劉 龍，榮 華，鄭童童，馬俊杰，郭慶元，2

（1新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，烏魯木齊 830052；2新疆農(nóng)林外來入侵有害生物監(jiān)測預警與綜合防控重點實驗室，烏魯木齊 830052）

0 引言

梨為薔薇科(Rosaceae)，蘋果亞科(Pomoideae)，梨屬(PyrusL.)多年生果樹。梨樹是中國種植范圍最廣的果樹之一[1]。梨樹腐爛病菌(Valsa canker of pear)屬于黑腐皮殼屬，主要危害梨樹的主干、主枝和側(cè)枝的樹皮，常造成樹體病疤累累，枝干殘缺不全，甚至造成死樹或毀園[2]。梨樹腐爛病在新疆庫爾勒地區(qū)所有梨園都有發(fā)生，梨樹腐爛病成為影響當?shù)叵憷娈a(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要影響因子[3]。目前在生產(chǎn)實踐中針對梨腐爛病常用化學防治藥劑有苯醚甲環(huán)唑類、25%吡唑醚菌酯、43%戊唑醇、2.12%腐植酸銅水劑、43%戊唑醇[4]，長期使用化學藥劑存在抗藥性、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題，利用具有生物活性代謝物的生防菌對植物進行防治可以替代化學農(nóng)藥，符合綠色農(nóng)業(yè)和可持續(xù)發(fā)展的理念。芽孢桿菌(Bacillussp.)、假單胞菌(Pseudomonassp.)和鏈霉菌(Streptomycessp.)，已被廣泛應用于各種細菌屬的生物防治策略[5]。芽孢桿菌廣泛的分布于根際土壤中，由于芽孢桿菌對不利環(huán)境條件的抗性、對多種病原菌的防治能力以及對植物根系的定殖活性，芽孢桿菌在生物防治方面表現(xiàn)出巨大的潛力，成為國內(nèi)外生防的研究熱點[6-8]，莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)就是其中之一。研究表明，大多數(shù)的莫海威芽孢桿菌都能產(chǎn)生特定的表面活性劑，如脂肽的衍生物，枯草芽孢桿菌非核糖體合成的環(huán)狀脂肽類抗生素，伊枯草菌素以及抗真菌活性的水解酶[9-10]。莫海威芽孢桿菌PS17對小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、厚孢鐮刀菌(Fusarium chlamydosporum)、豌豆殼二孢(Ascochyta pisi)、鏈格孢菌(Alternaria alternate)、菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)、黑附球菌(Epicoccum nigrum)都有抑制效果[12]。因為莫海威芽孢桿菌具有不同拮抗代謝產(chǎn)物譜，可抑制病原菌的種類很廣泛，在生物防治方面擁有很大的潛力。目前暫時沒有莫海威芽孢桿菌在梨腐爛病方面的研究。本試驗將莫海威芽孢菌作為潛力生防菌，通過觀察莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病菌絲的影響，次生代謝產(chǎn)物對梨腐爛病菌生長的影響，了解胞外酶產(chǎn)生情況，對梨樹離體枝條防效測定，初步獲得莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病菌的抗菌機理，明確其對梨腐爛病的預防和治療效果，為該菌在梨腐爛病防治研究及其他病害防治研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試枝條、病原菌和培養(yǎng)基

庫爾勒當?shù)夭烧憷鏄?～2年生健康粗細基本一致枝條。3株香梨腐爛病病原菌(Valsa ceratosperma)由新疆農(nóng)業(yè)大學作物病害研究室從庫爾勒英下鄉(xiāng)，十分場、哈拉玉宮鄉(xiāng)香梨樹中分離并鑒定，代號為PYX-1、PSF-1、PHL-1。莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)由新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術(shù)生物技術(shù)研究所提供。PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基、纖維素培養(yǎng)基、嗜鐵素培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：參考文獻[13]進行配制。

1.2 平板對峙培養(yǎng)

將3株梨腐爛病菌分別接種于PDA培養(yǎng)基中央，在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4天，待病菌鋪滿培養(yǎng)皿后放入4℃冰箱備用。挑取莫海威芽孢桿菌單菌落在LB固體培養(yǎng)基上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1天。利用直徑6 mm的無菌打孔器分別在3株梨腐爛病平板上打孔獲得菌餅，將菌餅放入PDA培養(yǎng)基中央，在距離菌餅中央3 cm四周利用接種環(huán)點接莫海威芽孢桿菌，空白對照組接梨腐爛病并點接無菌水，每個處理3個重復，28℃培養(yǎng)，待空白對照病原菌菌落接觸培養(yǎng)皿邊緣時利用十字交叉法測量菌落直徑，計算病原菌菌落生長抑制率，如式(1)。

1.3 莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病菌絲形態(tài)的影響

在PDA培養(yǎng)基中央放入無菌載玻片，在載玻片上利用移液槍吸取25 mL 50℃左右PDA覆蓋在載玻片上，將6 mm的梨腐爛病菌餅PYX-1放在載玻片中央，在載玻片四周邊緣放6 mm莫海威芽孢桿菌菌餅，空白對照不放莫海威芽孢桿菌菌餅，每處理3個重復。培養(yǎng)2天觀察菌絲形態(tài)。

1.4 莫海威芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物對梨腐爛病菌的抑制效果

1.4.1 無菌發(fā)酵液的抑菌性 接種莫海威芽孢桿菌于LB培養(yǎng)液中，利用恒溫搖床180 r/min，30℃培養(yǎng)36 h，菌液OD600為1.5，將菌液于12000 r/min，離心15 min，收集上清液并用0.22 μm微孔濾膜過濾，4℃冰箱保存待用。將無菌發(fā)酵液與PDA按10%，15%、25%、30%、40%配制，空白對照用液體LB代替濾液，將3株梨腐爛病6 mm菌餅分別放于不同濃度培養(yǎng)基中央，每個處理4個重復，28℃培養(yǎng)3天，利用十字交叉法測量菌落直徑，計算病原菌菌落生長抑制率，如式(1)。

1.4.2 揮發(fā)性產(chǎn)物抑菌作用 參考文獻[13]使用雙板法進行測定。將3株6 mm梨腐爛病菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，在另一個相同大小的LB培養(yǎng)基上劃線接種莫海威芽孢桿菌，將兩者對扣在一起，用封口膜將接觸處密封，以未接種莫海威芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基作為空白對照，每處理3個重復，28℃培養(yǎng)3天，待對照培養(yǎng)基菌絲鋪滿培養(yǎng)皿時，分別測量劃線接種莫海威芽孢桿菌和對照培養(yǎng)梨腐爛病菌落的直徑，計算菌落相對抑制率。

1.5 莫海威芽孢桿菌胞外酶產(chǎn)生情況

將莫海威芽孢桿菌點接到蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基、纖維素酶培養(yǎng)基，幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3天后觀察培養(yǎng)基是否透明或者有無透明圈，每個處理5個重復。

1.6 離體枝條測定莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病的防效

1.6.1 實驗用菌的制備 將莫海威芽孢桿菌挑入無菌蒸餾水中，濃度調(diào)至OD600為0.5（菌體濃度約109CFU/mL）作為接種液。梨腐爛病菌PYX-1接種于PDA平板上活化備用。

1.6.2 室內(nèi)預防性效果測定 香梨離體枝接種方法主要參考劉坤及古麗孜熱[14-15]的方法進行并略作調(diào)整。將采摘的枝條截成25 cm長，用水清洗干凈，在75%酒精中浸泡1 min后沖洗干凈，重復3次，晾干后利用固體石蠟兩端封口減少水分損失。在枝條中間位置用打孔器(Ф=6 mm)打孔，取約1 cm2滅菌脫脂棉蘸取細菌菌液貼在傷口部位，用保鮮膜固定保濕，48 h后取下，以無菌水接種為對照。在24 h后接種活化好的梨腐爛病菌菌餅(Ф=6 mm)PYX-1，每處理15個重復。將離體枝條放入鋪有紗布的鐵托盤中，滴入無菌水剛好浸透紗布，盤口覆蓋保鮮膜保濕，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，記錄梨腐爛病接種第4天與第7天發(fā)病率及病斑面積，發(fā)病初期病斑為橢圓斑時按式(2)，發(fā)病中后期病斑為非橢圓斑時按式(3)測量病斑面積，計算防治效果[式(4)]。后續(xù)觀察離體枝產(chǎn)分生孢子角情況。

1.6.3 室內(nèi)治療性效果測定 接種方式與預防性效果接種方法一致。接種順序相反，即在中間位置打孔處先接種梨腐爛病，待枝條有明顯發(fā)病癥狀后再接種莫海威芽孢桿菌，以接種無菌水為對照，每處理15個重復。記錄枝條接種莫海威芽孢桿菌后第3天與第7天病斑長度并計算病斑面積。后續(xù)觀察離體枝產(chǎn)分生孢子角情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病的拮抗作用

莫海威芽孢桿菌可較強的抑制梨腐爛病菌落的擴展，培養(yǎng)4天后，莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病菌絲有強烈的抑制效果，菌絲抑制率為68%。如圖1所示。

圖1 莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病菌的抑菌效果

通過光學顯微鏡可以觀察到，正常生長梨腐爛病菌落邊緣菌絲量少，看著很稀疏，菌絲呈線性平滑生長。受到莫海威芽孢桿菌抑制的菌落邊緣菌絲量大，發(fā)出分支較多，看上去較致密，菌絲扭曲，生長明顯受到抑制。如圖2所示。

圖2 莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病菌絲的影響

2.2 莫海威芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物對梨腐爛病的抑制作用

莫海威芽孢桿菌無菌發(fā)酵濾液對梨腐爛病菌絲生長有明顯的抑制效果，隨著濾液濃度的增加，菌絲生長被抑制的越明顯，如圖3所示。

圖3 不同濃度無菌發(fā)酵液對梨腐爛病菌的抑制作用

當莫海威芽孢桿菌的無菌發(fā)酵濾液與培養(yǎng)基混合濃度達到40%時，梨腐爛病菌菌絲的生長完全被抑制，見表1。抑菌回歸方程見表2。

表1 濾液對菌絲生長抑制結(jié)果

表2 菌絲生長抑制試驗

通過雙板法實驗，表明莫海威芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)對梨腐爛病菌具有抑制效果（圖4），3株菌株菌絲平均相對抑制率為22.6%。

圖4 莫海威芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)對梨腐爛病菌菌落的影響

2.3 基于莫海威芽孢桿菌拮抗代謝產(chǎn)物種類測定的抗菌機理初步分析

通過平板檢測拮抗代謝產(chǎn)物結(jié)果顯示：莫海威芽孢桿菌可以分解蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素并具有結(jié)合Fe3+的能力，但是不能分解幾丁質(zhì)。初步表明莫海威芽孢桿菌可以產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和嗜鐵素（如圖5所示），不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。所產(chǎn)生的這些酶類都是生防相關(guān)酶類物質(zhì)，可抑制病原菌的生長。嗜鐵素可與Fe3+結(jié)合，與病原微生物競爭從而達到抑制病原菌生長的目的[16-17]。

圖5 莫海威芽孢桿菌拮抗代謝產(chǎn)物檢測結(jié)果

2.4 莫海威芽孢桿菌對離體枝條防效測定結(jié)果

通過預防性試驗發(fā)現(xiàn)，接種莫海威芽孢桿菌6天，接種梨腐爛病3天，2/3離體枝條發(fā)病且病斑面積較小，CK離體枝條基本都發(fā)病。莫海威芽孢桿菌接種7天，腐爛病菌接種4天離體枝條與CK離體枝條全部發(fā)病，接種梨腐爛病菌4天的防效為52%，接種梨腐爛病菌7天的防效為41.7%，見表3。在接種梨腐爛病第16天，預防枝條與CK枝條基本都產(chǎn)生了分生孢子角。

表3 離體枝實驗中莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病預防效果

治療性試驗結(jié)果表明，莫海威芽孢桿菌接種3天的防效為49%，接種7天的防效為44.6%，莫海威芽孢桿菌對已經(jīng)被梨腐爛病危害的枝條有一定的治療效果，見表4。在接種梨腐爛病第16天，CK枝條未產(chǎn)生分生孢子角，治療枝條80%都產(chǎn)生了分生孢子角，如圖6。

圖6 治療離體枝條產(chǎn)分生孢子角情況

表4 離體枝實驗中莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病治療效果

3 結(jié)論與討論

新疆冬季寒冷，梨樹受凍后易發(fā)生腐爛病[18]，且目前對于梨腐爛病無單一防效顯著的化學藥劑，無明顯癥狀卻攜帶梨腐爛病菌[19]，這對防治梨腐爛病加大了難度,大量使用化學藥劑對其進行防治，不符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和環(huán)保安全的理念。利用自然界中的有益微生物防治植物病害具有無毒、無害、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點[20]。芽孢桿菌屬是目前研究最廣泛的生防劑之一，可作為植物根際細菌生長促進劑，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中作為商品化殺菌劑和生防劑具有很大潛力[21-22]。

目前已報道梨腐爛病生防拮抗菌有芽孢桿菌(Bacillusspp.)，貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)，多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)等，而未有莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)對梨腐爛病防治的相關(guān)報道。劉坤[14]研究的多黏類芽孢桿菌無菌發(fā)酵液對梨腐爛病菌絲抑制EC50(v/v)為0.2156，而本試驗EC50(v/v)為0.166，無菌發(fā)酵液的抑菌效果比其好很多。古麗孜熱[15]研究的貝萊斯芽孢桿菌對梨腐爛病離體枝的保護性與治療性防效分別為77.71%和66.71%，本試驗保護性與治療性防效分別為41.7%和44.6%，影響結(jié)果的原因是古麗孜熱所用的接種液是發(fā)酵液，發(fā)酵液中不僅含有生防菌還含有已產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)以及培養(yǎng)基成分，而本試驗所用的接種液中僅含有生防菌?，F(xiàn)有大量芽孢桿菌產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌的報道，宗英[23]研究貝萊斯芽孢桿菌可產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)，禾烷酮、2-壬酮和2-壬醇抑制禾谷鐮刀菌生長,抑制率為27.7%。GOTOR-VILA等[24]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)（1,3-戊二烯、3-羥基-2-丁酮和噻吩）對采摘后櫻桃3種病害病原菌Monilinia laxa、M.fructicola和Botrytis cinera具有較好的抑制作用。本試驗莫海威芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對梨腐爛病菌絲抑制率為22.6%，但具體物質(zhì)還需后續(xù)研究。在本試驗中，治療離體枝條第16天未產(chǎn)生分生孢子角，而對照80%枝條都產(chǎn)生了分生孢子角，說明莫海威芽孢桿菌可以減緩梨腐爛病的傳播，不足之處未記錄治療離體枝條產(chǎn)生分生孢子角時間。試驗結(jié)果表明，莫海威芽孢桿菌可以產(chǎn)蛋白酶，淀粉酶，纖維素酶以及嗜鐵素生防因子，對生防其他病原菌具有借鑒意義。由于梨樹腐爛病菌的細胞壁成分主要為幾丁質(zhì)[25]，幾丁質(zhì)酶對治療梨樹腐爛病至關(guān)重要，試驗中發(fā)現(xiàn)莫海威芽孢桿菌不能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，這與DIABANKANA等[12]的試驗結(jié)果一致，但其實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)莫海威芽孢桿菌產(chǎn)糖苷水解酶家族18蛋白和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，這些是參與幾丁質(zhì)降解的酶，所以莫海威芽孢桿菌在治療梨腐爛病上具有一定的潛力。通過試驗表明莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病菌的抑制因子主要來源于代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已報道多種生防菌對梨腐爛病菌有拮抗作用，建議今后可以將多種生防菌混合搭配進行防治，探索對梨腐爛病最佳生防效果。

莫海威芽孢桿菌對梨腐爛病保護性與治療性防效分別為41.7%和44.6%，具有一定的生防潛力，但最大發(fā)揮其功效需要其具有很強的抗逆能力，可以在植物組織上大量繁殖及定殖存活，后期還需對莫海威芽孢桿菌在田間梨樹上的繁殖及定殖存活能力進行研究，并通過大田試驗進一步驗證其防治效果。