維素活性的定性測試，形成的降解圈較明顯清晰，其菌落直徑、水解圈直徑大小和降解能力見表3，說明4株真菌具有纖維素降解活性。FLF468的降解纖維素活性最好，降解圈與菌落直徑比值為1.87，F(xiàn)LF367和FLF449次之。

表3 真菌降解纖維素的活性

2.4 代謝物的分離與鑒定

2.4.1 菌株FLF409代謝物的分離與鑒定 FLF409的最相近菌種為子囊菌門的Subulispora biappendiculata。將得到的8 g乙酸乙酯提取物，經(jīng)正向硅膠柱層析洗脫，共得到16個組分，利用TLC和HPLC分析結(jié)果，對分離組分進(jìn)行合并。組分經(jīng)過Sephedax LH-20柱層析分離和半制備型高效液相色譜分離，得到了1個單體化合物，記為FLF409A。

FLF409A是白色晶體，易溶于二氯甲烷、甲醇和氯仿等有機(jī)試劑。其碳譜的化學(xué)位移值為：δ 135.37、132.19、117.55、75.97、73.69、67.74、56.00、54.77、43.78、43.49、42.82、40.4、39.49、39.23、37.15、33.09、32.98、30.88、27.91、22.90、22.06、21.12、19.95、19.65、18.85、17.59、12.34。通過和文獻(xiàn)中的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對比后，發(fā)現(xiàn)該化合物的1H-NMR、13C-NMR與文獻(xiàn)[20]中的波譜數(shù)據(jù)基本一致，推定FLF409A為6,9-表氧基-7,22-烯-3-麥角甾醇（分子式為C28H44O2），其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物FLF409A的結(jié)構(gòu)圖

2.4.2 菌株FLF449代謝物的分離與鑒定 FLF449菌隸屬于Parapyenchaeta屬，經(jīng)文獻(xiàn)查閱至今為止該屬尚未被分離鑒定過代謝物。所以本研究嘗試對其主要代謝物進(jìn)行分離純化。經(jīng)大量發(fā)酵，得到乙酸乙酯提取物5 g。經(jīng)過分離和純化后，鑒定了1個單體化合物，記為FLF449A。

FLF449A是白色晶體，易溶于甲醇。其碳譜的化學(xué)位移值為：δ 170.46、158.8、157.40、140.23、135.70、106.57、100.85、81.33、69.48、60.87、18.12。通過和文獻(xiàn)中的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對比后，發(fā)現(xiàn)該化合物的1HNMR、13C-NMR與文獻(xiàn)[21]中的波譜數(shù)據(jù)一致，推定FLF449A為4,6,8-三羥基-7-甲氧基-3-甲基二氫異香豆素（分子式為C11H12O6），結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 化合物FLF449A的結(jié)構(gòu)圖

2.5 FLF449號菌株的鑒定

該菌的形態(tài)學(xué)特征與其ITS最相近菌屬Parapyenchaeta菌屬特征描述吻合。Parapyenchaeta屬建立于2018年，目前該屬包含2個物種：P.acaciae和P.protearum[22]。

FLF449菌株在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)14天，菌落直徑23 mm；菌落表面為白色到灰色，菌落背部為黃色至白色，有橄欖色的斑塊（如圖3）；菌落呈圓形，扁平及羊毛狀，具有不規(guī)則凹槽，邊緣規(guī)則，有氣生菌絲，分生孢子器呈黑色至深棕色在菌絲內(nèi)，分生孢子橢圓形至圓柱形。劉博洋[23]分離并研究的SGSF130具有以下特征：在PDA培養(yǎng)基上，SGSF130菌落正面灰白色或綠白色，背面深綠色；而分生孢子器為深棕色球形，卵圓形或近圓柱形分生孢子。FLF449和SGSF130相似而又不同，從形態(tài)學(xué)上看它們是同為一個屬的不同真菌。同時，進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生分析（如圖4），F(xiàn)LF449與Parapyenchaeta屬2個已知物種的最為相近，位于它們形成的單系群的基部，獲得了81%的支持率，結(jié)合FLF449號菌株的分生孢子器以及菌落特點(diǎn)，推斷FLF449號菌株可能為Parapyenchaeta屬新物種。

圖3 FLF449菌落形態(tài)（PDA培養(yǎng)基正反面）

3 討論與結(jié)論

前人有關(guān)興安嶺凋落物真菌的研究[8,10,23]，多集中在對其抗菌活性的研究，而本研究在測定抗菌活性的同時，增加了纖維素降解活性的研究，發(fā)現(xiàn)了1株真菌(FLF367)同時具有抗菌與纖維素降解活性。本試驗嘗試分離鑒定2株凋落物真菌FLF409與FLF449的次生代謝產(chǎn)物，共得到2個單體化合物。FLF409最相近菌種為Subulispora biappendiculata，未見有關(guān)該菌種的次生代謝的報道，本研究為首次分離該物種的代謝物。6,9-表氧基-7,22-烯-3-麥角甾醇，該天然產(chǎn)物最初分離于石斛小菇中[24]，也曾在韌革菌(Stereumsp.)和蜜環(huán)菌(Armillaria mellea)的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)該天然產(chǎn)物[25-26]。菌株FLF449最相近菌種是Parapyenchaeta acaciae。Parapyenchaeta屬建立于2018年，目前包含兩個物種。劉博洋[23]也曾在大興安嶺凋落物中分離過Parapyenchaeta屬真菌，說明大興安嶺凋落物中富含該屬真菌，但FLF449在ITS序列及其分生孢子器的形態(tài)上與劉博洋發(fā)現(xiàn)的真菌及兩個該屬已知物種不同，說明FLF449為該屬新發(fā)現(xiàn)菌株。目前未見Parapyenchaeta屬的代謝物的相關(guān)研究。本研究首次研究Parapyenchaeta屬的天然產(chǎn)物，從其發(fā)酵物中分離到聚酮類化合物4,6,8-三羥基-7-甲氧基-3-甲基二氫異香豆素，該化合物首次分離于柱頂孢霉(Scytalidium)屬真菌，被命名為lignicol[27]。同時本研究測試了21株新型真菌的纖維素降解活性，發(fā)現(xiàn)了4株具有纖維素降解活性。本研究發(fā)現(xiàn)Lophiostoma屬、Coleophoma屬、Parapyrenochaeta屬和圓盤屬(Orbilia)有降解纖維素的活性。其中Parapyrenochaeta屬真菌的纖維素降解活性為首次發(fā)現(xiàn)。

本研究共分離得到76株真菌，其中有21株為疑似新菌種。7株有抗菌活性，4株具有纖維素降解活性，共分離得到2個單體化合物。本研究說明大興安嶺凋落物中可培養(yǎng)真菌資源豐富，其中不乏具有活性的可培養(yǎng)真菌，通過進(jìn)一步的研究，有望為真菌資源的開發(fā)利用提供備選菌株。