丁 波，李國(guó)強(qiáng)，許 曼，陳 冉

（安徽省婦幼保健院，安徽 合肥 230001）

桔梗為桔?？浦参锝酃latycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC. 的干燥根，性平，味苦、辛，歸肺經(jīng)，有宣肺、利咽、祛痰、排膿之功效，應(yīng)用于祛痰止咳［1］。其主產(chǎn)于華北、東北、華中、華東及西南地區(qū)，資源分布廣泛，地域差異大，有效成分含量差異大，且市場(chǎng)上出現(xiàn)了桔?？粕硡⒒蚴窨剖竦榷喾N桔梗偽品［2］。采用單一方法鑒別存在耗時(shí)、耗試藥、操作煩瑣等問(wèn)題，如通常采用的色譜法和光譜法等均需對(duì)藥材進(jìn)行預(yù)處理。紅外光譜法具有高度的專屬性和特征性，為快速鑒別中藥材和分析化學(xué)結(jié)構(gòu)的有效手段［3］。多維共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列法在分析大樣本量時(shí)，可通過(guò)多維空間考察不同中藥樣品間的相互關(guān)系，并用數(shù)量精確表示該關(guān)系，克服了一般分析方法需要大量樣本的缺點(diǎn)，可區(qū)別2 個(gè)及以上的樣本［4］。本研究中采用溴化鉀壓片法制備桔梗樣品，采用紅外光譜法建立了不同產(chǎn)地桔梗樣品的紅外光譜指紋圖譜，并結(jié)合多維共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列法對(duì)桔梗樣品進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分和質(zhì)量評(píng)價(jià)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

A. 桔梗皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品 B. 桔梗樣品圖1 桔梗樣品與桔梗皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品紅外光譜圖A.Standard samples of platycodin D B.Platycodonis Radix samplesFig.1 IR spectrograms of Platycodonis Radix samples and standard samples of platycodin D

A. 產(chǎn)地A B. 產(chǎn)地B C. 產(chǎn)地C D. 產(chǎn)地D E. 產(chǎn)地E F. 產(chǎn)地F G. 產(chǎn)地G圖3 不同產(chǎn)地桔梗樣品紅外光譜圖A.Produce area A B.Produce area B C.Produce area C D.Produce area D E.Produce area E F.Produce area F G.Produce area GFig.3 IR spectrograms of Platycodonis Radix samples from different produce areas

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Nicolet Avatar FTIR370 型傅里葉紅外變換色譜儀（美國(guó)尼高力公司），配有氘代三甘氨酸硫酸酯檢測(cè)器；YB - 300A 型超細(xì)粉碎機(jī)（永康速鋒工貿(mào)有限公司）；PL601-S型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為千分之一）。

1.2 試藥

桔梗皂苷D 標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為P27A11F122502，純度不低于98%）；溴化鉀（分析純，上海邁坤化工有限公司，批號(hào)為20200313）。2 年生桔梗，產(chǎn)地分別為陜西郭興莊村（A）、安徽亳州（B）、安徽李興鎮(zhèn)尹寨村（C）、湖南（D）、安徽太和縣謝千村謝千莊（E）、河南黃土樓村（F）、浙江永興西街（G），采集時(shí)間2019 年10 月，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)提供，并經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為正品，藥材標(biāo)本存放于安徽省婦幼保健院藥劑科。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅外光譜分析

2.1.1 紅外光譜參數(shù)

光譜范圍：4 000～400 cm-1；分辨率：4 cm-1；掃描次數(shù)：32次。掃描時(shí)實(shí)時(shí)扣除H2O和CO2的干擾。

2.1.2 樣品制備

分別取各產(chǎn)地桔梗藥材，置60 ℃溫度條件下干燥至恒重，粉碎，過(guò)9 號(hào)篩，桔梗藥材粉末與溴化鉀以1∶100（m/m）比例在紅外光燈下混合、研磨，均勻放入壓片模具內(nèi)壓片，即得桔梗樣品。

2.1.3 方法學(xué)考察

重復(fù)性試驗(yàn)：取桔梗藥材（產(chǎn)地為A）粉末6 份，按

2.1.2 項(xiàng)下方法制備桔梗樣品，按2.1.1 項(xiàng)下紅外光譜參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，記錄紅外光譜圖，并計(jì)算光譜圖中共有峰波數(shù)的RSD。結(jié)果的RSD= 0.92%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取桔梗藥材（產(chǎn)地為A）粉末，按

2.1.2 項(xiàng)下方法制備桔梗樣品，分別于壓片后2，4，6，8，10，12 h時(shí)按2.1.1項(xiàng)下紅外光譜參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，記錄紅外光譜圖，并計(jì)算光譜圖中共有峰波數(shù)的RSD。結(jié)果的RSD=0.84%（n=6），表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 紅外光譜分析

桔梗樣品與桔梗皂苷D 標(biāo)準(zhǔn)品：2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》記載桔梗皂苷D 為桔梗的主要活性成分。其紅外光譜圖見(jiàn)圖1 A，主要特征吸收峰在1 729，1 646，1 362，1 220，1 026 cm-1波數(shù)處，其中1 729～1 650 cm-1波數(shù)處吸收峰為多種物質(zhì)的疊加峰，主要為水中O—H 的彎曲振動(dòng)、共軛羰基C＝O 的伸縮振動(dòng)及芳香環(huán)骨架的振動(dòng)［5-6］，1 729 cm-1波數(shù)附近出現(xiàn)的酯類羰基吸收峰為桔梗三萜皂苷類特征峰［7］；1 362 cm-1波數(shù)為C—H 的彎曲振動(dòng)，1 026 cm-1波數(shù)為C—O 的伸縮振動(dòng)［8］。桔梗樣品基本上保留桔梗皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品的特征吸收峰，光譜圖見(jiàn)圖1 B。

不同產(chǎn)地的桔梗樣品：分別將7個(gè)產(chǎn)地的桔梗藥材按2.1.2 項(xiàng)下方法處理，按2.1.1 項(xiàng)下紅外光譜參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，不同產(chǎn)地桔梗樣品紅外光譜疊加指紋圖譜見(jiàn)圖2。由圖3 可知，7 個(gè)產(chǎn)地桔梗樣品的紅外光譜圖基本相似，其特征吸收峰在3 280，2 929，1 740，1 635，1 419，1 034，670，525 cm-1波數(shù)附近。其中，3 280 cm-1波數(shù)處為多糖類、苷類、糖醇類等化合物中羥基O—H 的伸縮振動(dòng)［9］；2 929 cm-1波數(shù)處為亞甲基C—H 反對(duì)稱的伸縮振動(dòng)［10］；1 740 cm-1波數(shù)附近出現(xiàn)的酯類羰基吸收峰為桔梗三萜皂苷類化合物的特征峰［11］；1 635 cm-1波數(shù)附近為多酚、多糖、蛋白質(zhì)中C＝O 的伸縮振動(dòng)；1 419 cm-1波數(shù)附近可能是C—H的彎曲振動(dòng)；1 034 cm-1波數(shù)及其兩側(cè)肩峰為多個(gè)峰重疊而成的寬強(qiáng)峰，歸屬為多糖、苷類化合物中C—O 的彎曲振動(dòng)；950 cm-1波數(shù)以下為糖環(huán)骨架的振動(dòng)，670 cm-1和525 cm-1波數(shù)處為芳環(huán)（雜環(huán)）分子的骨架振動(dòng)和變角振動(dòng)，與桔梗中菊糖有關(guān)［11］。可見(jiàn)，桔梗中含有多糖及甾體皂苷類等化合物，且不同產(chǎn)地的桔梗樣品之間化學(xué)成分具有一定相似性。但不同產(chǎn)地桔梗樣品于1 740，1 635，1 419，1 034 cm-1波數(shù)附近吸收峰的位置、數(shù)目和強(qiáng)度存在一定差異，如產(chǎn)地B、產(chǎn)地E、產(chǎn)地F 的桔梗樣品相較于其他產(chǎn)地在1 740 cm-1波數(shù)處強(qiáng)度明顯，且產(chǎn)地B和產(chǎn)地E的桔梗樣品峰位置偏移46個(gè)波數(shù)；產(chǎn)地B、產(chǎn)地C、產(chǎn)地D的桔梗樣品在1 034 cm-1波數(shù)分別偏移了24 個(gè)、35 個(gè)、54 個(gè)波數(shù)，表明不同產(chǎn)地桔梗樣品的化合物成分和含量存在一定差異。故可根據(jù)特征吸收峰初步判斷桔梗的整體化學(xué)成分和產(chǎn)地。

圖2 不同產(chǎn)地桔梗樣品紅外光譜疊加指紋圖譜Tab.2 IR spectrograms superimposed fingerprints of Platycodonis Radix samples from different produce areas

2.2 共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析

2.2.1 雙指標(biāo)序列分析

雙指標(biāo)序列是指通過(guò)計(jì)算指紋圖譜共有峰率和變異峰率，根據(jù)共有峰率的大小排成的一個(gè)序列（包含共有峰率和變異峰率）。其中，共有峰率表示樣品之間的相似性，變異峰率表示差異性［12-13］。共有峰率大表明樣品差異小，變異峰率大表明樣品差異大。

共有峰率計(jì)算公式見(jiàn)公式（1）。

式中，P為共有峰率，Ng為共有峰數(shù)，Nd為獨(dú)立峰數(shù)。

Nd計(jì)算公式見(jiàn)公式（2）。

式中，Nd為相互比較的2個(gè)紅外光譜圖中的獨(dú)立峰總數(shù)，Na為紅外光譜指紋圖譜a中相對(duì)于其共有峰的非共有峰數(shù)，Nb為紅外光譜圖b中相對(duì)于共有峰的非共有峰數(shù)。

變異峰率計(jì)算公式見(jiàn)公式（3）。

式中，Pva（b）為變異峰率，Na（b）為紅外光譜圖中a（b）的總峰數(shù)。

2.2.2 共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析

根據(jù)公式計(jì)算7 個(gè)產(chǎn)地桔梗樣品之間紅外光譜圖的共有峰率和變異峰率，建立不同產(chǎn)地桔梗的雙指標(biāo)序列。可在2+n維（n為樣品數(shù)）空間中量化各個(gè)樣品的異同，具有較強(qiáng)的鑒別力，進(jìn)行相似性分析。如產(chǎn)地A：DE（63.6%；42.9%，14.3%）表明該序列以產(chǎn)地A 為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算產(chǎn)地B～G 樣品紅外光譜圖的共有峰率和變異峰率，表明產(chǎn)地A與產(chǎn)地DE的共有峰率為63.6%，其中產(chǎn)地A 變異峰率為42.9%，產(chǎn)地DE 變異峰率為14.3%。7 個(gè)產(chǎn)地桔梗樣品紅外光譜圖共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地桔梗樣品的共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析結(jié)果（%）Tab.1 Results of dual-index sequence analytical of common and variant peak ratio of Platycodonis Radix samples from different produce areas（%）

任一樣品與其他樣品有相同的共有峰率時(shí)，多數(shù)情況下變異峰不同，少數(shù)相同。如產(chǎn)地A：CD（50.0%；66.7%，33.3%），表明產(chǎn)地C 和產(chǎn)地D 相對(duì)于產(chǎn)地A 具有相同的共有峰率50%，但變異峰率不同，分別為66.7%和33.3%，可明顯區(qū)分產(chǎn)地C 和產(chǎn)地D。但產(chǎn)地C：DF（60.0%；33.3%，33.3%）序列中，產(chǎn)地D 和產(chǎn)地F相對(duì)于產(chǎn)地C具有相同的共有峰率和變異峰率，表明產(chǎn)地D 和產(chǎn)地F 相對(duì)于產(chǎn)地C 非常相似。因此，雙指標(biāo)序列分析可從共性和變異性進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地桔梗的相似性和差異性。

2.2.3 基本關(guān)系組、對(duì)及分析

由表1 可知，產(chǎn)地C：E（100%；0，0）序列中，產(chǎn)地C、產(chǎn)地E 共有峰率為100%，變異峰率為0，分別對(duì)應(yīng)安徽李興鎮(zhèn)尹寨村和安徽太和縣謝千村謝千莊，地理位置接近，氣候條件與生長(zhǎng)環(huán)境相似，藥材質(zhì)量相似度高；產(chǎn)地B 與產(chǎn)地C、產(chǎn)地G、產(chǎn)地E 的共有峰率均大于80%，表明產(chǎn)地B 與產(chǎn)地C、產(chǎn)地G、產(chǎn)地E 桔梗樣品含有相似的主要特征峰，化學(xué)成分很接近，對(duì)應(yīng)產(chǎn)地分別為安徽亳州、安徽李興鎮(zhèn)尹寨村、浙江永興西街和安徽太和縣謝千村謝千莊，產(chǎn)地地理位置相對(duì)接近，氣候與自然條件相似；產(chǎn)地A 與其他產(chǎn)地的共有峰率為46.2%～63.6%，變異峰率大，整體相似度低，表明陜西與安徽、浙江、湖南桔梗的化學(xué)成分差異大，地理經(jīng)度跨度大，具有明顯的地域差異?？梢?jiàn)，產(chǎn)地接近、自然生長(zhǎng)環(huán)境類似的桔梗間共有峰率高，反之則變異峰率高，可反映實(shí)際情況，說(shuō)明該質(zhì)量控制方法可指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

3 討論

紅外光譜可用于定性鑒別和結(jié)構(gòu)分析，且不需要進(jìn)行樣品前處理，具有無(wú)損、快捷等優(yōu)點(diǎn)，可用于不同產(chǎn)地桔梗的鑒別。多維共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列法可建立不同樣品間最直接的相似性聯(lián)系［14-15］，與單指標(biāo)分析法相比，雙指標(biāo)指紋圖譜分析法具有較高的分辨率。如產(chǎn)地C：G（70.0%；14.9%，28.6%），產(chǎn)地G：CDEF（70.0%；28.6%，14.3%）中，產(chǎn)地C與產(chǎn)地G具有相同的共有峰率，而變異峰率不同，可更好地區(qū)分不同產(chǎn)地的桔梗樣品。

本研究中構(gòu)建了7個(gè)產(chǎn)地桔梗樣品的紅外光譜指紋圖譜，通過(guò)多維共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列法對(duì)不同產(chǎn)地的桔梗樣品進(jìn)行鑒別分析及質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果不同產(chǎn)地桔梗樣品的紅外光譜圖基本相似，部分特征吸收峰的位置、數(shù)目和強(qiáng)度存在一定差異，表明不同產(chǎn)地桔梗整體上具有相似性，但其化合物成分和含量仍存在一定差異。產(chǎn)地接近的共有峰率大，變異峰率小，如安徽李興鎮(zhèn)尹寨村與太和縣謝千村謝千莊、湖南、河南黃土樓村的桔梗藥材來(lái)源接近，其變異峰率相差較小，而陜西與其他產(chǎn)地的共有峰率相差最大。由此推測(cè)不同產(chǎn)地桔梗藥材的化學(xué)成分及其含量受當(dāng)?shù)販囟?、光照、土壤、水文等生態(tài)環(huán)境影響，與司雨柔等［11］的研究結(jié)果一致。

綜上所述，紅外光譜技術(shù)結(jié)合多維共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列法可準(zhǔn)確、直觀地鑒別不同產(chǎn)地的桔梗，為不同中藥產(chǎn)地的鑒定提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為鑒別中藥的真?zhèn)渭捌焚|(zhì)提供了新思路。