歐陽(yáng)晨捷 周東華 劉小燕 陳瑩 平靜 葛娟 潘育

目前宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的第二大疾病，其中以宮頸鱗狀細(xì)胞癌為最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型。我國(guó)每年新增宮頸癌人數(shù)約9.89 萬(wàn)，占世界宮頸癌總?cè)藬?shù)的17.4%，每年死亡的人數(shù)達(dá)到3.05萬(wàn)，有發(fā)病率不斷上升及發(fā)病年齡日趨年輕化的跡象[1]。因此，提高宮頸癌的診治水平十分緊迫。人乳頭瘤病毒（HPV）已被證實(shí)是宮頸癌的首要致病因素[2]，從感染到進(jìn)展為癌需要8～10年。對(duì)宮頸上皮內(nèi)病變（CIN）的患者早診斷、早治療以及系統(tǒng)隨訪是降低宮頸癌發(fā)病的關(guān)鍵。但不是所有感染高危型HPV的女性都會(huì)發(fā)生CIN或?qū)m頸癌，說(shuō)明在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中，還有除了病毒以外的因素發(fā)揮致病作用。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)Cathepsin D參與了多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[3，4]，是一類(lèi)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的酶。但是，Cathepsin D在宮頸鱗癌中的表達(dá)情況鮮有報(bào)道。本研究旨在探討Cathepsin D在不同宮頸病變中的表達(dá)情況，分析其與高危型HPV感染的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集我院病理科2018年1月～2020年8月期間確診的40例子宮頸鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除的患者組織標(biāo)本（宮頸癌組）和58例CIN經(jīng)陰道鏡活檢、宮頸錐切及子宮全切術(shù)標(biāo)本（CIN組）；同時(shí)選取同期因子宮肌瘤和（或）子宮腺肌癥行子宮全切術(shù)的住院患者，術(shù)前常規(guī)行宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查，未見(jiàn)異常，并通過(guò)病理證實(shí)為慢性宮頸炎（等同于本實(shí)驗(yàn)的正常宮頸組織）標(biāo)本28例（對(duì)照組）。其中CINⅠ21例，CINⅡ18例，CINⅢ19例?；颊吣挲g28～65歲，中位年齡45歲。所有患者在取材前都未做過(guò)任何特殊治療，也無(wú)特殊疾病史。

鼠抗人單克隆抗體Cathepsin D（D-7）:sc-377299購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC。免疫組織化學(xué)Power Vision二步法試劑盒（PV-9 000）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，二抗DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Cobas 4800 HPV DNA檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自羅氏診斷公司。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法 組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水后，用0.01mol/L的枸櫞酸緩沖液高壓修復(fù)10min,冷卻到室溫后，PBS沖洗3次，每次3min；3% H2O2室溫孵育10min，PBS沖 洗3次，每 次5min；滴加稀釋濃度為1：50的Cathepsin D一抗后，按Power Vision二步法免疫組織化學(xué)試劑盒（PV-9000）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，二抗孵育30min后，DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，脫水，透明，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。以Cathepsin D抗體試劑盒說(shuō)明的涎腺組織作為陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本，同時(shí)采用PBS液取代一抗作為陰性對(duì)照標(biāo)本。

1.3 高危型 HPV 檢測(cè) 基于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的Cobas 4800 HPV DNA檢測(cè)系統(tǒng)可檢測(cè)14種HPV高危亞型，即HPV16型、18型和其他12種高危HPV亞型匯總的結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定 Cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)主要為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，但要考慮到著色的強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。本實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)分值累加的系統(tǒng)：①按著色強(qiáng)度打分：無(wú)著色0分，淡黃色顆粒1分，棕黃色顆粒2分，棕褐色顆粒3分；②在目鏡視場(chǎng)數(shù)為22的200倍顯微鏡下，隨機(jī)看5個(gè)視野，取平均值，按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例打分：＜1%計(jì)為0分，1%～10%計(jì)為1分，10%＜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤50%計(jì)為2分，50%＜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤80%計(jì)為3分，＞80%計(jì)為4分。將①、②兩項(xiàng)分值相加為免疫組化最終評(píng)分，陰性：0～1分，陽(yáng)性：2～7分。全部實(shí)驗(yàn)對(duì)象的免疫組織化學(xué)染色切片由兩位病理醫(yī)師一致性雙盲觀察診斷。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。兩組變量間的相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cathepsin D在對(duì)照組、CIN 組和宮頸癌組中的表達(dá) Cathepsin D在各組宮頸組織中的表達(dá)水平不同，在對(duì)照組、CIN 組、宮頸癌組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為14.3%（4/28）、79.3%（46/58）、95.0%（38/40），各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=55.518，P＜0.01）。宮頸病變逐漸加重，隨著Cathepsin D的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，與宮頸病變程度呈正相關(guān)（r=0.608，P＜0.01）。見(jiàn)圖1～5。

圖1 Cathepsin D在正常子宮頸組織中的表達(dá)

圖2 Cathepsin D在CINⅠ中的表達(dá)

圖3 Cathepsin D在CINⅡ中的表達(dá)

圖4 Cathepsin D在CINⅢ中的表達(dá)

圖5 Cathepsin D在宮頸鱗癌中的表達(dá)

2.2 Cathepsin D在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組 內(nèi)的表達(dá)在CIN組內(nèi)，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ中Cathepsin D的陽(yáng)性表達(dá)率分別為61.9%（13/21）、83.3%（15/18）、94.7%（18/19），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.810，P＜0.05）。

2.3 Cathepsin D在正常對(duì)照組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組及宮頸癌組各組之間的比較 CIN組Cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 32.807，P＜0.01），宮頸癌組Cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 45.437，P＜0.05），宮頸癌組Cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)率高于CIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 4.759，P＜0.05）。CINⅠ組和CINⅡ組（χ2= 2.198，P＞0.05）、CINⅡ組和CINⅢ組（χ2= 1.247，P＞0.05）以及CINⅢ組和宮頸癌組（χ2= 0.002，P＞0.05）之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在CINⅠ組和CINⅢ組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 6.166，P＜0.05）。

2.4 Cathepsin D和高危型HPV在宮頸病變組織中的相關(guān)性分析 通過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)分析提示，在不同程度宮頸病變中，Cathepsin D的表達(dá)與高危型HPV的感染呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 Cathepsin D和高危型HPV的相關(guān)性分析（n）

3 討論

宮頸鱗癌的發(fā)病是一個(gè)從組織非典型增生到原位癌再到浸潤(rùn)癌循序漸進(jìn)的過(guò)程。發(fā)現(xiàn)高危型HPV病毒與宮頸癌發(fā)生有直接關(guān)系。在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，E6、E7基因過(guò)度表達(dá)讓病毒基因整合，使宿主細(xì)胞的腫瘤抑制蛋白P53、Rb失活[5]。無(wú)疑持續(xù)的高危型HPV感染是導(dǎo)致CIN及宮頸癌的首要因素。但感染高危型HPV并不完全造成必然發(fā)生宮頸癌，還需要其他方法的適當(dāng)介入來(lái)提高宮頸癌篩查的準(zhǔn)確率。近年來(lái)，研究者們發(fā)現(xiàn)Cathepsins（組織蛋白酶）作為人體中重要的信號(hào)分子，有序地調(diào)節(jié)著人體的生命過(guò)程；一旦失調(diào)，會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。根據(jù)氨基酸活化部位的不同，Cathepsins家族有11個(gè)成員，分布于各種哺乳動(dòng)物組織的細(xì)胞溶酶體內(nèi)，是一組強(qiáng)效的溶酶體水解酶，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。Cathepsin D是Cathepsins家族中的一員，是一種天冬氨酸溶酶體蛋白水解酶。在腫瘤的酸性微環(huán)境中，Cathepsin D的高表達(dá)可作為一種絲裂原會(huì)引起有絲分裂時(shí)，有絲分裂原底物的調(diào)控失常，引起細(xì)胞分化的缺乏，并且刺激細(xì)胞不斷迅速分裂、生長(zhǎng)，引起克隆性無(wú)限增殖[7]。本研究發(fā)現(xiàn)Cathepsin D在CIN和宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常宮頸組織（P＜0.05），在宮頸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率高于CIN組織（P＜0.05），在CINⅢ組織的陽(yáng)性表達(dá)率高于CINⅠ組織（P＜0.05），Cathepsin D的陽(yáng)性表達(dá)率與宮頸病變程度呈正相關(guān)（r=0.608，P＜0.05），符合宮頸鱗癌的進(jìn)展過(guò)程，可提示Cathepsin D的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了宮頸鱗癌的發(fā)生與發(fā)展。Cathepsin D一方面通過(guò)水解作用使細(xì)胞外基質(zhì)降解，讓腫瘤細(xì)胞順利快速轉(zhuǎn)移；另一方面通過(guò)使Cathepsin B、尿激酶原激活因子激活，并與尿激酶原激活因子受體結(jié)合，參與與腫瘤相關(guān)的分解作用[8]。Cathepsin D的過(guò)度表達(dá)還可激活溶酶體靶通道，讓Cathepsin D蛋白酶原及其它溶酶體酶不斷分泌和釋放[9]，促進(jìn)了周?chē)植咳芙鈪^(qū)域的形成，為腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移提供了通道，進(jìn)而激發(fā)了腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的潛能。通過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，在不同程度宮頸病變中，Cathepsin D的表達(dá)與高危型HPV的感染呈正相關(guān)（r=0.242，P=0.006），提示Cathepsin D表達(dá)上調(diào)和高危型HPV感染在宮頸癌的發(fā)病機(jī)制中可能起著協(xié)同作用。

綜上所述，Cathepsin D在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表達(dá)逐漸升高，說(shuō)明Cathepsin D在宮頸癌的發(fā)病機(jī)制中起到了一定的促進(jìn)作用，可能參與宮頸鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。Cathepsin D的高表達(dá)和高危型HPV的感染在宮頸病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著密切的聯(lián)系，兩者在宮頸癌的發(fā)病機(jī)制中可能起著協(xié)同作用，為宮頸癌發(fā)病機(jī)制和治療的研究提供了新思路，但這一推測(cè)需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。